林 辰，張心雅，馬偉燕，柯榮秦

(華僑大學(xué)醫(yī)學(xué)院，福建 泉州 362021)

基因表達(dá)是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，具有廣泛的時(shí)空異質(zhì)性.傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)NA的表達(dá)量平均化，忽略了細(xì)胞群體內(nèi)不同細(xì)胞之間基因表達(dá)的異質(zhì)性[1].單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)解決了這一問題，它能夠獨(dú)立地提供每個(gè)細(xì)胞的RNA表達(dá)譜，區(qū)分出細(xì)胞之間的基因表達(dá)差異，并鑒定出異質(zhì)細(xì)胞群中的稀有細(xì)胞[2-3].盡管單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)極大地?cái)U(kuò)展了人們對(duì)細(xì)胞群體異質(zhì)性的認(rèn)識(shí)，但是進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序需要將細(xì)胞從組織中解離，從而導(dǎo)致細(xì)胞空間位置信息的丟失[4].而細(xì)胞的空間位置信息預(yù)示著細(xì)胞之間可能存在相互作用，而這又與生理和病理功能緊密相關(guān)，因此有必要將基因表達(dá)與空間位置信息聯(lián)系在一起[5].在這種需求的驅(qū)動(dòng)下，Joakim Lundeberg課題組于2016年首次提出了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的概念，發(fā)表了第一個(gè)基于原位捕獲RNA的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)[6].此后，一系列能夠進(jìn)行高通量原位RNA檢測(cè)分析的技術(shù)都被歸為空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的范疇.盡管這些技術(shù)的原理不盡相同，但都有一個(gè)共同點(diǎn)，即記錄所檢測(cè)RNA分子的空間位置信息.本文對(duì)空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的發(fā)展進(jìn)行介紹，總結(jié)并比較不同技術(shù)之間的優(yōu)缺點(diǎn)，舉例說明空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在不同研究領(lǐng)域的應(yīng)用，最后討論其所面臨的挑戰(zhàn)并展望其發(fā)展趨勢(shì).

1 空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的分類

現(xiàn)有的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在可檢測(cè)的基因數(shù)量和可測(cè)定的組織大小方面差異很大，可以分為兩大類：一類是基于原位捕獲和測(cè)序的方法，在測(cè)序之前通過原位捕獲將空間位置信息編碼到轉(zhuǎn)錄本上，之后通過高通量測(cè)序獲得轉(zhuǎn)錄本及其空間位置信息；另一類是基于成像的方法，即在RNA的原始位置對(duì)其進(jìn)行染色編碼，實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè).

1.1 基于原位捕獲和測(cè)序的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)

為了解決單細(xì)胞RNA測(cè)序丟失細(xì)胞空間位置信息的問題，2016年，Joakim Lundeberg課題組展示了一種利用引物微陣列進(jìn)行原位RNA表達(dá)分析的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)(下文簡稱ST技術(shù))[6].該文首次介紹了利用帶有空間標(biāo)簽序列的引物微陣列原位捕獲轉(zhuǎn)錄本，從而保留轉(zhuǎn)錄本位置信息的方法.其基本原理如圖1所示：將組織切片貼于帶有空間位置信息標(biāo)簽序列的多聚T堿基引物微陣列芯片上，通過蘇木精-伊紅染色法對(duì)組織進(jìn)行染色并拍照記錄組織的形態(tài)；接著對(duì)組織進(jìn)行透化處理及原位逆轉(zhuǎn)錄，獲得帶有空間位置信息的互補(bǔ)DNA(complementary DNA,cDNA)；最后通過二代測(cè)序獲得基因序列并解碼空間位置信息標(biāo)簽，通過與組織形態(tài)聯(lián)合分析就可以得到該組織的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù).利用該技術(shù)，他們對(duì)小鼠嗅球組織中的RNA進(jìn)行測(cè)序，獲得了組織切片上完整的基因空間表達(dá)圖譜.2018年，10x Genomics收購了該技術(shù)，并推出Visium芯片技術(shù)，與最初的方案相比，進(jìn)一步提高了空間分辨率和靈敏度，并且成為一種被廣泛接受的商品化空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，應(yīng)用于生物學(xué)不同領(lǐng)域.

