徐曉寒,葉小麗,邢安琪,武子辰,孫怡,朱江媛,王艮梅,王玉花*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院,江蘇 南京210095;2.南京林業(yè)大學南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210037)

茶樹(Camelliasinensis)對其生長環(huán)境的變化非常敏感,例如極端溫度、鹽度和干旱等[1-2]。在各種逆境(非生物脅迫)下,茶樹的生長發(fā)育以及茶葉產(chǎn)量、品質(zhì)受到了嚴重影響。已有研究表明,干旱脅迫可以通過影響含硫化合物的代謝來影響光合作用,也可以通過影響茶樹多酚的生物合成來影響香氣物質(zhì)[3]。因此,研究茶樹抵抗非生物脅迫的內(nèi)在分子機制能夠為育種和栽培提供理論指導。

小G蛋白(small GTPase)是一種家族成員眾多的能夠參與調(diào)控細胞各種生命活動的信號轉(zhuǎn)導蛋白,普遍存在于真核細胞中,可分為Ras超家族(包括5個亞家族)和異源三聚G蛋白[4-5]。RAC,又稱ROP,屬于Ras超家族中的Rho亞家族,是植物基因組中唯一編碼的植物特異性RAC小G蛋白[5]。研究表明,RAC在植物中發(fā)揮著重要作用,包括細胞骨架的組織動力學、囊泡運輸、激素信號傳導[6-7]。此外,近年來的許多研究也表明,RAC還可以調(diào)節(jié)細胞形態(tài)發(fā)生、根毛發(fā)育中的極性生長、花粉管生長、激素反應、對致病菌和非生物脅迫的抵抗以及參與光合作用介導的氣孔關閉[8-11]。同時,RAC/ROP也是植物防御和抗逆性的“分子開關”。林群婷等[12]發(fā)現(xiàn)水稻OsRAC5基因能夠在干旱、高溫、鹽、脫落酸(ABA)等非生物脅迫下被誘導表達。轉(zhuǎn)基因OsRac1水稻[13]和轉(zhuǎn)基因Rac13棉花[10]通過調(diào)節(jié)活性氧(ROS)的產(chǎn)生來響應植物的防御反應。在高鹽環(huán)境中,轉(zhuǎn)NtRop1基因擬南芥能夠通過抑制根生長和提高電導率表現(xiàn)出比野生型更好的耐鹽性[14]。此外,AtRbohD和AtRbohF能夠通過影響Ca2+信號轉(zhuǎn)導和植物生長素的響應,正向調(diào)控脫落酸抑制初生根的生長[15]。

在前期研究中,已從茶樹中鑒定并克隆了CsRAC5完整的開放閱讀框堿基序列,并進行了生物信息學、組織特異性表達和低溫響應表達分析等,發(fā)現(xiàn)CsRAC5參與茶樹低溫響應[16]。本研究以茶樹品種‘龍井長葉’為材料,采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法研究了3種非生物脅迫(高鹽、干旱和脫落酸)下茶樹中CsRAC5的表達,并探討CsRAC5與非生物脅迫的對應關系。此外,通過農(nóng)桿菌介導浸染法獲得CsRAC5轉(zhuǎn)基因擬南芥,并通過對鹽脅迫、干旱處理和ABA處理下轉(zhuǎn)基因擬南芥的萌發(fā)率、根長和生理生化等指標的測定,驗證CsRAC5在非生物脅迫下的功能,將為進一步研究茶樹RAC/ROP蛋白的生物學功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

通過對前期低溫脅迫下‘龍井長葉’花粉管轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對獲得AtRAC5高度同源基因[16]。本試驗繼續(xù)選用茶樹品種‘龍井長葉’為研究對象。將水培茶苗放入RXZ型人工智能氣候箱(寧波江南儀器廠),光照/黑暗時間為12 h/12 h,光照度為30 000 lx,晝/夜溫度25 ℃/20 ℃,相對濕度75%～80%。培養(yǎng)4周后選擇長勢一致的茶苗分別進行鹽脅迫(200 mmol·L-1NaCl)、激素處理(25 μmol·L-1ABA)和干旱處理(20% PEG6000)。每個處理設置3個生物學重復,每個重復設置3株茶苗。分別于處理0、2、12、24 h后取茶苗頂端至下第3～4片成熟葉,經(jīng)液氮速凍后,保存于-80 ℃冰箱備用。

