劉 芬 陳桂華 王 悅 唐文幫,*

(1 湖南農業(yè)大學農學院，湖南 長沙 410128；2 懷化職業(yè)技術學院，湖南 懷化 418000)

水稻(OryzasativaL.)植株中90%～95%的干物質來自光合作用[1]。葉綠體是植物光合作用的重要場所，葉綠素是植物吸收和傳遞光能的主要載體，因此，葉綠體發(fā)育情況和葉綠素含量會直接影響植物光合能力[2-3]。葉色發(fā)生突變大部分是受葉綠體發(fā)育和葉綠素含量異常的影響，因此利用葉色突變體可以定位并克隆與水稻光合作用相關的新基因，對培育高光效和高產水稻具有重要的理論意義。

近年來，葉色突變體已被應用于植物光合作用和光形態(tài)機制[4]、葉綠體的結構和發(fā)育機理[5]、葉綠素的代謝和合成途徑[6-7]、形態(tài)標記性狀和特殊種質[8-9]等基礎研究。胡彬華等[10]通過60Co-γ射線輻射川恢907，從輻射后代中篩選到一個淡黃葉突變體pyl3，該突變體整個生育期呈淡黃葉表型；與野生型相比，pyl3的葉綠素含量和農藝性狀指標均顯著降低；通過基因定位將該基因初步定位于第3號染色體上InDel標記M4和M6之間。林添資等[11]從早熟晚粳稻中發(fā)現(xiàn)一個黃綠葉自然突變體ygl14(t)，該突變體整個生育期表現(xiàn)呈黃綠葉；與野生型相比，ygl14(t)的農藝性狀指標和色素含量顯著降低，葉綠體發(fā)育異常；利用ygl14(t)與9311的F2群體，將該基因定位于第11號染色體短臂上的標記D-6和W1之間。張?zhí)烊萚12]采用甲基磺酸乙酸(ethyl methane sulfanate, EMS)誘變處理縉恢10號，從中獲得突變體ygl9，在苗期葉色呈現(xiàn)黃綠色，抽穗期漸變?yōu)榈G色；與野生型相比，ygl9的光合色素降低，葉綠體嗜鋨小體明顯增多；構建西農1A與ygl9的F2群體，將突變基因定位在第3號染色體短臂標記SSRS03-1和Ind03-19之間。孫小秋等[13]通過EMA誘變獲得一個水稻黃綠葉突變體ygl98，葉色呈黃綠色；與野生型相比，ygl98的株高變矮小，有效穗數(shù)和結實率下降，葉綠體形狀不規(guī)則，類囊體數(shù)目減少；利用ygl98/浙輻802的F2作為定位群體，將突變基因定位在第3號染色體長臂InDel標記I3和I4之間。陳盛杰等[14]從龍?zhí)馗轉基因后代中獲得一個淡黃葉突變體體ygl-11，整個生育期表型保持淡黃葉；與野生型相比，光合色素顯著降低，利用T-DNA 標簽的方法，從突變體中克隆到OsGUN4基因位于水稻第11染色體上。Wu等[15]從秈稻品種中分離出水稻黃綠葉突變體ygl1，在前期葉片表現(xiàn)出黃色，中期逐漸轉綠；與野生型相比，ygl1葉綠素含量下降；進一步將ygl1基因定位在第5號染色體上，并通過圖位克隆發(fā)現(xiàn)該基因屬于編碼葉綠素合成酶，催化葉綠素a的形成。Zhang等[16]研究黃綠化突變體chl1和chl9，葉片呈淺黃綠色，葉綠素減少，葉綠體發(fā)育不全；進一步利用定位群體將chl1和chl9基因定位在第3號染色體上；圖位克隆發(fā)現(xiàn)，chl1和chl9基因編碼ChlD和ChlI亞基鎂螯合酶，參與葉綠素合成的關鍵酶。