圖1 基于原位捕獲和測(cè)序的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的基本原理

通過圖1所示的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)基本原理可知，實(shí)現(xiàn)空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的關(guān)鍵在于對(duì)空間位置信息的保留.因此，利用不同的方法構(gòu)建帶有空間位置信息的引物微陣列芯片是此類技術(shù)的核心步驟.Slide-seq是繼ST技術(shù)之后發(fā)表的第二個(gè)基于原位捕獲和測(cè)序的高通量空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)[7-8].在Slide-seq中，大量直徑為10 μm的帶有DNA標(biāo)簽引物的微球首先被平鋪于芯片的表面，通過二代測(cè)序方法SoLiD(sequencing by oligonucleotide ligation and detection)技術(shù)原位獲得每個(gè)微球的空間DNA標(biāo)簽序列；然后將組織切片貼附于帶有這些微球的芯片表面，采用組織透化技術(shù)釋放樣品中的RNA進(jìn)行原位逆轉(zhuǎn)錄，在芯片表面獲得帶有空間位置標(biāo)簽序列的cDNA；這些cDNA再通過建庫和二代測(cè)序可以推斷出所檢測(cè)RNA的空間位置信息，從而獲得組織的空間基因表達(dá)圖譜.與ST技術(shù)中引物微陣列的引物點(diǎn)相比，Slide-seq的微球直徑更小，因此大大提高了分辨率和靈敏度，達(dá)到對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行空間定位的水平.為了達(dá)到更高的分辨率以實(shí)現(xiàn)對(duì)單細(xì)胞的定位和分析，Vickovic等[9]提出了高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)(high-definition spatial transcriptomics,HDST)技術(shù).HDST技術(shù)使用類似于Slide-seq的方法來提高分辨率，不同的是該技術(shù)將帶有空間位置標(biāo)簽的微球放置于芯片表面的微孔內(nèi)；而這些微球直徑只有2 μm，理論上來說能夠提供比Slide-seq更高的空間分辨率.Seq-Scope技術(shù)是一種基于Illumina測(cè)序平臺(tái)的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，該技術(shù)通過橋式PCR在捕獲芯片的表面生成一系列帶有隨機(jī)標(biāo)簽的引物簇[10].通過成像和測(cè)序獲取引物簇的序列及空間位置信息后，利用這些引物簇捕獲組織中的RNA并轉(zhuǎn)錄為待測(cè)序的cDNA.該方法可獲得0.5～0.8 μm分辨率的引物簇，進(jìn)一步提高了空間分辨率，達(dá)到單細(xì)胞甚至是亞細(xì)胞的分辨率水平.除此之外，Pixel-seq[11]和Stereo-seq[12]是最近報(bào)道的兩種基于捕獲的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù).其中Pixel-seq是利用類似于Seq-Scope技術(shù)的原理，通過橋式PCR獲得具有空間分辨率和空間標(biāo)簽的引物簇[11].Stereo-seq是華大基因所開發(fā)的技術(shù)，該方法基于華大基因所特有的DNA納米球(DNA nanoball,DNB)測(cè)序芯片，將帶有隨機(jī)序列的DNB置于芯片上測(cè)序獲得位置及標(biāo)簽序列后，這些DNB再接上多聚T堿基尾巴作為引物用于捕獲信使RNA(messenger RNA,mRNA)，后續(xù)測(cè)序步驟與其他方法類似[12].Stereo-seq的特點(diǎn)在于利用DNB芯片的規(guī)則陣列以及DNB的微小尺寸實(shí)現(xiàn)高分辨率的空間RNA捕獲，并且擁有較大的整體捕獲面積，達(dá)到厘米級(jí)別的大視野空間轉(zhuǎn)錄組分析水平.

上述方法都是基于原位轉(zhuǎn)錄本捕獲并測(cè)序獲得組織的空間轉(zhuǎn)錄圖譜，其標(biāo)記空間信息的方法均是基于芯片表面的標(biāo)簽引物.2020年，Liu等[13]則采用了一種名為組織層面的條形碼編碼的空間組測(cè)序(deterministic barcoding in tissue for spatial omics sequencing,DBiT-seq)的微流控空間組測(cè)序方法.與其他方法不同，該技術(shù)并不將引物固定于芯片表面，而是通過兩個(gè)正交方向的微流控將引物引入組織表面，每個(gè)方向50個(gè)微通道，每個(gè)通道里引入不同的寡聚核苷酸序列進(jìn)行組合，從而形成2 500個(gè)標(biāo)簽編碼點(diǎn).通過這種方式獲得的每個(gè)標(biāo)簽編碼點(diǎn)的大小約10 μm，具有較高的空間分辨率.同時(shí)，他們利用帶有寡聚核苷酸標(biāo)簽的抗體對(duì)不同蛋白質(zhì)進(jìn)行空間定位和定量分析，實(shí)現(xiàn)了多組學(xué)基因表達(dá)空間圖譜的構(gòu)建.

總之，利用具有空間位置信息的DNA標(biāo)簽引物捕獲并標(biāo)記轉(zhuǎn)錄本的空間位置信息，是基于原位捕獲和測(cè)序的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的核心所在.

1.2 基于成像的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)

基于成像的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的本質(zhì)是RNA原位雜交，具體地說就是多重RNA原位雜交技術(shù).嚴(yán)格意義上，這一系列技術(shù)的起源都可以追溯到單分子RNA原位雜交技術(shù).早在1998年，F(xiàn)emino等[14]就利用標(biāo)記有多個(gè)熒光基團(tuán)的DNA探針與RNA分子進(jìn)行原位雜交，實(shí)現(xiàn)了對(duì)單分子RNA的原位檢測(cè).不僅如此，Levsky等[15]還在后續(xù)研究中利用顏色組合的方式，突破了光譜分辨的限制，實(shí)現(xiàn)了對(duì)11個(gè)基因的同時(shí)檢測(cè).Raj等[16]對(duì)該方法進(jìn)行改進(jìn)，通過將24～48條的單標(biāo)記探針雜交于同一個(gè)RNA分子上，實(shí)現(xiàn)了更加高效靈敏的單分子RNA原位雜交，并將此方法正式命名為單分子熒光原位雜交(single-molecule fluorescenceinsituhybridization,smFISH).Lubeck等[17]通過改變雜交于RNA分子上標(biāo)記探針的熒光標(biāo)簽的順序或者比例，利用高分辨顯微鏡進(jìn)行分辨，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)多種RNA分子的同時(shí)檢測(cè).以上方法均在同一輪成像中進(jìn)行不同種類RNA分子的原位多重檢測(cè)，因此能夠?qū)崿F(xiàn)的檢測(cè)通量比較有限.2013年，Ke等[18]首次發(fā)表了原位測(cè)序(insitusequencing，ISS)技術(shù)，提供了一種通過多輪成像實(shí)現(xiàn)顏色序列編碼的方法實(shí)現(xiàn)對(duì)不同種類的RNA進(jìn)行高度多重原位檢測(cè)的方案.其基本原理如圖2所示，即對(duì)同一個(gè)RNA分子在其原始位置進(jìn)行信號(hào)放大后利用不同的標(biāo)記探針進(jìn)行多次標(biāo)記成像，并通過高級(jí)圖形分析算法，將每一輪的顏色進(jìn)行配準(zhǔn)和標(biāo)注，得到一串顏色編碼標(biāo)簽，達(dá)到利用不同顏色順序檢測(cè)不同基因的目的，從而不受光譜和顯微鏡檢測(cè)通道數(shù)量的限制達(dá)到高度多重的RNA原位檢測(cè).

