曾韋珊，黃林旺，呂欣欣，毛積鵬，2，馮志恒，劉天頤，黃少偉

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) a.林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院；b.廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642；2.臺(tái)山市紅嶺種子園，廣東 臺(tái)山 529223）

濕加松Pinus elliottii×P.caribaea是濕地松Pinus elliottii與加勒比松Pinus caribaea，包括古巴本種、洪都拉斯和巴哈馬變種的雜交子代，為20世紀(jì)50年代由澳大利亞昆士蘭林業(yè)研究所培育，其綜合了雙親的優(yōu)良特性，具有生長(zhǎng)速度快、生長(zhǎng)量大、耐水濕、樹干通直、抗性好等優(yōu)點(diǎn)[1-2]，目前在我國(guó)南方省區(qū)廣泛使用。松針（pine needles）為松科植物Pinaceae 松屬Pinus植物的針形葉，其含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和黃酮類活性物質(zhì)，具有多樣的保健作用，如抗衰老氧化[3]、抗癌[4]、抑菌[5]等。類黃酮（flavonoids）化合物是具有廣泛生物活性的植物次生代謝產(chǎn)物，主要包括查耳酮、黃酮、黃酮醇、黃烷雙醇、花色素苷、縮合單寧等，其參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和防御，是植物色素的主要來源，在植物各個(gè)部位都有積累，此外，類黃酮化合物的抗氧化、抗癌、抗誘變、抗紫外線輻射等作用對(duì)人類的健康有積極作用，其中黃酮類成分兒茶素和表兒茶素具有抗氧化、抗心血管疾病、抗癌等作用[6]。目前檢測(cè)植物提取物中活性成分的方法主要有高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）、紫外分光光度計(jì)法等[7]，雖然上述測(cè)定方法精準(zhǔn)度較高，但存在預(yù)處理復(fù)雜、操作過程中試劑易污染、不易操作、成本高等局限性[8]。

近紅外光譜（Near Infrared Spectroscopy，NIRS）技術(shù)能將光譜測(cè)量、化學(xué)計(jì)量學(xué)和基本測(cè)量相結(jié)合，對(duì)樣品成分含量進(jìn)行快速檢測(cè)，可以客觀地反映樣品成分的整體物質(zhì)基礎(chǔ)，并反映其有機(jī)成分、礦物質(zhì)組成和特征成分。相比于其他技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、高效、低成本、分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)[9]，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)[10]、食品[11]、醫(yī)藥[12]等領(lǐng)域。在林木研究中，近紅外光譜技術(shù)被用于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量檢測(cè)、品種鑒別、霉變和缺陷判別等方面，如Yi 等[13]預(yù)測(cè)了在570～1 840 nm波段內(nèi)的核桃營(yíng)養(yǎng)成分，其中水、蛋白質(zhì)、脂肪的決定系數(shù)（R2）分別為0.952、0.977 和0.990，預(yù)測(cè)均方根誤差（RMSEP）分別為0.058、0.182和0.191；Manfredi 等[14]利用便攜式紅外光譜儀與多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)合對(duì)榛子品種分類，發(fā)現(xiàn)向后消去偏二乘（backward elimination partial least square,BE-PLS）分類模型的交叉驗(yàn)證準(zhǔn)確率達(dá)98.18%，比偏最小二乘（partial least square,PLS）高；Canneddu 等[15]用近紅外光譜預(yù)測(cè)影響澳洲堅(jiān)果風(fēng)味的過氧化值（peroxide value,PV）和酸度指數(shù)（acidity index,AI），過氧化值的R2為0.72，酸度指數(shù)的R2為0.8。本研究用96 份濕加松松針粉材料，構(gòu)建了兒茶素和表兒茶素總量近紅外模型，能夠快速測(cè)定濕加松松針中的活性成分含量，為濕加松高含量活性成分的篩選提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以種植于廣東省臺(tái)山市紅嶺種子園的6年生濕加松子代測(cè)定林為研究材料，于2019年8月隨機(jī)采取111 個(gè)生長(zhǎng)旺盛且無病蟲害單株的當(dāng)年生松針組織部位鮮樣約100 g，立即將采集到的松針樣品帶回實(shí)驗(yàn)室去除枝梢、枯葉。利用鼓風(fēng)干燥箱在75℃條件下對(duì)松針進(jìn)行加熱干燥，干燥時(shí)間為72 h。干燥后的松針經(jīng)過充分粉碎后過60 目篩，裝入密封袋，得到111 份濕加松松針粉末樣本。隨機(jī)選擇其中96 份樣本作為預(yù)測(cè)集，其余15 份樣本作為外部驗(yàn)證集。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 濕加松針葉兒茶素和表兒茶素含量的測(cè)定