目前，與水稻葉色相關的基因較多，已被克隆的有80多個，但葉色變異的過程和調控光合的機制尚不明確。因此仍需探究新的突變體，挖掘更多葉色突變基因，以解析水稻高光效育種中光合作用的機理。鑒于此，本研究在不育系選育群體中發(fā)現(xiàn)一株自然變異的淡黃葉突變體，命名為xws，對該突變體進行表型鑒定和光合特征研究，并對其進行精細定位和候選基因分析,旨在探索葉色突變體的突變機理，為提高水稻光合作用和降低雜交水稻種子生產成本提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料野生型(wildtype，WT)為P88S，淡黃葉突變體為xws，由湖南農業(yè)大學水稻研究所提供。種植于湖南農業(yè)大學校耘園和海南三亞科研基地，按當?shù)爻Ｒ?guī)水肥條件進行田間種植管理。

1.2 光合色素含量測定

在苗期和抽穗期各選取3株水稻葉片，苗期選取三葉期葉片，抽穗期選取劍葉，以及苗期的莖和抽穗期的穗，分別將葉片、莖和穗剪成2～3 mm的細絲狀。分別稱取0.1～0.2 g剪碎的葉片浸泡于含10 mL 95%無水乙醇的管中，放置于4℃冰箱中暗處理，至樣品完全發(fā)白(一般放置時間為48 h)；采用UV-1700型紫外可見光光度計(SHIMADZU，日本)分別在470、649和665 nm波長下測定提取液OD值，重復測量3次，測量時先用95%乙醇溶液調零。計算公式如下：

Chla=[(13.95OD665-6.88OD649)×V]/(M×1 000)

(1)

Chlb=[(24.96OD649-7.32OD665)×V]/(M×1 000)

(2)

Chl=[(18.08OD649+6.63D665) ×V]/(M×1 000)

(3)

Car=[(1 000OD470-0.5Chla-114.8Chlb)×V]/(250×M×1 000)

(4)

式中，Chla為葉綠素a；Chlb為葉綠素b；Chl為總葉綠素；Car為類胡蘿卜素；V為葉綠素提取液總體積，mL；M為材料鮮重，g。

1.3 葉綠體超微結構觀察

分別于苗期取突變體xws和野生型相同部位的葉片，以戊二醛和鋨酸雙重固定后，利用50%、70%、80%、95%和100%的丙酮逐級脫水，再進行置換和包埋，制成超薄切片，經(jīng)過醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液和檸檬酸鉛溶液各染色5～10 min，用JEM-1230透射電鏡(日本JEOL公司)觀察野生型和突變體葉綠體的結構并拍照。

1.4 光合參數(shù)測定

選擇天氣晴朗的上午9：00-10:00進行光合指標的測定，選取孕穗期和抽穗期野生型和xws長勢一致的植株各3株，利用Li-6400便攜式光合測定儀(北京易科泰生態(tài)技術有限公司)測定野生型和xws的劍葉的光合指標，包括葉片蒸騰速率(transpiration rate, Tr)、凈光合速率(net photosynthetic rate, Pn)、氣孔導度(stomatal conductance, Gs)和胞間CO2濃度(intercellular CO2concentration, Ci)，每次測量重復3次，取平均值。

1.5 葉綠素熒光參數(shù)測定

采用FluorPen FP 100-MAX便攜式葉綠素熒光儀(北京易科泰生態(tài)技術有限公司)，在孕穗期和抽穗期選取水稻主莖倒二葉葉片中部，測定相關葉綠素熒光參數(shù)，突變體和野生型各測定3次。測定前將葉片暗適應20 min，設置飽和脈沖約3 000 μmol·m-2·s-1，光化光1 200 μmol·m-2·s-1，通過測葉綠素熒光動力學曲線，獲得初始熒光(original flcorescence,Fo)、PSⅡ最大光化學量子產量(maximum photochemical,Fv/Fm)、光化學淬滅系數(shù)(photochemical quenching, qP)和非光化學淬滅系數(shù)(non-photocherial quenching, NPQ)等葉綠素熒光參數(shù)。根據(jù)公式計算電子傳遞速率(ono-photochenial quenching, ETR)：

ETR=PAR×(ΔF/Fm′)×0.84×0.5

(5)

式中，PAR為光合有效輻射(photosythetic active radiation)；ΔF/Fm′為PSⅡ實際光化學量子產量(actual photochemical efficiency of PSⅡ in the light)。

