李亞子, 趙 丹, 郭曉昌, 吳 涵, 劉兆瑞, 郭 巍, 2,*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學植物保護學院, 河北保定 071001; 2.中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院, 北京 100081)

甜菜夜蛾Spodopteraexigua是一種重要的全球多食性害蟲，其先天免疫系統(tǒng)在病原微生物入侵時會高效地產(chǎn)生免疫應答。昆蟲體內(nèi)先天性免疫缺陷(immune deficiency, IMD)和Toll信號通路是重要的腸道免疫防御機制(Medzhitov and Janeway, 2002; Hoffmann, 2003; Akiraetal., 2006; Takeuchi and Akira, 2009)，當昆蟲取食病原微生物后，肽聚糖識別蛋白(peptidoglycan recognition protein, PGRP)被激活，介導抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)的產(chǎn)生，抵御病原微生物的侵染(Medzhitov and Janeway, 2002)。PGRP最早在家蠶Bombyxmori血淋巴中發(fā)現(xiàn)，分子量約為19 kD，是昆蟲中已發(fā)現(xiàn)的重要模式識別受體類型之一(Yoshidaetal., 1996)。根據(jù)PGRP分子量大小，可將其分為短型PGRP(PGRP-S)、中型(PGRP-I)和長型PGRP(PGRP-L)3類(Dziarski and Gupta, 2006; 朱曉林, 2016; Houetal., 2019)。目前在家蠶、黑腹果蠅Drosophilamelanogaster和桔小實蠅Bactroceradorsalis等多種昆蟲中報道了PGRP基因的功能(Yoshidaetal., 1996; Kimetal., 2003; 張迎新等, 2020)，而甜菜夜蛾SePGRP-SA基因的生物學功能及其對病原微生物的免疫響應尚不清楚。

PGRP在識別外來病原微生物以及激活I(lǐng)MD和Toll信號通路中發(fā)揮著重要作用。因此，本研究以甜菜夜蛾為研究對象，克隆甜菜夜蛾SePGRP-SA的全長基因并進行序列分析；利用qRT-PCR方法對SePGRP-SA基因進行時空表達模式分析；通過RNAi技術(shù)沉默SePGRP-SA基因，研究對抗菌肽相關(guān)基因以及中腸細菌載量的影響，分析甜菜夜蛾對蘇云金芽胞桿菌BacillusthuringiensisBt-GS57菌株敏感性的變化，進一步闡明PGRP在甜菜夜蛾免疫系統(tǒng)中的生物學功能，為實現(xiàn)害蟲的綠色防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試甜菜夜蛾為河北農(nóng)業(yè)大學昆蟲生化與分子生物學實驗室人工飼養(yǎng)(溫度為27±1℃，相對濕度為75%±10%，光周期為14L∶10D),以人工飼料飼養(yǎng)(Hanetal., 2014; Breeschotenetal., 2019)。

Bt-GS57菌株、甜菜夜蛾幼蟲腸道共生菌蠟樣芽胞桿菌Bacilluscereus和腸球菌屬Enterococcus細菌均由本實驗室分離保存。

1.2 RNA的提取及cDNA合成

收集甜菜夜蛾卵、1-5齡幼蟲、預蛹和蛹及4齡幼蟲的中腸、馬氏管、血淋巴、脂肪體、圍食膜和表皮，各樣品質(zhì)量10～20 mg。利用TIANGEN RNAprep Pure動物組織總RNA提取試劑盒(TIANGEN，北京)提取總RNA。瓊脂糖凝膠電泳和BioPhotometer D30分光光度計(Eppendorf，德國)檢測RNA的質(zhì)量和濃度。參照GoScriptTMReverse Transcription System (Promega，美國)說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3 SePGRP-SA全長基因的克隆

