李 眾，張鏡明，李盛英，張 偉

(山東大學微生物技術(shù)國家重點實驗室(微生物技術(shù)研究院)，山東 青島 266237)

海洋作為地球上最廣闊的水體，占地球表面積的71%，蘊藏極其豐富的礦產(chǎn)和生物資源，其中大部分(超過95%)為水深超過200 m的黑暗、缺氧、寡營養(yǎng)、高壓、高鹽、低溫或高溫(熱泉)的深海環(huán)境[1-3].盡管深海屬于極端生境，但深海生態(tài)系統(tǒng)蘊藏了豐富的生物多樣性，如深海海綿、珊瑚、藻類等動植物以及數(shù)以萬計的微生物.為了適應嚴苛的深海生態(tài)系統(tǒng)，在長期進化過程中，深海生命獲得了顯著不同于其他生境(如陸地和近淺海)生命形式的特殊遺傳背景、新穎生理代謝途徑和化學防御策略.這些獨特的生命特征和生命活動過程賦予了深海生物產(chǎn)生天然產(chǎn)物的化學結(jié)構(gòu)、生物活性和生物合成過程的復雜性和新穎性[2,4-5].

天然產(chǎn)物是動植物和微生物等生物產(chǎn)生的有機化合物的統(tǒng)稱，其數(shù)量龐大，結(jié)構(gòu)豐富，生物學功能多樣，包括蛋白質(zhì)、糖類、脂肪酸類、萜類、多肽類和生物堿等結(jié)構(gòu)類型，被廣泛地應用于人類生產(chǎn)生活的方方面面[6-7].自Alexander Fleming從青霉菌(Penicilliumsp.)中發(fā)現(xiàn)青霉素(penicillin)以來，微生物天然產(chǎn)物吸引了藥學家和化學家的濃厚興趣，且在過去的一個多世紀一直是研究熱點，如日本科學家Satoshimura和美國科學家William C.Campbell因從阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)中發(fā)現(xiàn)殺蟲農(nóng)藥阿維菌素(avermectin)榮獲2015年諾貝爾生理與醫(yī)學獎[8].微生物產(chǎn)生的具有豐富生物活性的天然產(chǎn)物是其進行化學防御、排除異己的重要“武器”，不僅為藥物研發(fā)提供了豐富的先導化合物來源，也是化學合成以及改造修飾的重要骨架資源.2020年，David J.Newman和Gordon M.Cragg撰文統(tǒng)計了1981—2019年間美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準上市的1 881個新藥，其中，約46%的藥物來源于天然產(chǎn)物及其衍生物，且以抗生素和抗腫瘤藥物為主[9].

面對腫瘤等惡性疾病發(fā)病率的提高、致病菌的耐藥性問題日趨嚴重、新型致病病毒的不斷出現(xiàn)等危害個人及公共衛(wèi)生安全的嚴峻考驗，人類對新型活性天然產(chǎn)物的需求更加迫切，科學家們也逐漸將目光投向深海微生物資源及其獨特的天然產(chǎn)物合成能力[5,10].目前，已發(fā)現(xiàn)的深海微生物來源的天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類型豐富，如萜類、聚酮類、非核糖體肽類及生物堿等；且具有多樣化的生物活性及顯著的藥用潛力，如抗真菌、抗細菌、抗腫瘤、抗瘧原蟲及抗病毒等[2,5].因此，海洋微生物作為海洋生物資源的重要組成部分，是海洋先導分子和新型藥物的重要來源，其在海洋藥物研發(fā)過程中具有重要地位.深海來源活性天然產(chǎn)物的獨特生物合成機制也吸引了科學家們的關(guān)注，以期闡明其生物合成過程，挖掘獲得新穎的酶學催化元件，為利用合成生物學技術(shù)對天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進行理性設計和改造、改善其藥學性質(zhì)、產(chǎn)生具有更好成藥性的“非天然”天然產(chǎn)物提供支持[11-12].

