陳美慧，韓宇博，隋艷波，劉 莉

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是由心臟結構和（或）功能異常引起靜息或負荷時心輸出量減少和（或）心內壓力增高的一組復雜臨床綜合征，可表現為呼吸困難、心悸、乏力、下肢水腫等癥狀，是各種心臟疾病的終末階段。因其高患病率、住院率、死亡率給社會和個人帶來沉重負擔。全球患有心力衰竭的人數超過2 600 萬，隨著我國人口老齡化趨勢加劇，心力衰竭流行病學調查的最新結果顯示我國約有1 370 萬心衰患者，而年齡階段在35 歲以上的患病率為1.3%［1］。一項多中心隨機對照實驗表明標準基礎治療聯合口服中藥芪藶強心膠囊，可顯著改善CHF 主要結局指標N 末端腦鈉肽前體水平［2］?！吨袊牧λソ咴\斷和治療指南2018》也明確指出了中醫(yī)中藥的干預作用，越來越多的中醫(yī)藥治療被廣泛用于臨床，且中醫(yī)藥治療心衰具有穩(wěn)定病情、改善心功能、提高生存質量等優(yōu)勢［3］。中 醫(yī) 學 者 認 為CHF 屬“喘 證”、“虛 勞”、“水腫”等范疇，病機可概括“虛”、“瘀”、“水”，其虛實消長的動態(tài)決定了心衰的發(fā)展演變［4］。

劉莉教授治療CHF 以補虛扶正為指導思想，結合中醫(yī)經典與多年的臨床經驗，以“益氣溫陽、活血利水”為治療大法，總結運用“參芪益心方”為治療CHF 的經驗方，取得了較好療效［5-7］。方中“黃芪-太子參”共為君藥，兩者均為益氣之品，共奏補益臟腑之功。黃芪、太子參藥性平和，同歸脾、肺經。黃芪有補氣固表、利尿之功效，具有保護心肌細胞和血管內皮細胞，抑制心肌肥厚、心肌纖維化的作用［8，9］。太子參有益氣健脾、生津潤肺之功效，可以保護心肌、改善氧化應激狀態(tài)、降血脂等［10，11］。目前，“黃芪-太子參”治療CHF 的機制尚不明確。網絡藥理學作為一種中藥新藥的研究方法，可以通過建立網絡模型，對中藥成分與疾病的靶點、通路進行分析，揭示藥物與疾病的作用關系。因此，本研究借網絡藥理學優(yōu)勢，對“黃芪-太子參”治療CHF 的潛在機制進行分析，為臨床應用提供一定的理論依據，從而進一步指導用藥。

1 材料與方法

1.1 “黃芪-太子參”藥對活性成分的收集與篩選

利用TCMSP 數據庫（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）分別檢索“黃芪”、“太子參”，得到中藥化學成分信息，將相關參數設置為：口服生物利用度（OB）＞30%且類藥性（DL）＞0.18，篩選后獲取黃芪、太子參的活性成分及藥物靶點。

1.2 藥物-疾病-靶點網絡的構建

以“Chronic Heart Failure”為關鍵詞，通過在線人類孟德爾遺傳數據庫OMIM（http：//www.omim.org/）與 人 類 基 因 數 據 庫GeneCards（http：//genecards.org/）進行檢索，收集CHF 的相關靶點。應用Interactivenn 平 臺（http：//www.interactivenn.net/）獲取藥物與疾病的靶點交集。將交集靶點（Drug-Disease）導入Cytoscope3.7.1 軟件，構建藥物-疾病-靶點（drug-disease-target，DDT）的可視化網絡。

1.3 蛋白互作網絡的建立

使用String 數據庫，將Drug-Disease 結果上傳，設定物種為“Homo sapiens”，最低互動分數為0.400，導出靶蛋白互作網絡（protein-protein interaction network，PPI），再使用Cytoscope3.7.1 軟件對節(jié)點分析排序。

1.4 GO 功能和KEGG 通路富集分析

在DAVID 數據庫中導入Drug-Disease 結果，進行基因本體（Gene Ontology，GO）分析和基于京都基因與基因百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路富集分析，再根據Pvalue 數值排序，篩選10 項GO 功能和KEGG 通路12 條進行可視化分析。