圖2 基于成像的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法的基本原理

ISS的具體做法是在固定的細(xì)胞或者組織中將RNA原位逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再將帶有4種堿基組成的基因特異DNA標(biāo)簽的鎖式探針與其目標(biāo)基因雜交并連接成環(huán)，通過滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circle amplification，RCA)獲得信號(hào)放大的RCA產(chǎn)物.為了解析不同RCA產(chǎn)物上的標(biāo)簽序列，Drmanac等[19]采用邊連接邊測(cè)序(sequencing by ligation，SBL)的二代測(cè)序技術(shù)對(duì)DNA標(biāo)簽的4種堿基進(jìn)行測(cè)序，結(jié)合圖形信息得到每個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物的標(biāo)簽序列，從而可以得知該擴(kuò)增產(chǎn)物所檢測(cè)的RNA種類.利用該方法，Ke等[18]展示了在乳腺癌冰凍切片組織中識(shí)別31個(gè)基因的空間表達(dá)圖譜.2016年，基于ISS技術(shù)成立了Cartana公司，正式將該技術(shù)商業(yè)化.2019年，10x Genomics公司收購了Cartana公司.

ISS技術(shù)基于鎖式探針特異識(shí)別和RCA進(jìn)行信號(hào)放大，并通過二代測(cè)序化學(xué)實(shí)現(xiàn)原位測(cè)序，由于其具有操作簡易和信號(hào)穩(wěn)定等特點(diǎn)，所以此后有多種技術(shù)基于鎖式探針和RCA發(fā)展而來.Wang等[20]報(bào)道了一種能夠?qū)崿F(xiàn)三維原位測(cè)序的STARmap技術(shù)，該技術(shù)能夠?qū)?60～1 020個(gè)基因?qū)崿F(xiàn)同時(shí)檢測(cè).STARmap技術(shù)也是基于鎖式探針來實(shí)現(xiàn)靶向原位測(cè)序的，與ISS技術(shù)不同的是其探針直接與RNA雜交，并通過輔助的領(lǐng)位雜交引物進(jìn)行成環(huán)步驟，省去了原始ISS技術(shù)中的逆轉(zhuǎn)錄步驟，這種成環(huán)模式的探針也稱為蝸牛探針.在RCA完成后，通過對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物上的氨基與N-羥基丁二酰亞胺反應(yīng)修飾后與丙烯酰胺一起聚合形成水凝膠，之后使用蛋白酶消化一些自發(fā)熒光的蛋白等使組織透明化，以降低測(cè)序中的熒光背景.STARmap還設(shè)計(jì)了一種糾錯(cuò)的連接測(cè)序方法以增加測(cè)序的準(zhǔn)確率，在多重改進(jìn)條件的保證下，實(shí)現(xiàn)了對(duì)0.1 mm厚的小鼠大腦皮層中上千個(gè)基因的原位檢測(cè)，展示了其作為三維原位測(cè)序技術(shù)的潛力.Liu等[21]報(bào)道的條形碼寡核苷酸多重原位分析(barcoded oligonucleotides ligated on RNA amplified for multiplexed and parallelinsituanalyses,BOLORAMIS)技術(shù)則直接以RNA為模板雜交，并利用能夠在RNA上連接DNA探針的連接酶SplintR連接鎖式探針成環(huán)，在RCA后采用SBL方法測(cè)得標(biāo)簽序列，可實(shí)現(xiàn)多重RNA原位檢測(cè).利用該方法在細(xì)胞系和共培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞上對(duì)多達(dá)96個(gè)基因的空間表達(dá)進(jìn)行了分析，然而卻缺少組織基因表達(dá)分析的數(shù)據(jù).

2013年，Ke等[18]除利用帶有標(biāo)簽的鎖式探針實(shí)現(xiàn)多重RNA原位檢測(cè)外，還介紹了一種利用帶有幾個(gè)堿基缺口的特殊鎖式探針(gap-fill padlock probe)來實(shí)現(xiàn)對(duì)RNA序列本身進(jìn)行測(cè)序的方法，并將該方法用于不同RNA序列的測(cè)序和稀有突變的檢測(cè).Chen等[22]對(duì)該方法進(jìn)行了優(yōu)化，開發(fā)了BaristaSeq技術(shù)，利用Phusion DNA聚合酶代替ISS中的Stoffel片段聚合酶，提高了缺口的補(bǔ)充效率，并利用和Illumina測(cè)序平臺(tái)相同的邊合成邊測(cè)序方法獲得了更穩(wěn)定的測(cè)序熒光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)更長的測(cè)序長度.與其他基于鎖式探針的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)不同的是，BaristaSeq技術(shù)并非用來檢測(cè)單個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)位置，而是檢測(cè)表達(dá)同一個(gè)由病毒引入細(xì)胞的RNA標(biāo)簽，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)細(xì)胞的編碼檢測(cè).此后，Chen等[23]在此基礎(chǔ)上又發(fā)展了BARseq技術(shù)，通過對(duì)不同細(xì)胞的標(biāo)簽進(jìn)行原位測(cè)序，獲得細(xì)胞的空間位置信息，實(shí)現(xiàn)了對(duì)小鼠大腦聽覺皮層中3 579個(gè)神經(jīng)元的連接圖譜繪制.