一般而言，微生物天然產(chǎn)物的生物合成主要分為3個階段：1)前體供應階段.微生物通過初級代謝或環(huán)境攝取獲得天然產(chǎn)物合成所需的骨架原料、能量和金屬離子，如氨基酸、丙二酸及其衍生物、還原型輔酶Ⅰ(reduced nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)、二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)和鎂離子等.2)骨架形成階段.前體物質(zhì)經(jīng)骨架合成酶的識別、激活、裝載后，通過連續(xù)縮合或環(huán)化過程形成相應天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類型的核心骨架，代表性的骨架合成酶有非核糖體肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetase，NRPS)、聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)、萜類合酶(terpene synthase，TS)等.3)后修飾階段.天然產(chǎn)物生物合成后修飾酶通過立體、區(qū)位選擇性地催化復雜天然產(chǎn)物的官能化反應，如氧化酶(細胞色素P450酶、黃素依賴型加氧酶、α-酮戊二酸依賴型雙加氧酶等)、糖基轉(zhuǎn)移酶、酰基化酶、甲基轉(zhuǎn)移酶、鹵化酶等，極大地拓寬了天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)復雜性和生物學功能多樣性.當然，也存在諸多修飾酶在骨架形成階段完成“線上修飾”，或在前體供應階段參與非天然氨基酸或脂肪酸等衍生物的生物合成[13].

參與天然產(chǎn)物生物合成后修飾途徑的諸多氧化酶中，細胞色素P450酶分布最為廣泛，功能最為吸引人.細胞色素P450酶為一類亞鐵血紅素-硫醇鹽蛋白超家族，因其還原態(tài)與一氧化碳結(jié)合后的紫外-可見光譜在450 nm處具有最大吸收值而得名[14-15].P450酶的血紅素鐵基團通過軸向保守半胱氨酸連接到脫輔基蛋白上，這是其特征光譜吸收的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ).自從P450作為一種色素從大鼠肝微粒體發(fā)現(xiàn)以來，關(guān)于P450酶的研究已有60余年的歷史[16].截至2021年10月，已有超過50萬個編碼P450酶的基因序列被UniProt數(shù)據(jù)庫收錄.且P450基因被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于人類、動物、植物、微生物甚至病毒中，展示了它們在自然界中的多樣性[17].P450酶具有催化反應類型和底物結(jié)構(gòu)類型多樣的特點，在天然產(chǎn)物生物合成、異源物質(zhì)降解、類固醇激素生物合成和藥物代謝等諸多方面扮演著重要角色[7,18-22](圖1).因此，開展對P450酶學及酶工程的研究，對于綠色可持續(xù)催化及應用具有重要的理論和實踐意義.

圖1 細胞色素P450酶的應用領(lǐng)域

P450酶被認為是萬能生物催化劑[23]，可在溫和條件下高選擇性地催化底物進行不同類型的氧化反應，除常見的羥基化、環(huán)氧化等反應類型外，還包括脫羧、N/O-脫烷基、硝基化、C—S成鍵、C—C偶聯(lián)及斷裂反應、螺環(huán)形成、C—N成鍵及C—N鍵去飽和等20多種非常規(guī)反應，極大地拓寬了天然產(chǎn)物的化學空間[7,20,22,24-25].此外，P450酶的底物結(jié)構(gòu)類型幾乎涵蓋了自然界中發(fā)現(xiàn)的所有天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類型，如萜類、聚酮類、脂肪酸、生物堿和多肽化合物等.由于大部分天然產(chǎn)物的化學骨架是由C—H鍵所構(gòu)筑形成的，P450酶能夠?qū)崿F(xiàn)對惰性C—H鍵的選擇性氧化活化，為改造天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及改善其水溶性、提供可修飾基團，進而改變其生物活性提供了重要選項和關(guān)鍵解決策略.

在P450酶的結(jié)構(gòu)、功能、酶工程改造等領(lǐng)域有許多出色的綜述總結(jié)[21,24]，本課題組長期從事P450酶學與酶工程研究，在該領(lǐng)域開展了具有重要推動作用的工作，例如：首次發(fā)現(xiàn)了P450酶催化功能的可塑性[26]，系統(tǒng)性地提出了P450氧化還原伴侶(redox partners)的選擇性準則[27]，提出CYP152家族催化機制新見解[28]，闡明了多種細菌、真菌P450酶在天然產(chǎn)物合成過程中的功能及催化機制[29-34].基于上述研究，本課題組先后撰寫了多篇P450酶與天然產(chǎn)物生物合成相關(guān)的綜述：曾在NaturalProductReports雜志上兩次以封面文章的形式闡述了負責微生物天然產(chǎn)物中常規(guī)及非常規(guī)反應的P450酶的來源、功能及催化機制[7,22]；系統(tǒng)概述了P450酶與微生物藥物創(chuàng)制[35]、P450酶催化系統(tǒng)的工程化改造及其在生物醫(yī)藥和生物技術(shù)領(lǐng)域中的應用[36]、P450酶的催化功能及其在生物合成和有機合成中的應用[37]；綜述了參與脂肪酸生物合成的P450酶學及酶工程的研究進展[38]；總結(jié)并展望了氧化還原伴侶與P450酶的相互作用及其對P450酶功能調(diào)控的重要作用[39].本文則聚焦于深海來源微生物天然產(chǎn)物生物合成中的P450酶，以期為深海來源的P450酶的發(fā)掘、工程化改造以及功能研究和潛在應用提供借鑒.