2 結果

2.1 黃芪-太子參藥對化學成分信息

通過TCMSP 數據庫檢索“黃芪”、“太子參”得到所有化學成分，經過篩選（符合OB＞30%且DL＞0.18 條件），最終共獲得28 個有效化學成分，黃芪20 個，太子參8 個。根據OB 值，將各藥物排名前5的有效成分基本信息列出，見表1。

表1 黃芪-太子參的化學成分基本信息Tab 1 Basic information on chemical compositions of Radix Astragali-Radix Pseudostellariae

2.2 DDT 網絡的構建

運用TCMSP 數據庫獲得黃芪-太子參藥對作用靶點共106 個，在OMIM 與Gene Cards 數據庫搜索得到CHF 相關基因靶點10 352 個，將所得藥物與疾病靶點進行交集化處理，共得到104 個藥物-疾病靶點，見圖1。運用Cytoscape3.7.1 軟件對中藥調控網絡進行可視化處理發(fā)現，該網絡具有104 個節(jié)點、389 條邊，見圖2。

圖1 藥物-疾病-靶點（DDT）韋恩圖Fig 1 Drug-disease-target（DDT）Wayne diagram

圖2 藥物-疾病-化學成分-靶點網絡Fig 2 Drug-disease-chemical composition-target network

2.3 PPI 網絡的構建及可視化分析結果

進入String 互聯網界面，將Drug-Disease 的交集靶點全部導入數據庫，物種選擇“Homo sapiens”，最低互動分數為0.400，利用Cytoscape 軟件，根據Degree 值對104 個節(jié)點進行有序排列，前5 個靶點依 次 為IL-6、VEGFA、CASP3、MAPK8、EGFR。見圖3。

圖3 關鍵靶點排序結果Fig 3 Sequencing results of key targets

2.4 GO 功能分析

應用DAVID 數據庫對所得到的104 個“藥物-疾病”靶點進行GO 功能分析，共得出49 條功能注釋。利用OmicShare 平臺對細胞成分（cell component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物過程（biological process，BP）類別分析，并依據P值和富集靶點數，將靠前的GO 富集分析結果進行排序。見圖4～7。

圖4 GO 功能分析圖-GO 柱狀圖Fig 4 GO function analysis diagram-GO histogram

2.5 KEGG 富集分析

圖5 細胞成分的GO 功能分析圖Fig 5 GO function analysis diagram of cell component

圖6 分子功能的GO 功能分析圖Fig 6 GO function analysis diagram of molecular function

圖7 生物過程的GO 功能分析圖Fig 7 GO function analysis diagram of biological process

通 過DAVID 平 臺，對104 個DDT 進 行KEGG富集分析，共得到86 條富集通路，結果表明“黃芪-太子參”治療CHF 與多種信號通路相關，根據KEGG 氣泡圖顯示其中排名靠前的通路主要有PI3K-Akt、MAPK、TNF 等，見圖8。通過Cytoscape軟件對DDT 與富集通路進行可視化網絡展示，該網絡具有140 個節(jié)點，510 條邊，見圖9。

圖8 KEGG 富集分析氣泡圖Fig 8 Bubble diagram of KEGG enrichment analysis

圖9 藥物-疾病-靶點-通路網絡Fig 9 Drug-disease-target-pathway network

3 討論

CHF 是一種緩慢進展性病變，指在原有慢性心臟病的基礎上逐漸出現心衰的癥狀和體征。CHF與炎癥反應、氧化應激、血管內皮功能調節(jié)等有關，其最關鍵的病理、生理機制為心室重構，然而心肌細胞凋亡、心肌肥大及心肌纖維化等是心室重構的基本特征。CHF 以老年患者居多，且病情遷延不愈，耗傷人體正氣，則心氣虧虛。黃芪為補氣之要藥，具有益氣溫陽之功，大量研究證實黃芪及其有效成分具有明顯的強心作用，可改善心衰［12］。太子參為氣血雙補之品，補氣滋陰而不助熱，可改善急性心肌梗死所致的CHF，具有保護心肌的作用［10］?；诰W絡藥理學研究發(fā)現，黃芪、太子參兩味中藥內含有多種有效成分，可作用于多靶點、多通路，共同調節(jié)生物功能影響CHF。