本研究中所使用的野生型擬南芥為Columbia-0型,大腸桿菌菌株為DH5α,農(nóng)桿菌菌株GV3101-pSoup購于愚公生物公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取以及cDNA合成參照EASYspin Plus 多糖多酚/復雜植物RNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)說明書提取茶樹葉片的總RNA,4 ℃冷卻后保存于-80 ℃。以茶樹葉片總RNA為模板按照TransScript?All-in-one First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for RT-qPCR(北京全式金生物技術(shù)有限公司)說明書合成cDNA。

1.2.2CsRAC5表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得在泛素啟動子的控制下,將測序正確的無終止密碼子的CsRAC5完整ORF區(qū)克隆產(chǎn)物連接至植物表達載體,得到重組載體pGreenII-Hyg-UBQ10-Rac5-eGFP[16],克隆CsRAC5完整ORF區(qū)的引物參考前期研究方法[17]。將重組載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌后通過農(nóng)桿菌介導浸染法獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥T0代。經(jīng)過25 μg·mL-1潮霉素抗性篩選,直到獲得純合的T3轉(zhuǎn)基因擬南芥種子。

1.2.3 定量PCR分析使用Primer Premier 5設計CsRAC5熒光定量特異性引物CsRAC5-RT-F/R以及CsRAC5全長引物CsRAC5-ORF-F/R。采用2-ΔΔCT法計算CsRAC5的相對表達量,每種脅迫單獨計算并以脅迫0 h葉片中的表達量為對照。以β-actin基因作為茶樹葉片的內(nèi)參基因,熒光定量及內(nèi)參基因引物序列參考前期研究[18]。熒光定量PCR反應體系為:SYBR GreenⅠ10 μL,正、反引物各0.4 μL,模板DNA 1 μL,補充ddH2O至20 μL。熒光定量PCR反應程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,65 ℃ 10 s,共40個循環(huán)。通過PCR使用CsRAC5全長引物對T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥進行鑒定。

1.2.4 擬南芥的萌發(fā)率、成活率、表型及根長測定擬南芥野生型(WT)和經(jīng)驗證過的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系(OE6和OE7)分別播種于1/2MS固體培養(yǎng)基上,經(jīng)4 ℃春化3 d后分別進行鹽脅迫(50、100 mmol·L-1NaCl)、干旱處理(6% PEG6000)和外源ABA處理(0.25、0.50 μmol·L-1ABA)處理,對照組(Control)不做任何處理。所有處理均在光照培養(yǎng)箱中進行,光照/黑暗時間為8 h/16 h,晝/夜溫度為25 ℃/22 ℃,濕度為(75±5)%,每個處理3次生物學重復。萌發(fā)率和成活率統(tǒng)計:每個處理播種100粒擬南芥種子,連續(xù) 7 d 每天記錄種子萌發(fā)情況(當胚根完全穿透種皮,認為種子已萌發(fā)),并于播種后7 d拍照記錄表型,播種后14 d觀察成活率。根長的測定:每個處理播種10粒擬南芥種子,于播種后7 d使用植物活體成像系統(tǒng)(PIXIS 1024B,Princeton Instruments,美國)對擬南芥幼苗進行掃描成像并使用Image J軟件測量,計算其主根長度。

1.2.5 擬南芥生理指標的測定將在1/2MS固體培養(yǎng)基上生長2周的WT、OE6和OE7移栽至含有營養(yǎng)土(珍珠巖∶土壤∶蛭石質(zhì)量比為1∶2∶1)的花盆中,在光照培養(yǎng)箱里培養(yǎng)4周后,挑取長勢一致的野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因擬南芥進行100 mmol·L-1NaCl根灌處理,以根灌蒸餾水作為對照,處理組及對照組均設置 6個花盆作為生物學重復,每個花盆保留2株擬南芥。處理2 d后取樣,測定丙二醛、可溶性糖和葉綠素含量。根據(jù)AOGENE試劑盒說明書測定擬南芥葉片丙二醛含量,采用蒽酮-硫酸法測定總可溶性糖含量[19],采用丙酮提取法測定葉綠素含量[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016軟件處理試驗數(shù)據(jù)。采用IBM SPSS Statistics 19、Canoco 5以及SigmaPlot 12.5進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析以及圖形繪制,采用Tukey HSD方法進行顯著性差異比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 非生物脅迫下茶樹葉片中CsRAC5的表達量分析