1 細胞色素P450酶的催化循環(huán)

一般而言，P450單加氧酶都需要氧化還原伴侶傳遞從NADH或還原型輔酶Ⅱ(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)獲得的2個電子到亞鐵血紅素反應中心實現(xiàn)氧分子的激活，其中一個氧原子參與形成一分子的產(chǎn)物水，另一個氧原子則修飾C—H鍵形成氧化基團.P450酶有一個共同的、復雜的催化循環(huán)過程，以典型的羥基化反應為例(如圖2所示，反應通式：R—H+O2+H++NAD(P)H→R—OH+NAD(P)++H2O)，概述P450酶的催化機制[36,40].首先，處于靜息態(tài)的P450酶(A)通常接受底物RH，RH取代活性部位的水分子，但不直接與鐵結(jié)合；與底物結(jié)合的高自旋配合物B的三價鐵FeⅢ被氧化還原伴侶傳遞來的一個電子還原為亞鐵FeⅡ(配合物C).隨后，一分子氧氣與FeⅡ結(jié)合形成[FeⅡO2]的復合物D，復合物D接收來自氧化還原伴侶傳遞來的第2個電子從而被還原為復合物E，復合物E從水溶液中獲得一個質(zhì)子生成[FeⅢ-OOH]的復合物F(Cpd 0)；Cpd 0的O—O鍵在獲得第2個質(zhì)子后異裂，釋放出一個水分子，生成含高價卟啉自由基陽離子四價鐵[FeⅣO]的復合物G(Cpd Ⅰ)；這種反應性極強的復合物G從底物中奪取一個氫原子，從而形成復合物H(CpdⅡ).接著，底物自由基與復合物H的羥基發(fā)生反應得到復合物I.最后，羥化產(chǎn)物ROH從復合物I中解離并且水分子重新與FeⅢ配位，P450酶恢復到靜息態(tài)A.當?shù)孜锓肿釉俅谓Y(jié)合到P450酶血紅素中心的活性位點時，重復啟動相同的催化循環(huán).值得一提的是，P450酶也可以利用過氧化氫作為電子供體從而走“捷徑”來形成Cpd 0，進一步形成CpdⅠ來完成底物催化.除依賴過氧化氫的P450過加氧酶(如CYP152家族)外，對于大多數(shù)P450單加酶來說，其對過氧化氫的耐受性差且過氧化氫途徑的催化效率低，限制了該策略在P450酶催化反應中的應用.

圖2 P450酶催化的C—H鍵選擇性氧化反應循環(huán)過程

2 深海微生物來源天然產(chǎn)物生物合成過程的P450酶

目前，已鑒定的深海微生物來源的P450酶，主要參與聚酮類、非核糖體肽類及聚酮-非核糖體肽雜合類天然產(chǎn)物的生物合成過程.其催化反應類型包括羥基化、環(huán)氧化、酮基化、硝基化、橋醚鍵構(gòu)筑、C—N成鍵反應等，展現(xiàn)了P450酶在深海活性天然產(chǎn)物的骨架構(gòu)筑、結(jié)構(gòu)修飾及活性提升中扮演著至關(guān)重要的角色.

2.1 聚酮類天然產(chǎn)物生物合成中的P450酶

聚酮類化合物(polyketide)是一種由模塊化的聚酮合酶生物合成得到的天然產(chǎn)物，是重要的微生物次級代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類型，具有抗腫瘤、降血脂、殺菌等生物活性[41-42].如來自土曲霉(Aspergillusterreus)的降血脂藥物洛伐他汀、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(紅霉素、利福霉素、泰樂菌素等)、免疫抑制劑(雷帕霉素和FK506)、殺蟲劑(阿維菌素和南昌霉素)、抗癌藥物(光輝霉素和多柔比星).聚酮類化合物骨架多樣性主要源于模塊式的Ⅰ型聚酮合酶、迭代式的Ⅱ型聚酮合酶和含可重復進行縮合反應的酮基合成酶結(jié)構(gòu)域的Ⅲ型聚酮合酶[41].值得一提的是，聚酮類化合物的生物合成過程中，往往存在P450酶催化反應的蹤影.