本研究經過篩選統計，共獲得28 個化學成分，其中芒柄花素、山奈酚、槲皮素、β-谷甾醇等為主要化合物。在CHF 的發(fā)展過程中，氧化應激、炎癥因子、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）可等誘導心肌細胞發(fā)生凋亡，啟動代償性結構重構，而進一步發(fā)展則會引發(fā)心肌肥厚、心臟順應性下降等病理性重構，最終發(fā)展成為心力衰竭。活性氧的大量堆積可促發(fā)病人體內氧化應激功能紊亂，引起心肌細胞損傷和死亡，與心力衰竭心室重構病理過程密切相關。于雪等［13］建立H9C2 心肌細胞缺氧復氧模型，發(fā)現芒柄花素能夠降低心肌細胞內活性氧水平，改善細胞貼壁的狀態(tài)，增加細胞存活率，對心肌細胞有一定的保 護 作 用。 Toll 樣 受 體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是心肌細胞中表達量最高的TLR 的亞型，通過與配體結合，激活下游NF-κB，誘導炎癥因子的產生，在炎癥反應中發(fā)揮重要作用［14］。相關研究表明［15］山奈酚能明顯改善H9c2 細胞活性，這種情況可能與抑制TLR4/NF-κB 信號通路相關，通過抗心肌細胞炎癥的發(fā)生而減少細胞凋亡，從而發(fā)揮保護心血管的作用。槲皮素作為黃酮類化合物，具有抗氧化應激、抑制炎癥反應，抑制纖維化等多種生物作用，對心、肝、腎等器官具有明顯保護作用［16］，可明顯降低AngⅡ誘導的心肌肥大細胞中Akt 磷酸化水平，從而抑制其活性［17］。此外，槲皮素還可通過抑制NADPH 氧化酶介導eNOS 磷酸化以增加內皮細胞生物利用度，改善血管內皮細胞功能，對心臟具有保護作用［18］。Choi 等［19］研究發(fā)現β-谷甾醇能抑制IL-6 活性，減少腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白介素（IL）-1β（IL-1β）等炎性因子的釋放，改善炎癥反應，且通過上調SOD、下調ERK1/2 水平，參與到緩解氧化應激和抑制細胞凋亡過程中［20］?？梢婞S芪、太子參中相關化學成分對CHF 的治療有一定的積極作用。

根據PPI 網絡圖顯示，“黃芪-太子參”藥對通過多靶點對CHF 發(fā)揮作用，分析后得出相互作用最多的靶點有IL-6、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）A、CASP3、MAPK8、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）等。IL-1、IL-6、TNF-α 等炎癥因子對CHF 的發(fā)展可產生直接作用，其中IL-6 是一種重要的炎癥介質。相關實驗證實IL-6 刺激轉化生長因子（TGF-β）的表達，使心肌細胞外基質膠原合成增加，降解減少，引起心肌纖維化，導致或加重心室重構，促進CHF 的發(fā)生［21，22］。VEGFA 是VEGF 家族主要的成員因子，在調節(jié)血管生成過程中具有重要作用，心肌組織內VEGFA 與VEGF-R1、VEGF-R2特異性受體結合后，通過多條生物途徑，誘導內皮細胞增殖、分化、遷移，參與CHF 的血管重構和心肌血管生成［23］，另一方面，VEGFA 由心肌細胞受炎癥、機械作用和細胞因子刺激產生，其心肌能量代謝 變 化 影 響 著CHF 的 發(fā) 展［24，25］。心 肌 細 胞 凋 亡 是代償性心肌重構轉向心力衰竭的關鍵，受多種因子調控，其中CASP3、MAPK8 為比較重要的蛋白。CASP3 能夠引發(fā)Caspase 級聯反應，誘導細胞凋亡。Wang 等［26］的研究發(fā)現通過調控心衰大鼠心肌組織中Bcl-2 的表達，降低Bax 和Caspase 3 表達水平，從而抑制心肌細胞凋亡，達到改善大鼠心功能的作用。當激活MAPK8 時，上皮細胞中存在一種促凋亡蛋白BMF 發(fā)生磷酸化，進入線粒體，產生生物作用，啟動細胞凋亡程序，從而導致心臟結構發(fā)生改變［27］。Ang Ⅱ引起的血管平滑肌細胞肥大與表皮生長因子受體EGFR 反式激活有關，EGFR 為一種跨膜糖蛋白，通過誘導內質網應激發(fā)揮作用，為血管重構的關鍵成分［28］。此外，EGFR 的激活會促使受體酪氨酸激酶發(fā)生磷酸化，導致一系列信號通路的啟動，進而調控心肌細胞增殖、分化等［29］。綜合上述，潛在靶點經多種途徑參與CHF 病理、生理過程。