以上基于鎖式探針的原位測(cè)序技術(shù)可以認(rèn)為是靶向空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法.在2014年，Lee等[24]就開發(fā)了一種高通量原位測(cè)序方法，即熒光原位RNA測(cè)序(fluorescentinsituRNA sequencing,FISSEQ)，能夠非靶向地對(duì)轉(zhuǎn)錄組水平的RNA表達(dá)同時(shí)進(jìn)行定位分析.FISSEQ技術(shù)之所以能夠?qū)崿F(xiàn)非靶向RNA表達(dá)高通量原位分析，是因?yàn)槠渲苯訉⒛孓D(zhuǎn)錄獲得的所有cDNA通過單鏈DNA環(huán)化酶CircLigase進(jìn)行環(huán)化，并通過RCA信號(hào)放大后直接對(duì)RNA本身進(jìn)行測(cè)序，獲取RNA序列信息來判定不同的基因類型.然而，非靶向檢測(cè)與RCA信號(hào)放大會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物過多而產(chǎn)生光學(xué)擁擠效應(yīng)，并導(dǎo)致無法正確區(qū)分信號(hào)點(diǎn)，降低了檢測(cè)效率.最近開發(fā)的擴(kuò)展測(cè)序(expansion sequencing,ExSeq)技術(shù)使用擴(kuò)展顯微鏡解決了這個(gè)問題[25]，該技術(shù)利用可膨脹的水凝膠吸水膨脹后將含有擴(kuò)增產(chǎn)物的組織物理放大，從而增加信號(hào)點(diǎn)之間的距離，進(jìn)而提高了分辨率和檢測(cè)效率.

第二類基于成像的方法是在原位雜交技術(shù)基礎(chǔ)上，通過互補(bǔ)熒光探針的雜交來檢測(cè)目標(biāo)序列.2014年，Lubeck等[26]首次提出了連續(xù)單分子熒光原位雜交技術(shù)的概念，并采用該技術(shù)在固定的細(xì)胞中利用4種顏色編碼的熒光探針組進(jìn)行兩輪雜交，同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因，在兩輪雜交之間利用光漂白和DNA酶對(duì)上一輪的檢測(cè)探針進(jìn)行消化剝離及新一輪的探針雜交.2015年，Chen等[27]發(fā)表了同樣基于單分子熒光原位雜交的多重抗誤差熒光原位雜交(multiplexed error-robust fluorescenceinsituhybridization，MERFISH)技術(shù)，該技術(shù)可以鑒定單個(gè)細(xì)胞中數(shù)千種RNA的拷貝數(shù)和空間定位.MERFISH利用組合探針與連續(xù)成像等技術(shù)來提高檢測(cè)通量，并通過漢明碼糾錯(cuò)的二進(jìn)制條形碼來抵消單分子標(biāo)記檢測(cè)錯(cuò)誤.目前，MERFISH 已廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，從單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄本位置到組織水平的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)均展示出其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì).2016年，Shah等[28]結(jié)合雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(hybid chain reaction,HCR)進(jìn)行信號(hào)放大，正式將其連續(xù)單分子RNA熒光原位雜交技術(shù)命名為seqFISH(sequential fluorescenceinsituhybridization).該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)小鼠海馬體中249個(gè)基因的同時(shí)檢測(cè)，并通過基因表達(dá)聚類分析實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同類型細(xì)胞的原位鑒別.2019年，Xia等[29]則提出了與支鏈DNA技術(shù)相結(jié)合對(duì)MERFISH進(jìn)行信號(hào)放大的方法，證明在基因雜交探針較少的情況下信號(hào)放大具有一定的優(yōu)勢(shì)，不過使用更多對(duì)探針也能替代信號(hào)放大的效果.同年，Eng等[30]發(fā)表了seqFISH+技術(shù)，該技術(shù)采用和MERFISH相似的探針設(shè)計(jì)策略和超分辨成像，不同的是該技術(shù)使用了3個(gè)成像通道，經(jīng)過20次反復(fù)雜交獲得60個(gè)假單色進(jìn)行編碼.由于每個(gè)通道的20種假單色經(jīng)過3輪解碼可以獲得203(8 000)種基因編碼，所以3個(gè)通道就可以編碼24 000種基因.通過該方法，他們?cè)趤喖?xì)胞分辨率下實(shí)現(xiàn)了對(duì)1萬個(gè)基因的空間表達(dá)分析.

2020年，Goh等[31]提出改良型RNA單分子熒光原位雜交技術(shù)并命名為split-FISH.該技術(shù)主要是在RNA與檢測(cè)探針之間引入了一對(duì)編碼探針，當(dāng)編碼探針與目標(biāo)基因雜交后靠近，橋接探針與兩條編碼探針的3’-端和5’-端雜交結(jié)合后再與檢測(cè)探針結(jié)合，保證了特異性.通過與MERFISH相同的雜交編碼方法，split-FISH實(shí)現(xiàn)了對(duì)317個(gè)基因的同時(shí)檢測(cè).與通過編碼方式實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)的方法不同，Codeluppi等[32]開發(fā)的循環(huán)單分子熒光原位雜交技術(shù)(cyclic single-molecule fluorescentinsituhybridization,osmFISH)技術(shù)是直接在每一輪雜交中利用不同的熒光標(biāo)記和檢測(cè)通道只檢測(cè)3種基因，利用多輪雜交來實(shí)現(xiàn)更多的基因檢測(cè)；他們經(jīng)過13輪雜交，檢測(cè)了小鼠軀體感覺皮質(zhì)層中33種基因的表達(dá)，通過基因表達(dá)模式區(qū)分并定位了不同類型的細(xì)胞.組織上的單細(xì)胞分辨率的原位雜交(single cell resolutioninsituhybridization on tissues,SCRINSHOT)技術(shù)[33]則是先通過RCA對(duì)RNA信號(hào)進(jìn)行放大后，采用類似osmFISH的多輪不相關(guān)雜交方法，實(shí)現(xiàn)了多達(dá)29種基因的同時(shí)檢測(cè)分析.由于osmFISH和SCRINSHOT技術(shù)對(duì)不同雜交輪次之間的信號(hào)不進(jìn)行關(guān)聯(lián)配準(zhǔn)分析，所以它們之間互不影響，避開了由于光學(xué)擁擠產(chǎn)生的信號(hào)識(shí)別問題，對(duì)高表達(dá)基因具有更好的檢測(cè)效果.