heronamide類化合物擁有獨特的膜結(jié)合能力，并且可能影響細胞形態(tài)[43-44].Zhu等[45]報道了分離自印度洋孟加拉灣的一株深海(3 412 m)鏈霉菌Streptomycessp.SCSIO 03032的聚酮類化合物heronamide F的生物合成基因簇及生物合成途徑.為了研究heronamide F生物合成基因簇中編碼P450酶的基因herO的功能，他們首先基于同源重組的策略構(gòu)建了herO的阻斷突變株，經(jīng)發(fā)酵和產(chǎn)物鑒定后發(fā)現(xiàn)其主要積累由8個Ⅰ型聚酮合酶(Her-A1A2BCDEFG)順序加載裝配、環(huán)化釋放的8-脫氧-heronamide F.為進一步驗證HerO的體外功能，他們將HerO與本課題組開發(fā)的來自紅球菌(Rhodococcussp.)NCIMB 9784的伴侶蛋白RhFRED融合得到HerO-RhFRED，在添加NADPH或NADH作為電子供體時，特異地催化8-脫氧-heronamide F的C-8位羥基化反應，得到heronamide F(圖3(a)).以上體內(nèi)外實驗證實，HerO是負責催化8-脫氧-heronamide F羥基化反應的關(guān)鍵氧化酶[45].

abyssomicin是一類結(jié)構(gòu)新穎的多環(huán)聚酮類化合物，具有豐富的藥理活性[46-47].從深海來源的鏈霉菌S.koyangensisSCSIO 5802中分離得到多個abyssomicin類化合物，如具有增強人淋巴中免疫缺陷病毒Ⅰ型復制的neoabyssomicin A和C[48]，抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的abyssomicin 2、neoabyssomicin F和G二聚體[49].通過全基因組測序、生物信息學分析、基因敲除及異源表達等手段，Tu等[50]初步完成了S.koyangensisSCSIO 5802中neoabyssomicin/abyssomicin生物合成基因簇的鑒定及生物合成機制推測：3個Ⅰ型聚酮合酶AbmB1～AbmB3負責C16的聚酮鏈的生物合成，進一步在AbmA1～AbmA5等作用下連接C3結(jié)構(gòu)單元并環(huán)化得到獨特的tetronate環(huán)；最終經(jīng)第爾斯-阿爾德反應、氧化反應得到含獨特橋醚環(huán)結(jié)構(gòu)的abyssomicin 2.

L-pip.L-(4-羥基化)六氫噠嗪酸.

除此之外，Zhang等[52]針對深海來源的橄欖鏈霉菌(S.olivaceus)SCSIO T05的全基因組分析發(fā)現(xiàn)了一條聚酮類化合物lobophorin CR4的生物合成基因簇，簇內(nèi)包含了一個可能參與其生物合成過程的P450基因lbpP1，但其具體的催化功能尚無相關(guān)生物信息學分析及實驗證據(jù).

2.2 非核糖體肽類天然產(chǎn)物生物合成中的P450酶

非核糖體肽類經(jīng)由一類模塊化的NRPS生物合成得到，其生物活性豐富，如抗菌劑(萬古霉素、短桿菌素、達托霉素、棘白霉素類藥物等)、免疫抑制劑環(huán)孢菌素、抗腫瘤藥物羅米地辛等[53].一個基本NRPS模塊主要由負責識別激活氨基酸的腺苷?；Y(jié)構(gòu)域(adenylation domain)、掛載肽鏈的肽酰載體蛋白結(jié)構(gòu)域(peptidyl carrier protein domain，PCP)和催化氨基酸之間形成肽鍵的縮合結(jié)構(gòu)域(condensation domain)組成[54-55].在非核糖體肽類天然產(chǎn)物生物合成過程中，既有負責修飾氨基酸前體產(chǎn)生非天然氨基酸的P450酶，也有以NRPS加載產(chǎn)生環(huán)肽骨架再進行后修飾的P450酶[7].