由圖1可見:在鹽脅迫、干旱處理和ABA處理下茶樹葉片中CsRAC5的相對表達量均顯著下降(P<0.05)。茶樹葉片CsRAC5的相對表達量在鹽脅迫和干旱處理2 h后即顯著下降,而ABA處理則在處理 12 h 后才顯著下降。

圖1 茶樹葉片中CsRAC5在非生物脅迫下的表達分析Fig.1 Expression analysis of CsRAC5 under abiotic stresses in Camellia sinensis leavesA. 鹽脅迫(200 mmol·L-1 NaCl);B. 干旱處理(20% PEG6000);C. ABA處理(25 μmol·L-1 ABA)。A. Salt stress(200 mmol·L-1 NaCl);B. Drought treatment(20% PEG6000);C. ABA treatment(25 μmol·L-1 ABA).不同小寫字母表示顯著差異(P<0.05)。下同。Different lowercase letters represent significant differences(P<0.05). The same as follows.

2.2 CsRAC5轉(zhuǎn)基因擬南芥鑒定

對在含潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基上全部成活的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系提取RNA并合成cDNA,經(jīng)RT-PCR擴增后電泳結(jié)果(圖2)顯示,成功獲得3株轉(zhuǎn)基因CsRAC5的擬南芥株系:OE2、OE6、OE7,且在野生型擬南芥(WT)中并未檢測出CsRAC5的片段。挑選CsRAC5條帶較亮的擬南芥株系OE6和OE7,用于后續(xù)的非生物脅迫響應試驗。

圖2 CsRAC5轉(zhuǎn)基因擬南芥株系鑒定Fig.2 Identification of CsRAC5 transgenic Arabidopsis thaliana linesWT:野生型 Wild-type;OE2、OE6、OE7:轉(zhuǎn)基因株系 Transgenic lines.

2.3 CsRAC5轉(zhuǎn)基因擬南芥對非生物脅迫的響應

2.3.1 非生物脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥的萌發(fā)率如圖3所示:在對照條件下,2個CsRAC5轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的萌發(fā)率與野生型沒有明顯差別。隨著培養(yǎng)基中NaCl濃度的增加,OE6、OE7的萌發(fā)率與WT之間的差距越來越大,轉(zhuǎn)基因株系在100 mmol·L-1NaCl處理下的7 d萌發(fā)率僅維持在80%左右,而WT則依舊能夠維持在95%以上。在ABA處理下,3個擬南芥株系種子的7 d萌發(fā)率均隨ABA濃度的升高而降低,且ABA對OE6、OE7的萌發(fā)抑制明顯高于WT。CsRAC5轉(zhuǎn)基因擬南芥種子對干旱脅迫的響應主要表現(xiàn)為播種后前3 d的萌發(fā)延遲,而在播種后4 d開始,OE6、OE7的萌發(fā)率與WT持平。

圖3 非生物脅迫下野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥的萌發(fā)率Fig.3 Germination rate of wild-type and transgenic A. thaliana under abiotic stresses A—F分別為對照、50 mmol·L-1 NaCl、100 mmol·L-1 NaCl、0.25 μmol·L-1 ABA、0.50 μmol·L-1 ABA和6% PEG6000處理。A-F are control,50 mmol·L-1 NaCl,100 mmol·L-1 NaCl,0.25 μmol·L-1 ABA,0.50 μmol·L-1 ABA and 6% PEG6000 treatment,respectively.