綜上所述，現(xiàn)有的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)泛指一類能夠?qū)崿F(xiàn)高度多重RNA原位檢測(cè)的新型轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)，通過將基因表達(dá)信息與組織形態(tài)學(xué)信息聯(lián)系在一起，為準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)基因功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供更多的支持信息.然而，這些技術(shù)往往具有不同的檢測(cè)通量和分辨率等，研究人員需要根據(jù)不同的目標(biāo)進(jìn)行合理的選擇.表1對(duì)一些主要的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的特點(diǎn)進(jìn)行了總結(jié).

表1 不同空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的特點(diǎn)

1.3 其他的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)

除利用上述方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)基因表達(dá)位置信息的記錄外，還可以利用切割的方法對(duì)組織進(jìn)行空間基因表達(dá)分析.激光捕獲顯微切割(laser capture microdissection，LCM)[35]可以對(duì)組織切片中感興趣的區(qū)域進(jìn)行切割捕獲，分離得到的小組織塊可以進(jìn)行包括轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在內(nèi)的多組學(xué)分析，獲得其含有空間位置信息的基因表達(dá)譜等.在Tomo-seq技術(shù)[36]中，冰凍的組織被連續(xù)切片后對(duì)每個(gè)切片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，得到具有空間位置信息的基因表達(dá)圖譜.Geo-seq技術(shù)[37]則是將組織切割成小塊，對(duì)每個(gè)小塊進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，利用小組織塊的位置信息重構(gòu)三維基因表達(dá)圖譜.雖然Tomo-seq和Geo-seq技術(shù)可以獲得三維空間表達(dá)圖譜，但是空間分辨率較低；而LCM雖然能夠獲得高分辨率區(qū)域基因表達(dá)譜，但是其分析通量很低.與其他空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)相比，基于切割的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)都存在步驟繁瑣、不易操作的問題.

2 空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用

空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)提供的基因表達(dá)的空間位置信息能夠用于建立組織細(xì)胞的空間圖譜，具有重要的參考價(jià)值.經(jīng)過短短幾年的發(fā)展，現(xiàn)有的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、腫瘤生物學(xué)等領(lǐng)域[38-40].

2.1 在神經(jīng)生物學(xué)中的應(yīng)用

神經(jīng)科學(xué)中的一個(gè)主要挑戰(zhàn)是如何系統(tǒng)地了解腦細(xì)胞類型及其在組織中的定位，并解析其工作機(jī)制.空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)可以將腦細(xì)胞類型與形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和連接性相關(guān)的功能學(xué)聯(lián)系起來，從而全面了解腦神經(jīng)回路[41].雖然利用單細(xì)胞測(cè)序能夠?qū)δX組織中不同類型的細(xì)胞進(jìn)行分型和定義，但是由于獲得的單細(xì)胞已經(jīng)從組織解離，所以無法準(zhǔn)確定位這些細(xì)胞的微環(huán)境，不利于后續(xù)的細(xì)胞功能分析.Codeluppi等[32]將小鼠細(xì)胞體感區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志基因結(jié)合osmFISH技術(shù)對(duì)這些細(xì)胞類型進(jìn)行空間定位.Qian等[34]采用在原有ISS技術(shù)基礎(chǔ)上開發(fā)的pciSeq技術(shù)，通過檢測(cè)已有單細(xì)胞數(shù)據(jù)篩選出來的標(biāo)志基因，對(duì)小鼠海馬區(qū)CA1中的抑制性神經(jīng)元以及不同類群的錐體細(xì)胞進(jìn)行定位.Moffitt等[42]結(jié)合單細(xì)胞RNA測(cè)序和MERFISH技術(shù)創(chuàng)建了小鼠下丘腦視前區(qū)的空間轉(zhuǎn)錄細(xì)胞圖譜，繪制了約100萬個(gè)細(xì)胞的輪廓，鑒定了約70個(gè)具有不同神經(jīng)調(diào)節(jié)特征和空間組織特征的神經(jīng)元群體，該方法為在不同組織和生物體中構(gòu)建細(xì)胞圖譜開辟了一條新的途徑.Chen等[43]同樣運(yùn)用單細(xì)胞RNA測(cè)序與MERFISH結(jié)合的方法，系統(tǒng)地解析了小鼠伏隔核腦區(qū)的細(xì)胞類型，區(qū)分出D1中型多棘GABAergic神經(jīng)元、D2中型多棘GABAergic神經(jīng)元和中間神經(jīng)元等主要細(xì)胞類型，并將其分為多種亞型；接著利用MERFISH技術(shù)確定了這些神經(jīng)元亞型在伏隔核腦區(qū)不同位置的空間分布，構(gòu)建了小鼠伏隔核細(xì)胞空間圖譜，為伏隔核結(jié)構(gòu)與功能的研究奠定了良好的基礎(chǔ).Yu等[44]利用單細(xì)胞測(cè)序以及ISS技術(shù)對(duì)人腦發(fā)育過程中的中間神經(jīng)元起源和多樣性進(jìn)行探究，系統(tǒng)地揭示了人類胚胎大腦不同發(fā)育階段中間神經(jīng)元的起源和特異分子標(biāo)記；其中ISS技術(shù)對(duì)基因表達(dá)的定位起關(guān)鍵作用.Rodriques等[7]利用其開發(fā)的Slide-seq技術(shù)將單細(xì)胞RNA測(cè)序確定的細(xì)胞類型在小腦和海馬體內(nèi)進(jìn)行定位，表征小鼠小腦浦肯野層的基因空間表達(dá)模式，并展示了創(chuàng)傷性腦損傷小鼠模型中細(xì)胞類型特異性反應(yīng)的時(shí)間演變.Maynard等[45]選擇人背外側(cè)前額葉皮層(dorsolateral prefrontal cortex,DLPFC)中一個(gè)與許多神經(jīng)精神疾病有關(guān)的大腦區(qū)域進(jìn)行Visium空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，繪制DLPFC中基因表達(dá)的層狀圖譜，并利用已發(fā)表的大規(guī)模snRNA-seq(single nuclei RNA sequencing)研究的數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，確定了已知的精神分裂癥和自閉癥相關(guān)基因的空間分布模式，從而提出了精神分裂癥遺傳易感性的機(jī)制.