1.6 基因的精細定位及候選基因預測

利用集團分離分析法(Bulked Segregant Analysis，BSA)篩選目標基因連鎖標記，挑選出10株正常表型株和10株突變體表型株分別構建基因池，用均勻覆蓋于水稻12條染色體上的簡單重復序列 (simple sequence repeats，SSR)標記，進行親本間的多態(tài)性篩選，用篩選到的多態(tài)性標記進行基因的初步定位，確定與目的基因初步連鎖的SSR標記。為了進一步精細定位目的基因的位置，以突變體xws和恢復系R032雜交構建的F2群體作為基因定位群體。從xws/R032的定位群體F2中選取698份淡黃葉單株，并加密標記，采用步移法逐漸縮小定位區(qū)間。選取親本及F2群體中突變體植株約4 cm的葉片，放入2.0 mL的離心管中，采用CTAB法提取水稻DNA。PCR反應體系共10 μL：20 ng·μL-1DNA模版1 μL，20 mol·μL-1引物1 μL，10× Buffer 1 μL，2.5 mmol·L-1dNTPS 0.2 μL， 5 U·μ-1Taq 0.1 μL, ddH2O 6.7 μL。PCR擴增程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55～58℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃終延伸7 min，PCR產物于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。?%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR產物。利用水稻基因注釋數(shù)據(jù)庫，查看定位區(qū)段內開放可讀框(open reading frame，ORF)的信息，對基因進行預測，得到葉綠素或葉綠體相關的基因。

2 結果與分析

2.1 突變體xws的表型特征

由圖1可知，與野生型相比，苗期突變體xws的莖和葉表現(xiàn)出明顯的黃色表型，隨著生育進程推進，分蘗期和抽穗期的葉片和葉鞘以及抽穗期的穗部表型均為淡黃色。由此可知，突變體xws在整個生長周期均表現(xiàn)為淡黃色。

注：A：野生型和突變體xws在苗期的表型；B：野生型和突變體xws在分蘗期的表型；C：野生型和突變體xws在抽穗期的表型；D：野生型和突變體xws抽穗期的穗部表型。Note: A: Phenotype of wild type and mutant xws at seedling stage. B: Phenotype of wild type and mutant xws at tillering stage. C: Phenotype of wild type and mutant xws at heading stage. D: Panicle phenotype of wild-type and mutant xws at the heading stage.圖1 突變體xws的植株表型Fig.1 Plant phenotypes of mutant xws

2.2 突變體的光合色素含量

突變體xws的葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素及類胡蘿卜素在苗期和抽穗期的變化規(guī)律一致(圖2)。在苗期，突變體xws葉片中的葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素及類胡蘿卜素相比野生型分別減少48.3%、72.9%、45.3%和45.8%；莖中分別減少42.3%、52.7%、41.3%和44.9%。在抽穗期，突變體xws劍葉的葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素及類胡蘿卜素相比野生型分別減少50.1%、72.8%、49.9%、56.2%；穗中分別減少27.7%、39.1%、27.5%、30.9%。突變體xws與野生型的葉綠素a/b，在整個生育期內均有顯著差異。突變體xws在苗期和抽穗期的光合色素含量均極顯著低于野生型，推測該突變體表型變化與光合色素合成受阻有關。

注：*，**分別表示野生型與突變體在P<0.05和P<0.01水平上差異顯著。下同。Note: *, ** represent significant difference between wild type and the mutant at 0.05 and 0.01 level, respectively. The same as following.圖2 突變體xws的光合色素含量Fig.2 Photosynthetic pigment content of mutant xws

2.3 突變體葉綠體的超微結構

在苗期對野生型和突變體xws的葉片進行葉綠體超微結構觀察(圖3)。結果表明，野生型的葉綠體形狀較為規(guī)則，嗜鋨小體數(shù)目多，基粒片層排列較厚，類囊體膜明顯，細胞結構發(fā)育正常。突變體xws的葉綠體形狀無規(guī)則，嗜鋨小體消失，類囊體數(shù)量減少，基粒片層變薄。由此推測，突變體呈現(xiàn)出淡黃葉表型與葉綠體的發(fā)育受到阻礙有關。