2.3.2 非生物脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型由圖4可見:在所有處理下,3個擬南芥株系均可順利長出綠色子葉。在對照和鹽脅迫下,OE6、OE7與WT之間并無明顯表型差異。在ABA處理下,轉(zhuǎn)基因株系OE6和OE7出現(xiàn)了較為明顯的子葉變白現(xiàn)象;在干旱處理下,3個擬南芥株系均出現(xiàn)子葉卷曲并變紫的現(xiàn)象,且轉(zhuǎn)基因株系的子葉卷曲程度略重于WT,但子葉變紫程度略輕于WT。

圖4 非生物脅迫下野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型Fig.4 Phenotype of wild-type and transgenic A. thaliana under abiotic stresses

2.3.3 非生物脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥的成活率由圖5可見:在干旱處理下,OE6、OE7的成活率與WT并無顯著差異,且均保持在95%以上。鹽脅迫和ABA處理顯著抑制了擬南芥的成活率,且呈明顯的劑量效應。此外,雖然100 mmol·L-1NaCl處理比0.50 μmol·L-1ABA處理的轉(zhuǎn)基因株系萌發(fā)率低,但成活率卻更高。

圖5 非生物脅迫下野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥的成活率Fig.5 Survival rates of wild-type and transgenic A. thaliana under abiotic stresses 不同小寫字母表示同一處理不同擬南芥株系間顯著差異(P<0.05),不同大寫字母表示同一擬南芥株系在不同處理間顯著差異(P<0.05)。下同。Different lowercase letters represent significant differences among different A. thaliana lines in the same treatment(P<0.05),and different uppercase letters represent significant differences among different treatments of the same A. thaliana line(P<0.05). The same as follow.

2.3.4 非生物脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長由圖6可見:所有非生物脅迫處理均導致擬南芥根系縮短,且在鹽脅迫和ABA處理下顯示明顯的劑量依賴性。鹽脅迫以及低濃度ABA處理導致轉(zhuǎn)基因擬南芥根長顯著低于WT,而0.50 μmol·L-1ABA和6% PEG6000處理下OE6、OE7根長與WT差異不顯著。

圖6 非生物脅迫下的野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長Fig.6 Root length of wild-type and transgenic A. thaliana under abiotic stresses

2.3.5 非生物脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥的丙二醛、可溶性糖及葉綠素含量由圖7可見:在對照條件下,2個轉(zhuǎn)基因株系OE6和OE7的丙二醛、可溶性糖以及葉綠素含量與對照組無顯著差異。100 mmol·L-1NaCl處理2 d后,3個擬南芥株系MDA含量均比對照組顯著增加,其中WT增加了48.73%,OE6和OE7分別增加了97.49%和101.72%,且轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽處理下的MDA含量也顯著高于野生型,表明鹽脅迫更容易損傷轉(zhuǎn)基因擬南芥細胞膜脂。100 mmol·L-1NaCl處理下,轉(zhuǎn)基因擬南芥可溶性糖含量顯著降低,OE6和OE7分別降低了29.35%和38.36%。表明CsRAC5轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽脅迫下可能無法維持正常的可溶性糖水平以供給植物足夠的能量來維持正常的生長發(fā)育。與可溶性糖含量類似,100 mmol·L-1NaCl處理下,轉(zhuǎn)基因擬南芥葉綠素含量顯著降低,表明轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽環(huán)境下無法維持正常的光合性能來應對鹽處理對植株的氧化脅迫。

圖7 100 mmol·L-1 NaCl處理下野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥的丙二醛(A)、可溶性糖(B)和葉綠素(C)含量Fig.7 Contents of MDA(A),soluble sugar(B)and chlorophyll(C)of wild-type and transgenic A. thaliana treated with 100 mmol·L-1 NaCl

3 討論與結(jié)論

CsRAC5是茶樹中的1個ROP/RAC基因,其功能尚未被研究。在前期工作中,我們克隆了CsRAC5基因的基因組序列,進行了生物信息學分析,檢測了其在茶樹不同組織部位中的表達水平[16]。為了進一步研究CsRAC5的生理功能,我們檢測了茶樹葉片中CsRAC5在高鹽、干旱和外源ABA處理下的表達模式,發(fā)現(xiàn)3種處理在24 h內(nèi)均誘導了CsRAC5的表達下調(diào)。類似的表達模式在香蕉MaROP-3a和MaROP-5h也已被報道[21],但在其他物種中,如擬南芥[22]、煙草[14]和水稻[23],高鹽、干旱和ABA誘導ROP/RAC表達上調(diào)。植物對非生物脅迫的防御反應中所產(chǎn)生的ROS可能來自多個方面,包括NADPH氧化酶、草酸氧化酶和過氧化物酶等[24]。不同物種中的ROP/RAC蛋白可能會作用于不同的酶,進而導致這些ROP/RAC基因在脅迫下的不同表達模式。此外,盡管茶樹CsRAC5屬于高度保守的ROP/RAC基因,但它與其他多數(shù)物種中的ROP/RAC基因的系統(tǒng)發(fā)育關系較遠,這也暗示了CsRAC5可能作用于不同的酶,具體的作用機制還需要進一步的研究。ABA參與各種環(huán)境脅迫過程[25],并且已有報道表明擬南芥AtROP6參與了ABA的負調(diào)控[26]。在本研究中,外源ABA抑制了CsRAC5基因的表達,且轉(zhuǎn)基因擬南芥植株也表現(xiàn)出對ABA更高的敏感性。這可能與CsRAC5基因編碼蛋白C-末端的CAAL基序有關[16]。