利用單獨(dú)的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)也能對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)中的不同細(xì)胞類型進(jìn)行鑒定和定位.Yao等[46]使用MERFISH技術(shù)分析了小鼠初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層中的約30萬個(gè)細(xì)胞，識(shí)別了95個(gè)神經(jīng)元和非神經(jīng)元細(xì)胞簇，發(fā)現(xiàn)不僅是興奮性神經(jīng)元簇，大多數(shù)抑制性神經(jīng)元簇也都有分層組織，構(gòu)建了一個(gè)復(fù)雜的空間細(xì)胞圖譜.Eng等[30]采用seqFISH+技術(shù)對(duì)小鼠腦室下皮層和嗅球中的1萬個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)其中2 963個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了空間定位.不同空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的組合也有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，例如Chen等[47]將ST與ISS技術(shù)相結(jié)合，研究阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)淀粉樣斑塊周圍直徑100 μm的組織結(jié)構(gòu)域的基因表達(dá)變化，揭示了富含髓鞘和少突膠質(zhì)細(xì)胞基因的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的早期改變，以及斑塊誘導(dǎo)基因的多細(xì)胞基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，為AD和其他腦部疾病的研究提供了新的思路.

2.2 在發(fā)育生物學(xué)中的應(yīng)用

構(gòu)成復(fù)雜生命體組織或器官的細(xì)胞都是由多功能干細(xì)胞或者祖細(xì)胞分化而來的，在胚胎發(fā)育的早期，細(xì)胞根據(jù)生長發(fā)育的需要分化為特定細(xì)胞，這些細(xì)胞的分化軌跡和發(fā)育譜系及其在組織中的空間定位對(duì)組織器官的正常發(fā)育至關(guān)重要[48-49].van den Brink等[50]使用單細(xì)胞RNA測(cè)序和ST技術(shù)比較了小鼠原腸胚和胚胎，在原腸胚中鑒定了以前未知的胚胎細(xì)胞類型，并發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子在胚胎和原腸胚之間具有許多相似的地方.Fawkner-Corbett等[51]通過對(duì)來自17例胚胎的77個(gè)樣本進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序，并對(duì)來自5個(gè)樣本的8張切片進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，探究腸道發(fā)育的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，通過一系列的生物信息學(xué)分析，鑒定了腸道發(fā)育過程中的101種細(xì)胞類型，繪制了其發(fā)育的空間圖譜.該研究揭示了腸道發(fā)育的一些關(guān)鍵事件，如上皮隱窩-絨毛的形成原理，確定了發(fā)育中的成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞亞型的分化層次和功能、血管的擴(kuò)張、免疫定植和腸道相關(guān)淋巴樣組織的形成等.Asp等[52]采集了妊娠早期3個(gè)階段(孕4.5～5.0周，6.5周和9.0周)的心臟組織樣本，采用單細(xì)胞測(cè)序結(jié)合ST和ISS技術(shù)繪制了心臟發(fā)育過程中基因表達(dá)的時(shí)空?qǐng)D譜.ST與ISS技術(shù)聯(lián)合確定了發(fā)育過程中不同的解剖區(qū)域特異的基因表達(dá)譜，而單細(xì)胞RNA測(cè)序則幫助鑒定了細(xì)胞的類型，并通過聯(lián)合分析映射到特定的解剖區(qū)域，最終構(gòu)建了妊娠早期3個(gè)階段心臟發(fā)育的三維可視化轉(zhuǎn)錄圖譜.這些研究均展示了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對(duì)發(fā)育過程中基因表達(dá)的時(shí)空特異性分析和細(xì)胞的定位具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，能夠?yàn)槠浞肿訖C(jī)制的研究提供關(guān)鍵信息.

2.3 在腫瘤生物學(xué)中的應(yīng)用

異質(zhì)性是惡性腫瘤的主要特征之一，與癌癥的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移侵襲以及預(yù)后治療等密切相關(guān).空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)能夠直接觀測(cè)到不同組織區(qū)域基因表達(dá)的異質(zhì)性，因此非常適用于腫瘤組織的異質(zhì)性研究.Ke等[18]最早利用ISS技術(shù)觀測(cè)到乳腺癌組織中31個(gè)基因表達(dá)的異質(zhì)性；Svedlund等[53]在此基礎(chǔ)上，利用ISS技術(shù)對(duì)乳腺癌組織中91個(gè)基因的表達(dá)進(jìn)行分子與形態(tài)學(xué)的聯(lián)合分析，構(gòu)建出腫瘤地圖，揭示了與腫瘤亞型關(guān)聯(lián)的腫瘤內(nèi)部異質(zhì)性并觀測(cè)到含有少數(shù)細(xì)胞亞群的區(qū)域；此外，ISS技術(shù)還被應(yīng)用于稀有突變以及基因融合的原位檢測(cè)[54].Berglund等[55]利用ST技術(shù)對(duì)前列腺癌的6 750個(gè)區(qū)域進(jìn)行分析，利用反卷積方法提取特異的基因表達(dá)譜，揭示了在前列腺癌中健康與腫瘤組織基因表達(dá)的變化，并在腫瘤區(qū)域周圍發(fā)現(xiàn)了與腫瘤微環(huán)境重分層相關(guān)的基質(zhì)區(qū)基因表達(dá)的梯度.Sun等[56]利用ST技術(shù)研究缺氧狀態(tài)下胰腺導(dǎo)管癌的異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)缺氧使得腫瘤細(xì)胞類群從對(duì)照組中的9個(gè)減少為7個(gè)，并對(duì)其微環(huán)境中的特異基因表達(dá)進(jìn)行了分析.