2.4 突變體光合特征分析

由圖4可知，與野生型相比，突變體xws的凈光合速率、氣孔導度、胞間CO2濃度和蒸騰速率均有所減弱。孕穗期，突變體xws的光合特性與野生型相比，均達到極顯著差異，分別下降了6.7%、16.9%、5.1%和8.8%；抽穗期，突變體xws與野生型相比，凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率均達到顯著差異，但胞間CO2濃度差異不顯著。由此可知，葉色突變導致葉片的光合功能受到損傷。

2.5 葉綠素熒光動力學參數(shù)

為了探討突變體xws因葉色變異導致光合系統(tǒng)Ⅱ發(fā)生的變化，對野生型和突變體xws在不同時期葉片的熒光動力學參數(shù)進行測定(表1)。結果表明，在整個生長周期中，突變體xws的Fo均低于野生型，分蘗期和孕穗期差異達到顯著或極顯著水平，分別降低44.5%和17.6%，抽穗期差異不顯著。xws在不同時期的最大熒光(maximum photochemical,Fm)均比野生型低，并達到極顯著水平。通過比較不同生長階段中Fv/Fm值，發(fā)現(xiàn)突變體xws與野生型的Fv/Fm值無顯著差異，且均在0.65～0.85之間，說明突變體xws的光化學效率未受到葉色變異的影響。突變體xws的NPQ在分蘗期下降，且與野生型有顯著差異，qP和ETR與野生型在3個階段均無顯著差異。

2.6 精細定位及候選基因預測

試驗利用隱性群體分離法，將該突變基因xws初步定位于第3號染色體上。隨后從F2中選取葉色表型為淡黃葉的群體，將xws基因初定位于分子標記WY146和WY126之間。在WY146和WY126之間繼續(xù)開發(fā)標記進行精細定位，擴大定位群體，篩選到6對多態(tài)性引物(表2)，最終將xws基因定位于WY242和WY119之間，物理距離為51.7 kb(圖5)，在此區(qū)間內預測到12個開放閱讀框，其功能見表3。

注：A～C：野生型的葉綠體結構；D～F：突變體xws的葉綠體結構；CM：細胞膜；OG：嗜鋨小體；TM：類囊體膜。Note: A～C: Chloroplast structure of WT. D～F: Chloroplast structure of mutant xws. CM: Cell membrane. OG: Osmiophilic plastoglobuli. TM: Thylakoid membrane.圖3 突變體xws的葉綠體超顯微結構Fig.3 Chloroplast ultramicrostructure of mutant xws

圖4 突變體xws與野生型不同時期的光合特性Fig.4 Photosynthetic characteristics of mutant xws and wild type in different periods

表1 突變體xws不同時期的熒光動力學參數(shù)Table 1 Fluorescence kinetic parameters of mutant xws in different periods

注：A：利用725個F2分離單株將xws定位在分子標記RM5801與RM3346之間；B：利用486個F2分離單株，開發(fā)新標記后將xws定位于WY146和WY126之間；C：利用F2群體將xws精細定位與WY242和WY119之間51.7 kb內；D：該候選基因在物理圖譜上位于BAC克隆號的區(qū)域范圍；E：候選區(qū)段的物理距離為51.7 kb。分子標記之 間的數(shù)字所用單位為cM。Note: A: xws was located between molecular markers RM5801 and RM3346 using 725 F2 isolates. B: 486 F2 were used to isolate individual plants, and xws was positioned between WY146 and WY126 after developing new markers. C: Using the F2 population to fine map xws to within 51.7 kb between WY242 and WY119. D: The candidate gene is located in the region of the BAC clone number on the physical map. E: The candidate gene has a physical distance of 51.7 kb. The number between the molecular markers is in cM.圖5 突變體xws基因的精細定位Fig.5 Fine mapping of mutant xws