對“黃芪-太子參”藥對治療CHF 進行GO 分析發(fā)現，黃芪-太子參通過多種形式參與其生物學進程，主要涉及細胞凋亡、血管內皮細胞遷移、氧化應激反應、炎癥反應等。經KEGG 富集分析得到多條信號通路，主要的通路有PI3K-AKT、MAPK、TNF等。PI3K-AKT 是體內一條重要的信號轉導通路，PI3K 為上游信號，能激活并促使其下游的AKT 發(fā)生磷酸化，參與信號轉導過程，通過調控下游多種蛋白，對血管再生、心肌細胞凋亡自噬、能量代謝、Ca2+循環(huán)蛋白及炎癥反應等活動產生影響，與CHF的 發(fā) 生 與 發(fā) 展 關 系 緊 密［30，31］。PI3K 表 達 水 平 和AKT 磷酸化水平下降，對心臟功能的改善與恢復有著積極的作用。相關實驗［32］表明黃芪中活性成分能通過上調SIKE 抑制TBK1/PI3K/AKT 活性，預防心肌肥厚。MAPK 是將信號從細胞外傳導到細胞核內的重要傳遞者，廣泛存在于各種細胞中，參與細胞生長、增殖、分化、凋亡以及應激、炎癥和自噬等多種生理病理過程，當MAPK 信號通路激活，細胞外調節(jié)蛋白激酶（ERKs）、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）和p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）磷酸化，調控基因表達，造成心肌細胞肥大、凋亡等，從而導致心肌肥厚、心肌纖維化［33，34］。抑制ERKs、JNK、p38MAPK 通路，能減輕心肌細胞凋亡，降低心肌自噬水平，減少心肌損傷，使心肌細胞因子水平正?；?，改善心室收縮功能［35-37］。TNF 信號傳導通路的激活，可促進細胞生長、分化，同時誘發(fā)細胞凋亡、炎癥反應，多種途徑參與心室重構。心肌細胞本身不能產生TNF-α，當CHF 出現時，TNF-α 能夠在細胞中表達，激活NF-κB 轉錄到細胞核，誘導IL-6、環(huán)氧化酶（COX）等炎癥因子，刺激心肌細胞肥大和凋亡，導致組織重構［38-40］，加重CHF 的病情。因此，本研究認為“黃芪-太子參”可能通過多靶點、多途徑、多信號通路等協調發(fā)揮生物學效應，從抑制細胞凋亡、減輕炎癥反應、對抗心室重構等多方面達到延緩心衰的發(fā)展的目的。

黃芪、太子參為補益之品，藥物性質穩(wěn)定。本研究基于網絡藥理學，構建可視化網絡圖，發(fā)現“黃芪-太子參”藥對中含28 個有效化學成分、104 個靶點、86 條通路與CHF 存在潛在相關性，其作用機制可能通過抑制細胞凋亡、抗炎、抗氧化應激等途徑協同治療CHF，為今后挖掘治療基因及深入研究“黃芪-太子參”或中藥治療CHF 的機制提供基本參考依據。

作者貢獻度說明：

陳美慧：研究設計，實施研究，采集及統計分析數據，文章撰寫等。韓宇博：工作指導、文章內容審閱。隋艷波：工作指導、技術支持等。劉莉：研究設計，工作指導、文章審閱等。