Ma等[56]從深海來源的鏈霉菌S.atratusSCSIO ZH16發(fā)酵產(chǎn)物中獲得6個怡萊霉素化合物(ilamycins B1、B2、C1、C2、D、E1)，從其突變株中分離得到怡萊霉素E2和F1.怡萊霉素類化合物也可以通過抑制來自結(jié)核分支桿菌(Mycobacteriumturberculosis)中靶標蛋白ClpC1的活性從而造成胞內(nèi)代謝紊亂，進而發(fā)揮抗結(jié)核活性[57]，其中怡萊霉素E對結(jié)核分支桿菌 的最小抑制濃度可達9.8 nmol/L，目前已完成該抗結(jié)核化合物的成藥性評價，展現(xiàn)了其在結(jié)核病治療中的應用前景；怡萊霉素C和E可通過不同的途徑引起三陰乳腺癌細胞凋亡[58-59].

從結(jié)構(gòu)上分析，怡萊霉素是由7個氨基酸組成的環(huán)肽，結(jié)構(gòu)中含有罕見的L-2-氨基-4-己烯酸、3-硝基-L-酪氨酸和異戊烯基化的色氨酸結(jié)構(gòu)單元.根據(jù)怡萊霉素的結(jié)構(gòu)特征，通過生物信息學分析、基因敲除、前體飼喂、同位素標記等多維策略，確定了負責怡萊霉素的生物合成基因簇和從異戊烯基化的色氨酸出發(fā)的NRPS骨架結(jié)構(gòu)生物合成過程[56].

在怡萊霉素的生物合成過程中共有4個P450酶的參與，Ma等[56]對它們進行了細致的生物信息學分析及體內(nèi)功能闡明，2個P450酶(IlaD和IlaN)負責非天然氨基酸前體的生物合成，另外2個P450酶(IlaL和IlaR)則負責怡萊霉素中亮氨酸末端甲基的羧基化及異戊烯基的環(huán)氧化，具體如下(圖3(c))：1)通過敲除編碼Ⅰ型聚酮合酶的基因ilaE或編碼P450酶的基因ilaD，發(fā)現(xiàn)突變株均無法產(chǎn)生怡萊霉素，飼喂L-2-氨基-4-己烯酸后突變株可恢復怡萊霉素的生成；飼喂13C標記的乙酸鈉，發(fā)現(xiàn)分離獲得的怡萊霉素中L-2-氨基-4-己烯酸中的碳信號出現(xiàn)增益，充分說明IlaE負責其聚酮鏈的生物合成，P450酶IlaD則催化掛載于?；d體蛋白(acyl carrier protein,ACP)的己烯片段的α-位四電子連續(xù)氧化成酮基，隨后經(jīng)轉(zhuǎn)氨酶IlaH的催化形成α-氨基并由Ⅱ型硫酯酶IlaF水解釋放.2)敲除怡萊霉素生物合成基因簇中的一氧化氮合酶基因ilaM和P450酶基因ilaN，突變株均喪失怡萊霉素的合成能力，回補3-硝基-L-酪氨酸使得怡萊霉素的生產(chǎn)得以恢復，說明它們參與到L-酪氨酸的硝基化過程.其中，IlaM負責催化精氨酸釋放一氧化氮；P450酶IlaN則繼續(xù)以一氧化氮和色氨酸作為底物，實現(xiàn)色氨酸苯環(huán)上的硝基化反應，其催化機制很可能類似于thaxtomin生物合成過程中的P450酶TxtE[60-61].3)P450酶基因ilaL的阻斷突變株主要積累NRPS IlaS負責合成的怡萊霉素B1及環(huán)氧化產(chǎn)物B2，表明P450酶IlaL負責催化亮氨酸末端甲基連續(xù)氧化成羧基.4)P450酶基因ilaR被阻斷后，突變株中則主要積累怡萊霉素B1、E1、E2和F，即不再產(chǎn)生環(huán)氧異戊烯基怡萊霉素，表明IlaR負責環(huán)氧基團的生成.其中，怡萊霉素E1和E2是IlaL氧化怡萊霉素B1形成的中間體經(jīng)自發(fā)的C—N成鍵形成六元環(huán)后產(chǎn)生的.