3 討論

水稻葉色突變體的類型較多，主要類型有白化、黃化、條紋、條斑、轉綠、常綠和溫敏性變色等，其中以黃化類型居多[17]。前人研究發(fā)現(xiàn)，yss1水稻突變體在幼苗期葉片呈條紋狀，生長至后期葉色逐漸與野生型一致[18]。yl-1突變體在整個生長發(fā)育期間葉片呈黃色，且葉綠素含量顯著下降[19]。本研究中，xws突變體在整個生育期葉片均呈現(xiàn)淡黃色，突變體苗期和抽穗期的葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素與野生型相比均顯著降低，推測葉綠素含量受阻可直接導致葉色呈淡黃色。

表2 xws基因的連鎖標記Table 2 Sequence of markers linked with xws

表3 xws候選基因預測分析Table 3 Prediction and analysis of xws candidate genes

植株中光合色素含量的減少會直接或間接導致光合速率下降，且PSⅡ反應中心的光捕獲能力較弱，光化學轉化效率降低，最終使光合能力降低[20]。本研究中，突變體xws的凈光合速率、氣孔導度、蒸騰速率和胞間CO2濃度均降低，這與Zhu等[17]和Wang等[21]關于ygl8和m167突變體的研究結果相似，說明葉綠素含量下降會導致光合速率減弱。在整個生長周期中，突變體xws的Fo均低于野生型，說明xws與葉色和光合色素含量的變化相同，與曹莉等[22]的研究結果一致。Fv/Fm是最大光化學量子產量，能反映PSⅡ光化學效率，一般正常生長條件下，植株葉片的Fv/Fm值在0.80～0.85之間[23-24]。突變體xws的Fv/Fm值在0.65～0.85之間，說明突變體xws的光化學效率受到葉色變異的影響。NPQ和qP反映植物熱耗散能力和光保護能力[25]。在分蘗期，突變體xws的NPQ相比野生型顯著下降，生長后期無明顯差異，說明生長前期的光能轉化效率和熱耗散能力下降，這與肖華貴等[26]的研究結果基本一致。

迄今為止，在水稻中已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)的葉色突變體材料超過90份，其中被定位到染色體上的葉色相關基因超過145個，且均勻分布于水稻12條染色體上，其中以第3號染色體上最多[27-28]。ygl3突變體在整個生長周期內表現(xiàn)為黃色，該基因被定位于第3號染色體上分子標記SWU3-1和SWU3-2之間[29]；pyl-v突變體的葉片在全生育期呈淡黃葉，該基因被定位于第3號染色體上分子標記R3M1和STS3-1之間[30]。本研究中，xws基因被定位在第3號染色體上WY242和WY119標記之間，通過分析日本晴的基因組序列，發(fā)現(xiàn)定位區(qū)間內有4個葉色相關的候選基因：Os03g0684400編碼Mg2+轉運蛋白基因、Os03g0685000編碼鐵氧還蛋白基因、Os03g0685100編碼tRNA/rRNA甲基轉移酶蛋白基因、Os03g0685300編碼谷氨酰胺轉酰胺酶Ⅰ類結構域蛋白基因。其中Os03g0685000被證實是一個葉色突變基因，被命名為OsFdC2，其編碼區(qū)第1 447位堿基由C替換為T，導致編碼蛋白改變，從而造成葉綠體發(fā)育延緩，葉綠素含量降低，整個生育期葉色呈黃綠，并且生長速率緩慢、抽穗晚，同時，還發(fā)現(xiàn)其株高、單株穗數(shù)和每穗粒數(shù)相比野生型顯著降低[31]。但本研究中，突變體xws整個生育期的葉片、莖和穗都呈淡黃色，株高、單株有效穗數(shù)和穗粒數(shù)均比野生型有所增加[32]，這與OsFdC2的相關表型不一致。因此，本研究后續(xù)將進一步對候選基因進行克隆和功能分析，以期為解析其突變機制奠定基礎。

4 結論

本研究發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，突變體xws葉綠素含量顯著降低，葉綠體形狀無規(guī)則，光合能力減弱，表明該突變體的淡黃色表型與光合色素含量下降、葉綠體發(fā)育受阻和光合系統(tǒng)受損有關。xws基因定位于第3號染色體上分子標記WY242和WY119之間，物理距離為51.7 kb。