孫迎春,程 卉,楊積慧

(1安慶市食品藥品檢驗(yàn)中心,安慶 246001;2安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院;*通訊作者,E-mail:xuanqi2009@126.com)

脈君安片由中藥材鉤藤(1 470 g)、葛根(549 g)和西藥氫氯噻嗪(1.5 g)組成,按處方劑量將中藥材簡(jiǎn)單粉碎、部分浸提,再與氫氯噻嗪混合,制成顆粒,壓制成1 000片,包糖衣即得,具有平肝熄風(fēng)、解痙止痛之功效,臨床用于高血壓癥、頭痛眩暈、頸項(xiàng)強(qiáng)痛、失眠心悸、冠心病的治療[1]。方中鉤藤用量較大,具有息風(fēng)定驚、清熱平肝的作用[2]。鉤藤的主要藥效成分為生物堿類(lèi)[3,4],主要作用于心血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng),具有降低血壓、擴(kuò)張血管、減慢心率和抑制心肌收縮力等多種功效,以鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿和異去氫鉤藤堿為代表的單萜吲哚類(lèi)生物堿是鉤藤的主要活性成分[5-8]。葛根具有解肌退熱、生津止渴、透疹、升陽(yáng)止瀉等功效,其主要活性成分葛根素具有擴(kuò)張血管、降血壓、降血糖、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力等作用,尤其在改善心腦血管疾病方面應(yīng)用廣泛[9,10]。氫氯噻嗪為中效利尿藥,研究表明,葛根素、鉤藤堿與氫氯噻嗪合用能增強(qiáng)氫氯噻嗪體內(nèi)吸收的效果[11]。現(xiàn)行脈君安片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]僅有化學(xué)鑒別和對(duì)氫氯噻嗪的薄層鑒別,無(wú)含量測(cè)定項(xiàng),文獻(xiàn)[12,13]僅以葛根素或氫氯噻嗪一種成分作為指標(biāo),均難以全面反映其內(nèi)在質(zhì)量。本研究通過(guò)雙波長(zhǎng)高效液相色譜法(HPLC)同時(shí)測(cè)定脈君安片中葛根素、氫氯噻嗪、鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿的含量,以期為后續(xù)脈君安片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Waters e2695型高效液相色譜儀(美國(guó)沃特世公司);XPE105型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)。

對(duì)照品葛根素(110752-201313,純度95.5%)、氫氯噻嗪(100309-201404,純度99.7%)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院;鉤藤堿(批號(hào):MUST-21061511,純度≥98.0%)、異鉤藤堿(批號(hào):MUST-21061510,純度≥98.0%)均購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司;去氫鉤藤堿(ST10570120,純度≥98.0%)、異去氫鉤藤堿(ST11080120,純度≥98.0%)均購(gòu)于上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司;3批脈君安片均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)中聯(lián)藥業(yè)有限公司,批號(hào)分別為200060,210020,200010;甲醇為色譜純,來(lái)自美國(guó)Fisher公司,水為超純水,其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:菲羅門(mén)Titank C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:以甲醇為流動(dòng)相A,以水(含0.05%的三乙胺溶液,用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至7.6)為流動(dòng)相B,梯度洗脫(0～10 min,80%A;10～15 min,80%A→33%A;15～40 min,33%A;40～45 min,33%A→80%A;45～50 min,80%A);流速:1.0 ml/min;柱溫:30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):270 nm(氫氯噻嗪)、245 nm(葛根素、鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿);進(jìn)樣量:10 μl。

1.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取各對(duì)照品適量,精密稱(chēng)定,加甲醇使溶解,配制成每1 ml含氫氯噻嗪1.443 mg、葛根素7.681 mg、鉤藤堿0.162 mg、異鉤藤堿0.140 mg、去氫鉤藤堿0.117 mg、異去氫鉤藤堿0.132 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液,精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1 ml,置25 ml棕色量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為混合對(duì)照品溶液,室溫避光保存,備用。

1.2.3 供試品溶液的制備 取本品20片,除去包衣,精密稱(chēng)定,研細(xì),取約0.37 g(約相當(dāng)于一片量),精密稱(chēng)定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇25 ml,密塞稱(chēng)重,浸泡過(guò)夜,超聲處理40 min,放冷,再稱(chēng)定質(zhì)量,用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液10 ml,加在中性氧化鋁柱(100～200目,3 g,內(nèi)徑為1 cm)上,用70%甲醇40 ml洗滌,收集流出液及洗脫液,60 ℃水浴蒸干,殘?jiān)蛹状既芙?并定容至10 ml量瓶中,搖勻,用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò),即得供試品溶液。