隨后，基于鏈霉菌S.atratusSCSIO ZH16的全基因組信息及次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇的分析，Sun等[62]成功激活其中一個非核糖體肽類天然產(chǎn)物基因簇，并獲得了含肉桂酸結(jié)構(gòu)單元的atratumycin類化合物.活性測試表明atratumycin對致病菌結(jié)核分枝桿菌展現(xiàn)出較好的抑制活性，可在微摩爾級發(fā)揮效用.相應的基因敲除及突變體發(fā)酵產(chǎn)物分析發(fā)現(xiàn)，atratumycin主要經(jīng)由3個NRPS(Atr21～23)共7個模塊負責合成，其由一分子鄰甲基肉桂酸和甘氨酸、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、L-色氨酸、D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-纈氨酸、L-脯氨酸、D-天冬酰胺及2S,3S-3-羥基苯丙氨酸共10個氨基酸組成.敲除NRPS基因atr23和P450酶基因atr27，突變株均無法生物合成atratumycin.他們進一步嘗試利用來自聚球藻的氧化還原伴侶組合Fdx_1499/FdR_0978和菠菜的氧化還原伴侶組合spFdx/spFdR來體外重建Atr27對L-苯丙氨酸的催化反應活性，發(fā)現(xiàn)Atr27無法催化L-苯丙氨酸的羥基化反應[62].以上體內(nèi)/體外實驗結(jié)果表明Atr27很可能是在NRPS合成線上實現(xiàn)苯丙氨酸的選擇性羥基化反應(圖3(d)).

Zhou等[63]從我國南海深海(1 396 m)沉積物中分離得到的鏈霉菌S.drozdowicziiSCSIO 10141的發(fā)酵液中分離得到6個新環(huán)肽類化合物，命名為甲哌霉素(marformycins)A～F，其結(jié)構(gòu)骨架主要由一分子L-蘇氨酸、L-亮氨酸、N-甲基-纈氨酸、(4-羥基化)六氫噠嗪酸(piperazic acid)、D-別異亮氨酸或D-纈氨酸、O-甲基-D-酪氨酸、L-別異亮氨酸或L-纈氨酸共7個氨基酸所組成.體外活性測試發(fā)現(xiàn)甲哌霉素A～E對條件致病菌藤黃微球菌(Micrococcusluteus)具有較好的抑制活性且無顯著的細胞毒性.隨后，Liu等[64]對S.drozdowicziiSCSIO 10141進行全基因組測序并獲得含20個開放閱讀框(open reading frames,ORFs)的長約45 kb的甲哌霉素生物合成物基因簇mfn，并結(jié)合基因敲除實驗完成了對該基因簇的功能鑒定.甲哌霉素的骨架由5個NRPS(MfnC、MfnD、MfnE、MfnK和MfnL，累計7個模塊共26個結(jié)構(gòu)域)通過連續(xù)的氨基酸識別、修飾、縮合并釋放得到.他們敲除編碼P450酶的mfnN基因發(fā)現(xiàn)突變株無法產(chǎn)生甲哌霉素C、D和E，主要積累甲哌霉素A、B和F，暗示P450酶MfnN可能以釋放后的環(huán)肽骨架作為底物，催化六氫哌嗪酸的4-位選擇性羥基化反應(圖3(e)).但目前不能排除識別六氫哌嗪酸的腺苷酰化結(jié)構(gòu)域具有寬泛的底物特異性，能夠同時識別羥基化和非羥基化六氫哌嗪酸作為底物并加載到結(jié)構(gòu)骨架中；或者腺苷酰化結(jié)構(gòu)域識別非羥基化的六氫哌嗪酸并裝載到ACP結(jié)構(gòu)域后，由MfnN催化裝配線上的羥基化.因此，該P450酶的具體反應機制還需更進一步的體外實驗證實.

來自深海放線菌MarinactinosporathermotoleransSCSIO 00652的methylpendolmycin 和pendolmycin為含吲哚結(jié)構(gòu)的內(nèi)酰胺類化合物.其中，methylpendolmycin具有抑制佛波酯(phorbol ester)與蛋白激酶C結(jié)合的生物活性[65]；pendolmycin則可抑制人皮膚鱗癌細胞A431中表皮生長因子誘導的磷脂酰肌醇周轉(zhuǎn)[66].Ma等[67]通過對M.thermotoleransSCSIO 00652的基因組測序及生物信息學分析定位，鎖定了methylpendolmycin/pendolmycin的生物合成基因簇；采取逐一敲除核心基因mpnABCDEF的策略結(jié)合蛋白質(zhì)同源比對分析，完成了生物合成基因簇mpn中關(guān)鍵基因功能的解析.作為雙模塊的NRPS蛋白，MpnB首先激活L-異亮氨酸或L-纈氨酸，且其甲基化結(jié)構(gòu)域(methylation domain)催化該氨基酸的N-甲基化，第2個模塊激活裝載L-色氨酸并催化其與L-異亮氨酸或L-纈氨酸的縮合得到二肽結(jié)構(gòu)骨架；P450酶MpnC則催化該二肽分子內(nèi)(化合物9)的C—N鍵(非常規(guī)P450酶反應)形成；最后，經(jīng)異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶MpnD的催化得到相應的終產(chǎn)物(圖3(f)).MpnC的催化機制很可能與參與indolactam V生物合成的P450酶TleB(來自鏈霉菌S.blastmyceticus)和HinD(來自Streptoalloteichushindustanus)一致，即P450酶通過3種可能的中間體完成C—N成鍵反應：1)催化底物N-甲基-L-纈氨酸-L-色氨醇形成苯環(huán)雙鍵環(huán)氧化中間體；2)催化底物上仲胺基團脫氫形成氮自由基；3)催化底物上仲胺基團及苯環(huán)脫氫形成雙自由基中間體[68].