根據(jù)本實驗室獲得的甜菜夜蛾基因組數(shù)據(jù)獲取SePGRP-SA全長序列，利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計SePGRP-SA基因全長擴增引物SePGRP-SA-F/R(表1)。以甜菜夜蛾4齡幼蟲中腸cDNA為模板，擴增SePGRP-SA基因。PCR反應體系(25 μL): cDNA模板2 μL, 上下游引物(10 mmol/L)各0.5 μL, 2×PrimeSTAR?Max Premix(TaKaRa, 大連)12.5 μL, ddH2O 9.5μL。PCR反應條件: 94℃ 3 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 40 s, 35個循環(huán); 72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并利用DNA凝膠回收試劑盒(TaKaRa，大連)純化回收目的條帶；將純化的目的DNA片段與pEASY-Blunt Cloning載體(TransGen Biotech，北京)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細胞(TaKaRa，大連)，利用通用M13 F/R引物篩選陽性克隆，送至上海生工生物股份有限公司進行測序。

1.4 SePGRP-SA基因生物信息學分析

利用DNAMAN V6.0軟件預測SePGRP-SA基因的開放閱讀框以及蛋白分子量和等電點；使用SignalP 5.1Server(http: ∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和TMHMM-2.0(http: ∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0)分析信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域；使用在線軟件SMART(http: ∥smart.embl-heidelberg.de/smart)和ProtParam(http: ∥web.expasy.org/protparam)進行SePGRP-SA結(jié)構(gòu)域分析；利用NetPhos 2.0預測SePGRP-SA的磷酸化位點；利用Clustal X將SePGRP-SA基因氨基酸序列與其他物種PGRP基因氨基酸序列進行同源比對，并利用MEGA 6軟件的鄰接(neighbor-joining, NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 SePGRP-SA基因時空表達模式分析

采用qRT-PCR方法，檢測甜菜夜蛾SePGRP-SA在不同發(fā)育階段和4齡幼蟲組織中的轉(zhuǎn)錄水平，所用引物序列見表1。qRT-PCR體系(20 μL): cDNA模板1 μL, 上下游引物(10 mmol/L)各1 μL, SYBR Mix 10 μL, ddH2O 7 μL。在熒光實時定量PCR儀(CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System, BIO-RAD)上運行qRT-PCR，反應程序: 95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 56℃ 30 s, 72℃ 30 s, 39個循環(huán); 95℃ 1 min, 50℃ 1 min, 65～95℃,每5 s升溫0.5℃,進行溶解曲線的擴增。每個樣品進行3次技術(shù)重復。以甜菜夜蛾SeActin作為內(nèi)參基因，引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法分析基因表達量數(shù)據(jù)(Livaketal., 2001)。

1.6 SePGRP-SA基因的RNAi

以甜菜夜蛾中腸cDNA和增強型綠色熒光蛋白基因EGFP的質(zhì)粒pGR107為模板，以PGRP-T7-ds1FF/PGRP-ds1FR, PGRP-T7-ds1RF/PGRP-ds1RR, T7-dsEGFPFF/dsEGFPFR以及T7-dsEGFPRF/dsEGFPRR為引物進行PCR擴增獲得合成dsRNA的正反向模板，引物信息見表1。以T7 RiboMAXTMExpress RNAi System試劑盒(Promega，美國)體外轉(zhuǎn)錄合成甜菜夜蛾SePGRP-SA基因和EGFP基因的雙鏈RNA(分別為dsSePGRP-SA和dsEGFP)。分別注射2 μL dsSePGRP-SA(5 μg/μL)和dsEGFP(5 μg/μL) 至4齡甜菜夜蛾幼蟲體內(nèi)，以注射dsEGFP和ddH2O分別為陰性對照和空白對照，每個處理設(shè)3次生物學重復，每個生物學重復10頭幼蟲，注射后正常飼養(yǎng)。注射dsRNA 72 h后，收取甜菜夜蛾中腸，并提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用qRT-PCR技術(shù)(同1.5節(jié))檢測SePGRP-SA基因沉默效率和抗菌肽相關(guān)基因Cecropin,Attacin和Defensin的相對表達情況。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.7 SePGRP-SA基因沉默后中腸細菌載量的檢測