1.2.4 陰性樣品溶液的制備 按處方比例(鉤藤1 470 g,葛根549 g,氫氯噻嗪1.5 g)分別制備無(wú)鉤藤、無(wú)葛根、無(wú)氫氯噻嗪的陰性樣品,再按“1.2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法分別制備各陰性樣品溶液。

2 結(jié)果

2.1 提取條件的考察

試驗(yàn)考察了中性氧化鋁的目數(shù)(100～200目和200～300目)及用量(2,3,4 g)對(duì)提取率的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),目數(shù)100～200目,用量2 g時(shí),提取率雖較高,但凈化效果欠佳,目數(shù)200～300目時(shí),提取效率偏低,結(jié)果見(jiàn)表1。采用不同體積(20,30,40,50 ml)的70%甲醇進(jìn)行洗脫,結(jié)果發(fā)現(xiàn),40 ml與50 ml提取效果接近,均高于20 ml和30 ml,結(jié)果見(jiàn)表2。因此供試品溶液的提取條件為中性氧化鋁柱的目數(shù)100～200目,3 g,用70%甲醇40 ml洗滌。

2.2 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

分別吸取“1.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、“1.2.3”項(xiàng)下供試品溶液及“1.2.4”項(xiàng)下陰性樣品溶液各10 μl,按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明:待測(cè)成分能基線分離,理論塔板數(shù)按各成分峰計(jì)算均大于8 000,陰性樣品溶液色譜與對(duì)照品、供試品色譜相對(duì)應(yīng)保留時(shí)間處均沒(méi)有相應(yīng)的色譜峰(見(jiàn)圖1),說(shuō)明該方法對(duì)測(cè)定脈君安片中的葛根素、氫氯噻嗪、鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿及異去氫鉤藤堿具有專(zhuān)屬性,無(wú)其他干擾。

表1 中性氧化鋁的目數(shù)和用量對(duì)提取結(jié)果的影響 (n=3)

表2 不同體積70%甲醇洗脫對(duì)提取結(jié)果的影響 (n=3)

1.氫氯噻嗪;2.葛根素;3.異去氫鉤藤堿;4.異鉤藤堿;5.去氫鉤藤堿;6.鉤藤堿圖1 混合對(duì)照品、供試品與各陰性樣品HPLC色譜圖Figure 1 HPLC chromatograms of mixed reference, Maijun’an tablet sample and negative samples

2.3 線性考察

分別精密稱(chēng)取氫氯噻嗪、葛根素、鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿對(duì)照品適量,加甲醇溶解并制成每1 ml含氫氯噻嗪1.148 4 mg/ml、葛根素6.103 4 mg/ml、鉤藤堿0.128 7 mg/ml、異鉤藤堿0.095 5 mg/ml、去氫鉤藤堿0.113 2 mg/ml、異去氫鉤藤堿0.107 1 mg/ml的混合對(duì)照品母液。精密吸取上述對(duì)照品母液0.1,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0 ml分別置于20 ml量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,得系列混合對(duì)照品溶液,精密吸取上述系列混合對(duì)照品溶液按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,記錄色譜圖。以各待測(cè)成分質(zhì)量濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)(x),相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸,結(jié)果顯示,各待測(cè)成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(見(jiàn)表3)。

表3 各成分線性關(guān)系

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取“1.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μl注入液相色譜儀,按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄其峰面積測(cè)量值,結(jié)果氫氯噻嗪、葛根素、鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿的精密度RSD分別為0.39%,0.52%,0.41%,0.67%,0.58%,0.73%(見(jiàn)表4),表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批片劑(批號(hào):210020)6份,按照“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,測(cè)得氫氯噻嗪、葛根素、鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿含量RSD分別為0.95%,1.47%,2.02%,1.03%,1.26%,1.90%(見(jiàn)表4),表明本方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液,于溶液配制后的0,4,8,12,16,20,24 h按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,測(cè)得氫氯噻嗪、葛根素、鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿峰面積的RSD分別為0.43%,0.51%,1.56%,1.34%,1.01%,1.13%(見(jiàn)表4),表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表4 供試品溶液6種成分檢測(cè)的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn) (n=6)