此外，單細(xì)胞測(cè)序與空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)相結(jié)合也是揭示腫瘤異質(zhì)性的重要手段.Wu等[57]開發(fā)了一種固有亞型分類SCSubtype的單細(xì)胞分析方法，揭示了復(fù)發(fā)性乳腺癌腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，結(jié)合ST技術(shù)的分析表明不同臨床亞型的相關(guān)細(xì)胞簇在空間上相互排斥.Moncada等[58]將來自胰腺導(dǎo)管癌患者的同一腫瘤組織的樣本分布進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，利用多模態(tài)交叉分析將癌細(xì)胞狀態(tài)映射到不同的空間組織區(qū)域，解析它們與其他類型細(xì)胞的相互作用.Ji等[59]將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)進(jìn)一步結(jié)合多路復(fù)用離子束成像技術(shù)，對(duì)一系列人皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cutaneous squamous cell carci-nomad,cSCC)與匹配的正常皮膚組織進(jìn)行比較分析，鑒定了cSCC的4種腫瘤細(xì)胞亞群，包括1種癌癥特有的腫瘤特異角化細(xì)胞(tumor specific keratinocytes,TSK)和3種與正常組織相同的細(xì)胞群，并且TSK細(xì)胞是細(xì)胞通訊的中心.

2.4 在其他方面的應(yīng)用

除了神經(jīng)科學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域之外，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)在其他多個(gè)領(lǐng)域的研究中也開始嶄露頭角.Carlberg等[60]利用Visium空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)和脊柱關(guān)節(jié)炎(spinal arthritis,SpA)患者的滑膜組織進(jìn)行建庫測(cè)序，通過對(duì)差異表達(dá)基因的功能和通路進(jìn)行分析，揭示了RA與適應(yīng)性免疫應(yīng)答相關(guān)，而SpA與細(xì)胞外基質(zhì)及軟骨損傷修復(fù)過程相關(guān).Boyd等[61]利用ST技術(shù)對(duì)肺損傷的相關(guān)基因進(jìn)行空間定位，為研究病毒感染導(dǎo)致肺損傷的機(jī)制提供了新的視角.Desai等[62]利用 NanoString 公司的 GeoMx空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對(duì)新冠病毒感染者的肺部組織進(jìn)行分析，揭示了病毒感染過程中不同部位受到的不同影響，剖析了新冠病毒在肺部感染組織中引起的免疫反應(yīng)存在異質(zhì)性.在腫瘤免疫學(xué)以及免疫治療方面，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)也是一種具有很大潛力的分析手段.例如Wu等[63]使用Visium平臺(tái)對(duì)7名患者的21個(gè)組織標(biāo)本進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果表明不同腫瘤區(qū)域(癌區(qū)、癌旁和前沿)的免疫細(xì)胞具有高度的多樣性和異質(zhì)性，為腫瘤免疫治療的個(gè)性化設(shè)計(jì)提供了參考信息.空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)除應(yīng)用于動(dòng)物組織外，還在植物組織上進(jìn)行了嘗試[64]；但是植物組織與動(dòng)物組織的細(xì)胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)上有很大的差異，因此需要更多的優(yōu)化和處理以保證更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[65].可以預(yù)見，隨著時(shí)間的推移空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)將會(huì)在不同的領(lǐng)域繼續(xù)擴(kuò)大應(yīng)用.

3 空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)存在的挑戰(zhàn)和機(jī)遇

空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的出現(xiàn)讓人們以一種前所未有的視角觀察基因的表達(dá)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，使人們對(duì)其功能機(jī)制有了更深入的了解[66].空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)已經(jīng)逐漸成為一項(xiàng)被廣泛接受的組學(xué)研究新手段，然而當(dāng)前空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)仍然面臨許多挑戰(zhàn).尤其是在實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)仍然有待改進(jìn).