收集1.6節(jié)注射dsRNA 72 h后的甜菜夜蛾幼蟲中腸(含內(nèi)容物)，利用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(TIAGEN公司)提取中腸總DNA。以16SF/16SR為引物(表1)(Weietal., 2017)，qRT-PCR檢測SePGRP-SA基因沉默后中腸細菌16S rRNA基因的表達量，分析中腸細菌載量的變化，同時以Enterococcus-F/Enterococcus-R和Bm-F/Bm-R為引物(Queipo-Ortunoetal., 2012; 李聰, 2019)(表1)， qRT-PCR檢測腸球菌屬16S rRNA基因和蠟樣芽胞桿菌DNA旋轉(zhuǎn)酶B亞基基因gyrB的的表達量，分析中腸腸球菌屬載量及蠟樣芽胞桿菌載量的變化，qRT-PCR反應體系和反應程序同1.5節(jié)。

1.8 通過RNAi沉默SePGRP-SA后甜菜夜蛾幼蟲對Bt-GS57敏感性的變化檢測

將對甜菜夜蛾高殺蟲活性的Bt-GS57菌株接種于LB液體培養(yǎng)基，30℃ 220 r/min過夜培養(yǎng)。第2天按1∶100(v/v)的比例接種于1/2 LB液體培養(yǎng)基，30℃ 200 r/min培養(yǎng)45 h，收集胞晶混合物，稀釋至4 mg/mL，-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

收集1.6節(jié)注射dsSePGRP-SA, dsEGFP(陰性對照)和ddH2O(空白對照)的甜菜夜蛾4齡幼蟲，于24 h后置于含300 μL Bt-GS57胞晶混合物(4 mg/mL)的人工飼料(Zhangetal., 2017) 中0, 24, 48, 72, 96和120 h，分別統(tǒng)計ddH2O, dsEGFP, dsSePGRP-SA, ddH2O+Bt-GS57, dsEGFP+Bt-GS57和dsSePGRP-SA+Bt-GS57處理組5 d內(nèi)幼蟲的校正死亡率，每個處理設(shè)3次生物學重復，每個生物學重復15頭幼蟲。計算公式：校正死亡率(%)=(處理組幼蟲死亡率-對照組幼蟲死亡率)/(1-對照組幼蟲死亡率)×100%。

1.9 飼喂Bt-GS57菌株后甜菜夜蛾4齡幼蟲SePGRP-SA和抗菌肽相關(guān)基因表達變化檢測

取300 μL Bt-GS57菌株胞晶混合物(4 mg/mL)均勻涂布飼料表面，對照組為不含Bt-GS57的人工飼料。將4齡第1天甜菜夜蛾幼蟲饑餓處理12 h后，置于飼料上。每個處理進行3次生物學重復，每個重復15頭幼蟲。于飼喂0, 24, 48和72 h后分別提取中腸組織、RNA及合成cDNA(方法同1.2節(jié))。利用qRT-PCR技術(shù)(同1.5節(jié))檢測SePGRP-SA及抗菌肽相關(guān)基因Cecropin,Attacin和Defensin在Bt-GS57誘導后的表達變化。

1.10 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計分析，利用單因素方差分析(ANOVA)及最小顯著差法(LSD)分析SePGRP-SA基因的時空表達模式和SePGRP-SA基因沉默后對甜菜夜蛾中腸抗菌肽相關(guān)基因和中腸細菌載量影響的差異顯著性；Bt-GS57對甜菜夜蛾SePGRP-SA及抗菌肽相關(guān)基因表達量的影響采用 Student氏獨立樣本t檢驗分析差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 SePGRP-SA基因的克隆和序列

PCR擴增獲得甜菜夜蛾SePGRP-SAcDNA(GenBank登錄號: MW265930)，其開放閱讀框長576 bp，編碼191個氨基酸，預測蛋白分子量為21.59 kD，等電點為8.00，具有PGRP保守結(jié)構(gòu)域(第21-163位氨基酸)和Ami2結(jié)構(gòu)域(第32-169位氨基酸)，含有信號肽序列(第1-19位氨基酸)，為分泌型蛋白；NetPhos 2.0軟件分析結(jié)果顯示，SePGRP-SA包含4個Ser、1個Thr和1個Tyr磷酸化位點(圖1)。通過NCBI Blast分析比對可知甜菜夜蛾SePGRP-SA氨基酸序列與斜紋夜蛾SpodopteralituraSlPGRP的親緣關(guān)系最近，氨基酸序列一致性最高，為91.1%。