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取各成分含量已知的脈君安片(批號(hào):210020)適量,研細(xì),精密稱(chēng)取0.37 g,置具塞錐形瓶中,共6份,分別精密加入“1.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0 ml,按照“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖,計(jì)算各成分加樣回收率及其RSD值,結(jié)果見(jiàn)表5。

2.8 檢測(cè)限與定量限

選定的色譜條件下,以信噪比S/N=3,測(cè)得最低檢測(cè)限:鉤藤堿為0.79 ng,異鉤藤堿0.61 ng,去氫鉤藤堿0.66 ng,異去氫鉤藤堿0.69 ng;以信噪比S/N=10,測(cè)得定量限:鉤藤堿為3.76 ng,異鉤藤堿3.19 ng,去氫鉤藤堿3.47 ng,異去氫鉤藤堿3.55 ng。

2.9 市售樣品檢測(cè)

取3批次脈君安片樣品(國(guó)藥集團(tuán)中聯(lián)藥業(yè)有限公司,批號(hào)分別為200060,210020,200010)各3份,分別按照“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,依法測(cè)定氫氯噻嗪、葛根素、鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿和異去氫鉤藤堿的含量并計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表6。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

通過(guò)UV-2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在190～400 nm波長(zhǎng)段分別對(duì)葛根素、氫氯噻嗪、鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿進(jìn)行掃描,并參考《中國(guó)藥典》2020年版一部和二部可知,葛根素和氫氯噻嗪分別在250 nm和270 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。鉤藤堿和異鉤藤堿,去氫鉤藤堿和異去氫鉤藤堿分別為同分異構(gòu)體,母核結(jié)構(gòu)基本相似,紫外吸收幾乎相同,分別在243～247 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。于245 nm和250 nm處對(duì)葛根素進(jìn)行檢測(cè),其峰面積、分離度幾乎無(wú)變化,參考相關(guān)文獻(xiàn)選擇245 nm為葛根素和4種生物堿的共同檢測(cè)波長(zhǎng)[14,15]。

表5 六種成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

表6 市售樣品中6種成分含量測(cè)定結(jié)果 (n=3)

3.2 供試品溶液提取方法的選擇

根據(jù)指標(biāo)成分理化性質(zhì),參考文獻(xiàn)[16,17]選用70%甲醇作為提取溶劑,超聲或回流提取,提取率均較高但雜質(zhì)峰較多,為進(jìn)一步純化,使用中性氧化鋁柱進(jìn)行凈化處理后,雜質(zhì)峰明顯減少,分離度均能達(dá)到2.0以上。用“1.2.3”項(xiàng)下的方法提取供試品溶液,通過(guò)加樣回收率試驗(yàn),各成分平均加樣回收率為96.8%～99.2%,表明中性氧化鋁柱對(duì)指標(biāo)成分含量測(cè)定結(jié)果幾乎無(wú)影響?？紤]回流提取溫度較高,鉤藤生物堿在高溫下穩(wěn)定性較差[18],受熱易發(fā)生轉(zhuǎn)化,而超聲提取處理時(shí)間較短且更為便捷,因此選擇超聲提取。

3.3 色譜條件的選擇

用甲醇-水或乙腈-水作流動(dòng)相,4種生物堿色譜峰拖尾嚴(yán)重,在水相中加入三乙胺,并且對(duì)其濃度由0.01%逐漸增加,同時(shí)用冰醋酸調(diào)節(jié)pH,結(jié)果顯示,當(dāng)水相三乙胺濃度為0.05%、pH值為7.5～8.0,有機(jī)相為甲醇時(shí),4種生物堿峰形能得到明顯改善。進(jìn)一步考察流動(dòng)相的比例,當(dāng)甲醇-三乙胺水溶液等度洗脫時(shí),葛根素和氫氯噻嗪很難分開(kāi),改為梯度洗脫(見(jiàn)“1.2.1”項(xiàng)下),6種成分分離度均較好,且保留時(shí)間較為恰當(dāng),高效液相色譜圖基線平穩(wěn)。因此選擇上述流動(dòng)相及洗脫條件。

綜上所述,建立了脈君安片的HPLC雙波長(zhǎng)分析方法,測(cè)定了葛根素、氫氯噻嗪、鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿和異去氫鉤藤堿的含量,該方法操作簡(jiǎn)便,專(zhuān)屬性強(qiáng),重復(fù)性好,準(zhǔn)確度高,可為脈君安片質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制提供科學(xué)依據(jù)。