Fan等[69]和Liu等[70]從一株深海來源的真菌Dichotomomycescejpii中分離獲得了一系列膠霉毒素(gliotoxin)類化合物.膠霉毒素是經(jīng)NRPS途徑生物合成得到的含二硫橋的二酮哌嗪化合物，具備多種生物活性，如免疫抑制活性和細胞毒性等.膠霉毒素的生物合成途徑在煙曲霉(Aspergillusfumigatus)中得到初步解析[71].通過基因組測序和生物信息學分析，Ye等[72]在D.cejpii基因組中鎖定了膠霉毒素的生物合成基因簇gli，結(jié)合已鑒定的同源基因簇中的基因功能，推測P450酶GliF可能參與環(huán)二肽骨架中苯丙氨酸和絲氨酸α-位碳原子的羥基化反應以及后續(xù)的非常規(guī)C—N成鍵反應(圖3(g)).

2.3 聚酮-非核糖體肽雜合類天然產(chǎn)物生物合成中的P450酶

聚酮-非核糖體肽雜合類天然產(chǎn)物是由PKS和NRPS共同負責核心骨架的生物合成.其中，NRPS的縮合結(jié)構(gòu)域往往負責實現(xiàn)氨基酸與裝載在PKS上的?；Y(jié)構(gòu)單元之間的縮合反應；相應的骨架進一步通過以P450酶為代表的后修飾酶完成氧化、C—C成鍵、C—N成鍵等修飾作用[73].該類化合物具有良好的生物活性，在臨床上應用廣泛，典型的代表如雷帕霉素(rapamycins)、埃博霉素(epothilones)等.

多環(huán)特特拉姆酸大環(huán)內(nèi)酰胺(polycyclic tetramate macrolactams，PTMs)是一類母核結(jié)構(gòu)經(jīng)PKS-NRPS雜合途徑生物合成由特特拉姆酸(tetramic acid)結(jié)構(gòu)和多環(huán)體系(常為2～3環(huán))構(gòu)成的內(nèi)酰胺類化合物，具備抗腫瘤、抗細菌、抗真菌等生物活性[74].Hou等[75]前期通過培養(yǎng)條件優(yōu)化的策略從來自中國南海深海的鏈霉菌S.somaliensisSCSIO ZH66中分離得到的新PTM類化合物somamycin A～D，對植物致病真菌以及腫瘤細胞具有不同程度的抑制活性，且抑制活性優(yōu)于陽性對照抗生素制霉菌素.基于全基因組數(shù)據(jù)及生物信息學分析成功地鑒定了somamycin的生物合成基因簇ptm，但其中預測為P450酶的編碼基因orf7的功能并未得到闡明.該課題組的最新研究[76]發(fā)現(xiàn)，通過同源重組的策略敲除ptm中的orf7后，突變株中主要積累somamycin D但無法產(chǎn)生somamycin C，因此，Orf7很可能負責駢環(huán)結(jié)構(gòu)的氧化修飾，即負責將somamycin D的14-位羥基進一步氧化為羰基(圖3(h)).

Ding等[77]針對深海來源的S.koyangensisSCSIO 5802的生物信息學分析發(fā)現(xiàn)了一條PKS-NRPS雜合的長度約16 kb的生物合成基因簇sko，通過基因敲除實驗發(fā)現(xiàn)其負責10-epi-HSAF(10-epi-heat-stable antifungal factor)和一個新的PTM類化合物koyanamide A的生物合成.該基因簇sko中存在一個推測編碼P450酶的基因skoE，可能參與koyanamide A中的[4+4]環(huán)加成反應，但目前仍缺乏相應的體內(nèi)或者體外生理生化的實驗證據(jù)(圖3(i)).已鑒定的參與天然產(chǎn)物生物合成的深海來源P450酶匯總于表1.