圖1 甜菜夜蛾SePGRP-SA和其他鱗翅目昆蟲PGRP氨基酸序列比對Fig.1 Amino acid sequence alignment of SePGRP-SA of Spodoptera exigua with PGRP proteins from other lepidopteran insectsPGRP蛋白來源物種及其GenBank登錄號Origin species of PGRP proteins and their GenBank accession numbers: SlPGRP: 斜紋夜蛾Spodoptera litura, XP_022825445.1; HaPGRP-A: 棉鈴蟲Helicoverpa armigera, KF954940.1; HaPGRP-C: 棉鈴蟲Helicoverpa armigera, JX082167.1; HaPGRP-D: 棉鈴蟲Helicoverpa armigera, KF985962.1; PxPGRP-S2: 小菜蛾P(guān)lutella xylostella, MG570190; TnPGRP: 粉紋夜蛾Trichoplusia ni, O76537.1.黑色實線標注的為SePGRP-SA的信號肽序列, 短虛線標注為PGRP的結(jié)構(gòu)域, 空心三角標注的為SePGRP的磷酸化位點, 實心三角標注的為SePGRP的保守的半胱氨酸殘基。The signal peptide sequence of SePGRP-SA protein is marked with black solid line, the PGRP domain is labeled with short dashed line, the phosphorylation site of SePGRP-SA is marked with hollow triangle and the conserved cysteine of SePGRP-SA is marked with solid triangle.

2.2 SePGRP-SA系統(tǒng)進化分析

甜菜夜蛾SePGRP-SA與其他昆蟲PGRP的序列比對結(jié)果顯示，SePGRP-SA與斜紋夜蛾SpodopteralituraSlPGRP、粉紋夜蛾TrichoplusianiTnPGRP、棉鈴蟲HelicoverpaarmigeraHaPGRP-A及HaPGRP的相似度最高，表明這幾種昆蟲的PGRP序列同源性較高。SePGRP-SA基因編碼的氨基酸序列與功能已知昆蟲PGRP的相應氨基酸序列進化分析結(jié)果顯示，甜菜夜蛾SePGRP-SA氨基酸序列與斜紋夜蛾SlPGRP聚在同一分支上，表明兩者的親緣關(guān)系較近(圖2)。

圖2 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的甜菜夜蛾與其他昆蟲PGRPs系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of PGRPs of Spodoptera exiguaand other insects constructed by neighbor-joiningmethod based on amino acid sequencePGRPs來源物種及GenBank登錄號Origin species of PGRPs and their GenBank accession numbers: PxPGRP-S2: 小菜蛾P(guān)lutella xylostella, MG570190; ApPGRP-A: 柞蠶Antherea pernyi, AME17978.1; ApPGRP-B: 柞蠶Antherea pernyi, AME17979.1; ApPGRP-C: 柞蠶Antherea pernyi, AME17980.2; BmPGRP-S1: 家蠶Bombyx mori, NM_001043371.1; BmPGRP-S2: 家蠶Bombyx mori, KF906541.1; BmPGRP-S5: 家蠶Bombyx mori, NM_001043393.1; BmPGRP: 家蠶Bombyx mori, XP_028043866.1; DmPGRP-SC2: 黑腹果蠅Drosophilia melanogaster, NP_610410.1; HaPGRP-A: 棉鈴蟲Helicoverpa armigera, KF954940.1; HaPGRP-C: 棉鈴蟲Helicoverpa armigera, JX082167.1; HaPGRP-D: 棉鈴蟲Helicoverpa armigera, KF985962.1; HaPGRP: 棉鈴蟲Helicoverpa armigera, XP_021192951.1; MsPGRP-1A: 煙草天蛾Manduca sexta, AF413068.1; MsPGRP-1B: 煙草天蛾Manduca sexta, AF413061.1; MsPGRP-2: Manduca sexta, GQ293365.1; SlPGRP: 斜紋夜蛾Spodoptera litura, XP_022825445.1; TnPGRP: 粉紋夜蛾Trichoplusia ni, O76537.1; PmPGRP: 金鳳蝶Papilio machaon, XP_014370321.1; PxPGRP: 柑橘鳳蝶Papilio xuthus, XP_013170473.1; OfPGRP: 亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis, XP_028160362.1.