首先，目前的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)大多數(shù)是基于薄的組織切片，獲得的是基因在二維空間的表達(dá)情況，仍然無法實(shí)現(xiàn)真正的三維空間轉(zhuǎn)錄組.近期Bergenstr?hle等[67]在BMCGemoimcs雜志上發(fā)表了一篇探索性文章，利用連續(xù)組織切片進(jìn)行二維空間基因表達(dá)分析，然后采用生物信息學(xué)工具STUtility，將獲得的二維基因表達(dá)圖譜進(jìn)行重構(gòu)得到三維基因表達(dá)圖譜.然而該方法仍然存在過程復(fù)雜、無法保證切片質(zhì)量以及難以獲得完美三維結(jié)構(gòu)等問題，因此是一種折中的辦法.由此可見，基于原位捕獲和測(cè)序的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)存在如何捕獲三維位置信息的問題，而這個(gè)問題可能需要革命性技術(shù)才能夠真正解決.而基于成像的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)由于具有真正在原位進(jìn)行檢測(cè)的特點(diǎn)，所以在三維空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)方面有一定的優(yōu)勢(shì)和潛力.理論上來說，只要能夠?qū)π盘?hào)點(diǎn)進(jìn)行三維原位成像，獲得其位置信息并進(jìn)行解碼，便可以獲得三維轉(zhuǎn)錄圖譜.然而，有幾個(gè)主要的技術(shù)性問題需要解決，包括如何能夠使組織透明化以對(duì)組織內(nèi)部的信號(hào)進(jìn)行成像[68]，如何使成像探針和一些方法所需要的酶分子等進(jìn)入組織內(nèi)部進(jìn)行反應(yīng)，以及如何有效地進(jìn)行三維成像的大數(shù)據(jù)分析等.STARmap技術(shù)就是利用水凝膠和組織透明化技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了在0.1 mm厚度的小鼠腦組織切片上的三維基因表達(dá)分析[20].雖然與常規(guī)的顯微切片幾微米級(jí)的厚度相比已經(jīng)有數(shù)量級(jí)的增加，并且提供了第三維度的空間信息，但是相對(duì)于全腦的尺寸仍然有很大的差距.ExSeq技術(shù)也利用組織透明化技術(shù)[25]，并同時(shí)引入擴(kuò)展顯微技術(shù)，進(jìn)一步提高了空間分辨率，實(shí)現(xiàn)了三維空間轉(zhuǎn)錄組圖譜的構(gòu)建.

其次，目前的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在單細(xì)胞層面的分辨率和基因檢測(cè)效率仍然不如普通的單細(xì)胞RNA測(cè)序[69].總體來說，基于原位捕獲和測(cè)序的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)擁有較高的基因數(shù)目檢測(cè)通量，但單細(xì)胞或者亞細(xì)胞的空間分辨率較低；而基于成像的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)理論上來說具有更高的空間分辨率，但只有較低的基因數(shù)目檢測(cè)通量(表1).然而，兩者的單細(xì)胞基因數(shù)目檢測(cè)效率和分辨率與普通的單細(xì)胞RNA測(cè)序相比仍然存在差距.這是因?yàn)槠胀ǖ膯渭?xì)胞RNA測(cè)序具有更高的基因捕獲效率，幾乎可以無偏差捕獲不同基因的轉(zhuǎn)錄本，并且比較容易實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞之間的真正分離和分析；而基于原位捕獲和測(cè)序的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)存在捕獲點(diǎn)分辨率不同以及潛在的轉(zhuǎn)錄本擴(kuò)散等問題，難以很好地區(qū)分單細(xì)胞，基于成像的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)則由于光學(xué)擁擠等因素導(dǎo)致所能分辨的基因數(shù)量有限[32].因此，這些技術(shù)性問題仍然是現(xiàn)有空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)需要進(jìn)一步克服的.

再者，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)的分析以及空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的建立仍然有待開發(fā)和完善.空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)分析的主要目的是將帶有位置信息的基因表達(dá)原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為有用的生物學(xué)信息，如細(xì)胞的空間定位和細(xì)胞之間的通訊等[70].空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)中最重要的數(shù)據(jù)是基因表達(dá)的位置信息，而將這些基因表達(dá)數(shù)據(jù)定位到組織中的單細(xì)胞水平是目前研究者最關(guān)注的問題，因?yàn)檫@是實(shí)現(xiàn)對(duì)組織中不同類型的細(xì)胞進(jìn)行分型和定位的基礎(chǔ).然而，現(xiàn)有的商業(yè)化空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)如10x Genomics的Visium以及NanoString的GeoMx技術(shù)均未能達(dá)到單細(xì)胞的分辨率，因此只能依靠生物信息學(xué)算法來實(shí)現(xiàn)對(duì)部分區(qū)域內(nèi)細(xì)胞類型的預(yù)測(cè)[70].而在基于成像的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)中，還可以利用標(biāo)志基因來確定細(xì)胞類型[71].基于成像的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)依賴于對(duì)細(xì)胞的正確劃分，即如何找到細(xì)胞邊界去確定RNA分子歸屬的細(xì)胞.對(duì)于高表達(dá)的基因或者檢測(cè)效率較高的成像技術(shù)來說，比較容易實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的劃分[32]，而對(duì)于一些檢測(cè)效率較低的技術(shù)(如ISS)，則需要通過單細(xì)胞測(cè)序獲得的標(biāo)志物基因作為參考，并通過概率算法確定RNA分子歸屬的細(xì)胞，再依據(jù)表達(dá)譜確定細(xì)胞類型[34].除此之外，一些新的算法也有助于分辨圖形中的單細(xì)胞及其相關(guān)的基因表達(dá)信號(hào)[72].一般來說，當(dāng)細(xì)胞被正確定位和分型后，下游的分析相對(duì)來說比較容易.盡管當(dāng)前空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)在快速地增長，但尚未有對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)庫來對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總集成.為了方便研究者的使用，這樣的數(shù)據(jù)庫應(yīng)該具備交互式訪問界面以及較為全面的數(shù)據(jù)等.然而，目前這樣的網(wǎng)站并不多，且現(xiàn)有網(wǎng)站也存在數(shù)據(jù)有限等問題[73].

總之，經(jīng)過短短幾年的發(fā)展，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)已經(jīng)發(fā)展成一個(gè)具有多種技術(shù)解決方案且能夠提供不同精度基因表達(dá)空間信息的新的組學(xué)研究手段.空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)與其他組學(xué)技術(shù)相結(jié)合，將有助于人們更好地了解組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞群體之間的位置信息及其交流通訊網(wǎng)絡(luò)，為更好地理解組織器官甚至整個(gè)生命體如何工作提供了有力的工具.未來的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)將朝著更高的空間分辨率、更好的自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)流程以及數(shù)據(jù)分析流程發(fā)展，并且實(shí)驗(yàn)成本有望進(jìn)一步下降.