表1 已鑒定的參與天然產(chǎn)物生物合成的深海來源P450酶

除以上概述的結(jié)構(gòu)類型外，在深海鏈霉菌生物堿類化合物的生物合成基因簇中也發(fā)現(xiàn)了P450酶基因的蹤跡.Ma等[78]在研究一株來自深海的鏈霉菌Streptomycessp.SCSIO 03032中產(chǎn)生的具有抗菌、抗腫瘤活性的吲哚咔唑類生物堿spiroindimicins的生物合成機制時發(fā)現(xiàn)，P450酶編碼基因spmP位于編碼chromopyrrolic acid 合成酶的關(guān)鍵基因spmD的下游.盡管SpmP與已鑒定的參與吲哚咔唑類生物堿星形孢菌素(staurosporine)生物合成的P450酶StaP的相似度達到57%，但有趣的是，敲除spmP并未影響Streptomycessp.SCSIO 03032中spiroindimicins的生物合成，暗示著SpmP可能不參與其生物合成或者簇外存在功能補償?shù)娜哂郟450酶編碼基因.

3 總結(jié)與展望

長期以來，深海探測采樣和原位培養(yǎng)等技術(shù)手段的匱乏極大地限制了人們對深海生物資源的開發(fā)利用.近年來，隨著科學家們針對深海來源天然產(chǎn)物的化學生物學以及生態(tài)學研究的逐步深入，若干P450酶被發(fā)現(xiàn)參與它們的生物合成過程，呈現(xiàn)出多樣化的催化反應類型(羥基化、酮基化、C—N成鍵、硝基化等)，豐富了現(xiàn)有的P450酶天然資源庫(圖4).鑒于深海環(huán)境的獨特性，深海來源的P450酶可能具有耐鹽(比如來自咸海鮮球菌(Jeotgalicoccussp.ATCC 8456)的P450酶OleTJE便展現(xiàn)出中度嗜鹽的特性[79])、抗逆性強等諸多特性，這為P450酶工程改造及生物催化應用提供了很好的候選酶.

圖4 深海來源P450酶的一般研究策略及潛在意義

隨著深海探測技術(shù)和宏基因組測序的長足進步，NCBI數(shù)據(jù)庫(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)中P450酶的編碼基因數(shù)量呈現(xiàn)急劇增長的態(tài)勢，其中包含數(shù)量可觀的深海來源的真菌、細菌乃至病毒的P450酶編碼基因[54]，展示了深海P450酶庫開發(fā)和研究的無窮潛力.目前，深海來源P450酶的研究主要集中于放線菌來源，特別是側(cè)重于天然產(chǎn)物生物合成過程中P450酶的生理生化功能研究，而催化機制和結(jié)構(gòu)生物學的研究相對滯后.形成鮮明對比的是，深海真菌、藻類及動物來源P450酶的研究則較為稀缺，對于一些參與異源毒素降解或者孤兒P450酶(Orphan P450)的生物學功能探究更是匱乏.

從長遠發(fā)展來看，對于深海P450酶的挖掘、功能鑒定及潛在應用的探索和研究仍需要多學科的交叉融合、相輔相成(圖4)：1)設計、開發(fā)精良的深海裝備，促進對深海生物資源的可持續(xù)開發(fā)及獲?。?)不可培養(yǎng)的深海微生物獲得以及原位培養(yǎng)技術(shù)的突破；3)結(jié)合表觀遺傳修飾、大規(guī)模發(fā)酵、全基因組測序、沉默基因激活等不同的分子生物學和遺傳學技術(shù)，實現(xiàn)含P450酶基因的天然產(chǎn)物生物合成基因簇的功能研究；4)宏基因組測序結(jié)合生物信息學分析，獲取深海環(huán)境中的P450酶基因并構(gòu)建相應的數(shù)據(jù)庫，結(jié)合α-fold等蛋白三維結(jié)構(gòu)預測技術(shù)進行同源建模和功能預測；5)針對具備工業(yè)應用價值的P450酶，開展結(jié)構(gòu)生物學、計算生物學、定向進化等方面的研究，從而實現(xiàn)高活性和高選擇性P450酶的研制以適應產(chǎn)業(yè)的需求.相信通過對深海來源P450酶的多維研究，將極大地豐富對P450酶參與天然產(chǎn)物生物合成過程中的功能認識，進一步充實P450生物催化元件庫而助力合成生物學和相關(guān)工業(yè)領(lǐng)域的發(fā)展.