2.3 SePGRP-SA基因表達模式

發(fā)育表達譜結(jié)果顯示，SePGRP-SA在甜菜夜蛾各發(fā)育階段均有表達，在4-5齡幼蟲、預蛹和蛹中高表達，顯著高于在卵和其他齡期幼蟲，其中5齡幼蟲的表達量是卵期的971.5倍，蛹期的表達量是卵期的1 898.6倍(圖3: A)；從4齡幼蟲開始，SePGRP-SA的相對表達量呈逐漸上升趨勢(P<0.05)。組織表達譜結(jié)果表明，SePGRP-SA在4齡甜菜夜蛾各個組織中均有所表達，血淋巴中的相對表達量最高，其次是圍食膜、馬氏管和中腸中的，血淋巴中SePGRP-SA表達量是脂肪體中的65.1倍，圍食膜中SePGRP-SA的表達量是脂肪體中的16.7倍(圖3: B)。

圖3 SePGRP-SA在甜菜夜蛾不同發(fā)育階段(A)及4齡幼蟲不同組織(B)中的表達譜Fig.3 Expression profiles of SePGRP-SA in different developmental stages (A)and different tissues of the 4th instar larvae (B) of Spodoptera exiguaEg: 卵Egg; 1st-5th: 分別為1-5齡幼蟲1st-5th instar larvae, respectively; Pre: 預蛹Prepupa; Pu: 蛹Pupa; MG: 中腸Midgut; MT: 馬氏管Malpighian tubules; HE: 血淋巴Hemolymph; FB: 脂肪體Fat body; PM: 圍食膜Peritrophic membrane; EP: 表皮Epidermis.圖中數(shù)據(jù)為3次獨立生物學重復的平均值±標準誤；柱上不同小寫字母表示不同組間基因表達量差異顯著(P<0.05, LSD).圖4和5同。Data in the figure are mean±SE of three independent experiments.Different lowercase letters above bars indicate significant differences in the gene expression level among different groups (P<0.05, LSD).The same for Figs.4 and 5.

2.4 SePGRP-SA基因沉默效果及沉默SePGRP-SA對甜菜夜蛾4齡幼蟲抗菌肽相關(guān)基因表達量的影響

注射dsEGFP(陰性對照)的甜菜夜蛾4齡幼蟲SePGRP-SA和抗菌肽相關(guān)基因表達量與注射ddH2O(空白對照)的相比無明顯變化；注射dsSePGRP-SA72 h后，SePGRP-SA基因表達量與對照比顯著下調(diào)了95.26%(圖4: A)(P<0.05)，實現(xiàn)了SePGRP-SA基因的沉默。此時，抗菌肽相關(guān)基因的表達量顯著下調(diào)(P<0.05)，其中Ceropin的表達量下調(diào)了55.64%，Attacin的表達量下調(diào)了97.00%，Defensin的表達量下調(diào)了83.95%(圖4: B-D)，表明甜菜夜蛾幼蟲SePGRP-SA參與調(diào)控抗菌肽相關(guān)基因的表達。

圖4 通過RNAi沉默SePGRP-SA對甜菜夜蛾4齡幼蟲中腸抗菌肽相關(guān)基因的表達的影響Fig.4 Effects of silencing SePGRP-SA by RNAi on the expression of antimicrobial peptide-related genesin the midgut of the 4th instar larvae of Spodoptera exiguaA: SePGRP-SA; B: Ceropin; C: Attacin; D: Defensin.dsEGFP: 陰性對照Negative control; ddH2O: 空白對照Blank control.RNAi 72 h后測定基因表達量。The expression levels of genes were detected at 72 h after RNAi.

2.5 SePGRP-SA基因沉默對甜菜夜蛾4齡幼蟲中腸細菌載量的影響

與空白對照組(ddH2O)相比，dsEGFP處理組甜菜夜蛾4齡幼蟲中腸的細菌載量、腸球菌屬載量和蠟樣芽胞桿菌載量沒有明顯變化(圖5)。注射dsSePGRP-SA72 h后，幼蟲中腸細菌載量、腸球菌屬載量和蠟樣芽胞桿菌載量分別是對照組的1 424.15, 2 266.29和2 361.24倍(圖5: A-C)(P<0.05)，推測甜菜夜蛾SePGRP-SA基因在維持中腸菌群穩(wěn)態(tài)中起重要作用。