脅迫條件下的種子萌發(fā)以及后續(xù)的營養(yǎng)生長狀況可以在一定程度上表征植株對脅迫環(huán)境的響應。在本研究中,轉(zhuǎn)基因擬南芥比野生型植株對鹽和ABA更加敏感,這可以從鹽和ABA處理下轉(zhuǎn)基因擬南芥更低的種子萌發(fā)率、成活率以及更短的根長中看出。這種敏感性可能是由于轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生了較高水平的H2O2,H2O2是參與包括ABA信號通路在內(nèi)的許多細胞過程的重要信號并使細胞膜脂過氧化[14]。本研究中,轉(zhuǎn)基因植株MDA含量增加,這也表明轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽處理下產(chǎn)生了更多的H2O2從而遭受了更加嚴重的氧化損傷,進而導致轉(zhuǎn)基因擬南芥對鹽脅迫的敏感性。這可能是由于高鹽環(huán)境降低了CsRAC5的表達量,從而部分調(diào)控了轉(zhuǎn)基因植株的鹽敏感性。鹽脅迫對植物造成的危害還表現(xiàn)為滲透脅迫?？扇苄蕴鞘侵参锛毎邴}脅迫條件下所必需的滲透調(diào)節(jié)劑[27-28]。魏煬郴等[29]研究發(fā)現(xiàn)爬山虎中可溶性糖含量隨鹽濃度的升高表現(xiàn)出“低促高抑”的現(xiàn)象,這表明在一定的鹽濃度范圍內(nèi)植物能夠通過合成可溶性糖進行滲透調(diào)節(jié),而過高的鹽濃度則超過了可溶性糖的滲透調(diào)節(jié)范圍,并且高鹽脅迫也可能會破壞植物中可溶性糖的合成途徑。在本研究中,轉(zhuǎn)基因株系OE6和OE7在鹽脅迫下可溶性糖含量顯著低于野生型植株。這也進一步驗證了鹽脅迫嚴重影響了轉(zhuǎn)基因擬南芥可溶性糖合成途徑來降低其對鹽脅迫的耐受性。葉綠素含量能通過調(diào)節(jié)光合作用維持抗氧化能力[30]。本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫下葉綠素含量均較野生型低,表明鹽脅迫還能通過降低轉(zhuǎn)基因擬南芥光合色素含量來降低其抗鹽性。

干旱能夠嚴重制約植物種子的萌發(fā)、生長,甚至使植物永久萎蔫而死亡[31]。本研究發(fā)現(xiàn)在模擬輕度干旱處理下轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型株系僅在播種后的3 d內(nèi)的萌發(fā)率有明顯差異,這可能與干旱脅迫下茶樹葉片中CsRAC5表達水平的下調(diào)有關系,表明轉(zhuǎn)基因擬南芥在干旱處理初期的抗旱能力低于野生型。因此,轉(zhuǎn)基因擬南芥在遭受干旱脅迫一段時間后能夠激活其他的抗旱途徑。

綜上所述,CsRAC5轉(zhuǎn)基因擬南芥比野生型擬南芥對鹽脅迫和ABA處理更加敏感,無論是萌發(fā)率、成活率、根長均表現(xiàn)為野生型擬南芥較轉(zhuǎn)基因擬南芥更高,而轉(zhuǎn)基因擬南芥僅在干旱處理初期較野生型擬南芥更敏感,因此仍需進一步研究CsRAC5在植物中的抗旱性,如不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)基因擬南芥對干旱處理的響應。