圖5 通過RNAi沉默SePGRP-SA對甜菜夜蛾4齡幼蟲中腸細菌載量的影響Fig.5 Effects of silencing SePGRP-SA by RNAi on the bacterial load in the midgut of the 4th instar larvae of Spodoptera exiguaA: 細菌16S rRNA基因16S rRNA gene of bacteria; B: 腸球菌屬16S rRNA基因16S rRNA gene of Enterococcus; C: 蠟樣芽胞桿菌gyrB基因gyrB gene of Bacillus cereus.dsEGFP: 陰性對照Negative control; ddH2O: 空白對照Blank control.RNAi 72 h后測定中腸細菌載量。The bacterial load in the midgut was detected at 72 h after RNAi.

2.6 SePGRP-SA基因沉默后甜菜夜蛾幼蟲對Bt-GS57敏感性的變化

注射dsEGFP后，Bt-GS57引起的甜菜夜蛾幼蟲72 h和120 h(已發(fā)育到5齡)的校正死亡率與空白對照(ddH2O)比無顯著差異(P>0.05)，72 h校正死亡率為50.00%，120 h校正死亡率為53.33%；注射dsSePGRP-SA后，Bt-GS57引起的幼蟲72 h校正死亡率為73.33%，120 h校正死亡率為96.67%(圖6)。表明SePGRP-SA基因沉默后，甜菜夜蛾對Bt-GS57的敏感性顯著增加，推測4齡幼蟲SePGRP-SA基因在防御Bt侵染中有重要作用。

圖6 通過RNAi沉默SePGRP-SA后甜菜夜蛾幼蟲對蘇云金芽胞桿菌Bt-GS57的敏感性Fig.6 Sensitivity of Spodoptera exigua larvae to Bacillusthuringiensis Bt-GS57 after silencingSePGRP-SA by RNAidsEGFP: 陰性對照Negative control; ddH2O: 空白對照Blank control.注射dsSePGRP-SA, dsEGFP (陰性對照)和ddH2O (空白對照)的甜菜夜蛾4齡幼蟲24 h后, 置于含300 μL Bt-GS57胞晶混合物 (4 mg/mL)的無菌飼料中, 統(tǒng)計甜菜夜蛾幼蟲在取食(Bt-GS57侵染)0, 24, 48, 72, 96和120 h的校正死亡率。折線圖上不同小寫字母表示120 h時甜菜夜蛾幼蟲的校正死亡率差異顯著 (P<0.05, LSD)。At 24 h post injection of dsSePGRP-SA, dsEGFP (negative control) and ddH2O (blank control), the 4th instar larvae of S. exigua were placed in axenic diet containing 300 μL of Bt-GS57 cell mixture (4 mg/mL).The corrected mortality rates of S. exigua larvae were counted at 0, 24, 48, 72, 96 and 120 h after feeding (Bt-GS57 infection).Different lowercase letters on line graph indicate significant differences in the corrected mortality of S. exigua larvae at 120 h (P<0.05, LSD).

2.7 Bt-GS57對甜菜夜蛾4齡幼蟲SePGRP-SA及抗菌肽相關(guān)基因表達量的影響

qRT-PCR結(jié)果(圖7)顯示，4齡幼蟲SePGRP-SA的表達量在取食(Bt-GS57侵染)24和48 h極顯著高于對照組(ddH2O)(P<0.01)。在Bt-GS57侵染24 h時，SePGRP-SA的表達水平較對照組上升4倍，48 h時表達量最高，較對照組上升9倍(圖7: A)。取食Bt-GS57后抗菌肽相關(guān)基因Ceropin,Attacin和Defensin在24和48 h時的表達量極顯著高于對照組(P<0.01)(圖7: B-D)，與SePGRP-SA基因的變化趨勢一致。研究結(jié)果顯示甜菜夜蛾SePGRP-SA參與識別Bt，并調(diào)控中腸抗菌肽相關(guān)基因的表達。

圖7 蘇云金芽胞桿菌Bt-GS57對甜菜夜蛾4齡幼蟲中腸SePGRP-SA及相關(guān)抗菌肽基因表達量的影響Fig.7 Effects of Bacillus thuringiensis Bt-GS57 on the expression levels of SePGRP-SA and antimicrobialpeptide-related genes in the midgut of the 4th instar larvae of Spodoptera exiguaA: SePGRP-SA; B: Ceropin; C: Attacin; D: Defensin.ddH2O: 空白對照Blank control.甜菜夜蛾4齡幼蟲饑餓處理12 h后, 置于含300 μL Bt-GS57胞晶混合物(4 mg/mL)的無菌飼料中。qRT-PCR測定甜菜夜蛾幼蟲在取食(Bt-GS57侵染)0, 24, 48和72 h時, 幼蟲中腸中SePGRP-SA及抗菌肽基因(Ceropin, Attacin, Defensin)的相對表達量。圖中數(shù)據(jù)為3次獨立生物學重復的平均值±標準誤；柱上雙星號表示差異極顯著(P<0.01, Student氏t檢驗)。After starvation treatment for 12 h, the 4th instar larvae of S. exigua were placed in axenic diet containing 300 μL of Bt-GS57 cell mixture (4 mg/mL).The expression levels of SePGRP-SA and AMP genes (Ceropin, Attacin, Defensin) in the midgut of S. exigua larvae at 0, 24, 48 and 72 h after feeding (Bt-GS57 infection) were assayed by qRT-PCR.Data in the figure are mean±SE of three independent experiments.The double asterisk above bars indicates extremely significant difference (P<0.01, Student’s t-test).

3 討論

肽聚糖識別蛋白PGRP是識別外來微生物的重要模式識別受體之一(Kamareddineetal., 2018; Keshavarzetal., 2020)，在昆蟲的先天免疫中發(fā)揮著重要的識別和免疫功能(Wangetal., 2019)。本研究克隆得到了甜菜夜蛾SePGRP-SA全長cDNA，系統(tǒng)進化樹分析可知SePGRP-SA與斜紋夜蛾SlPGRP親緣關(guān)系最高(圖2)，且在不同物種間比較保守，暗示著其功能的保守性。通過對SePGRP-SA表達模式分析，SePGRP-SA從卵期到蛹期均有表達(圖3: A)，表明其參與甜菜夜蛾全部生活史。SePGRP-SA在4齡幼蟲血淋巴中高表達(圖3: B)，表明SePGRP-SA可能在甜菜夜蛾腸道免疫中發(fā)揮了重要作用。

已有研究證明，PGRP-SA和PGRP-SD通過識別革蘭氏陽性細菌Lys型肽聚糖(peptidoglycan, PGN)后，激活Toll信號通路，產(chǎn)生AMPs，來防御病原微生物的侵染(Micheletal., 2001; Aggrawal and Silverman, 2007)。沉默PGRP基因后的小菜蛾，其下游抗菌肽基因Defensin,Cecropin,Moricin-2和Lysozyme的相對豐度降低，加入Bt后，小菜蛾存活率顯著降低(Dawadietal., 2018)。本研究中甜菜夜蛾SePGRP-SA基因沉默后，下游抗菌肽相關(guān)基因Defensin,Cecropin和Attacin的表達下調(diào)(圖4)，顯著增加了甜菜夜蛾對Bt-GS57菌株的敏感性(圖6)。推測SePGRP-SA基因沉默后，甜菜夜蛾中腸細菌16S rRNA基因的相對表達量顯著上調(diào)，細菌總量顯著上升，中腸優(yōu)勢菌屬腸球菌16S rRNA基因及條件致病菌蠟樣芽胞桿菌的gyrB基因相對表達量也顯著增加(圖5)，導致腸道微生物失調(diào)。Bt-GS57侵染甜菜夜蛾后，引起SePGRP-SA和抗菌肽相關(guān)基因表達量升高(圖7)，表明SePGRP-SA和抗菌肽相關(guān)基因相互作用以抵御病原微生物的侵染。本研究通過對SePGRP-SA基因的鑒定及序列分析，利用RNAi技術(shù)明確了SePGRP-SA基因在甜菜夜蛾腸道免疫調(diào)控中的重要作用，初步探索了Bt對腸道免疫基因的影響，為更好地利用Bt防治甜菜夜蛾等害蟲提供了分子手段。