樣品前處理。用電子天平稱取200 mg 濕加松松針粉樣本，放入2 mL 離心管中。加入600 μL甲醇溶液，渦旋振蕩30 s，室溫超聲15 min。12 000 r/min 4℃離心10 min，吸取上清液并使其過0.22 μm 濾膜，將過濾液裝入檢測(cè)瓶待分析。

液質(zhì)聯(lián)用儀分析條件。美國(guó)Waters 公司API5000 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀，色譜條件：色譜 柱ACQU ITY UPLC?BEH C18（2.1×100 mm，1.7 μm），柱溫40℃，進(jìn)樣量5 μL。流動(dòng)相：以0.1%甲酸作A 相，甲醇為B 相，流速0.25 mL/min。洗脫梯度：10% B，0～1 min；10 %～33 % B，1～3 min；33 %，3～10 min B；33%～50% B，10～15 min；50%～90% B，15～20 min；90 % B，20～21 min；90%～10% B，21～22 min；10% B，22～25 min。

質(zhì)譜條件。電噴霧負(fù)離子源（ESI），用多重反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）模式進(jìn)行掃描，離子源溫度500℃，電壓4 500 V，氣簾氣是30 psi，碰撞氣為6 psi，霧化氣和輔助氣均為50 psi。

1.2.2 光譜采集

使用型號(hào)為DA7200 的近紅外光譜分析儀（瑞典波通儀器公司），在進(jìn)行光譜采集前將樣品放置于溫度為22℃左右的實(shí)驗(yàn)室中24 h，掃描樣品前儀器開機(jī)預(yù)熱30 min，光譜掃描波長(zhǎng)為950～1 650 nm，光斑直徑為3.5 cm，SPC 文件分辨率為5 nm，光譜采集速度約為100 條光譜/s，掃描次數(shù)為100 次/s。每一個(gè)松針粉樣品掃描3 次，重復(fù)裝樣3 次，取平均光譜，保存數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。

1.2.3 光譜預(yù)處理

近紅外光譜儀除了采集樣品本身的信息外，還包含了噪音、樣品背景、雜散光等其他信息。為了消除干擾信息，提高模型精準(zhǔn)度，需對(duì)原始光譜進(jìn)行異常樣品的剔除、降噪、有效信息提取等預(yù)處理。常用的預(yù)處理方法有：平滑（Smoothing）、導(dǎo)數(shù)（Derivative）、數(shù)據(jù)增強(qiáng)變換（Data enhancement）、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換（Standard normal variable transformation,SNV）、多元散射校正（Multiplicative scatter correction,MSC）和傅里葉變換（Fourier transform,TF）等[16]。平滑算法（Smoothing）假設(shè)光譜噪聲是以零為中心而產(chǎn)生的均勻隨機(jī)白噪聲，若多次測(cè)量求取平均值可消除噪聲并提高樣品信號(hào)；樣品的不均勻性、光透過樣品或從樣品反射回來產(chǎn)生的散射會(huì)對(duì)樣品光譜帶來誤差，標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換算法（SNV）可以用來校正因散射而引起的光譜誤差，在光譜研究中有著廣泛的應(yīng)用；多元散射校正將樣品集的平均光譜與每個(gè)樣品任意波長(zhǎng)點(diǎn)下反射吸光度值看成近似線性關(guān)系，以消除由樣本顆粒分布不均勻、顆粒大小不同所產(chǎn)生的散射對(duì)光譜的影響，校正光譜信息；導(dǎo)數(shù)算法是近紅外模型中常用的一種預(yù)處理方法，其能夠有效消除基線漂移和其他干擾背景，提高模型準(zhǔn)確性。

1.2.4 近紅外模型的建立

在獲得近紅外光譜數(shù)據(jù)以及參照數(shù)據(jù)以后，依次進(jìn)行光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理、建立近紅外模型、模型外部驗(yàn)證3 個(gè)步驟。將采集的光譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入The Unscrambler 軟件，光譜波長(zhǎng)范圍為950～1 650 nm，對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理，用偏最小二乘法（Partial Least Square Regression，PLS）回歸分析建立模型,在PLS 算法中采用交叉證實(shí)法。偏最小二乘判別分析法根據(jù)觀察或測(cè)量到的若干變量值對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行判別分析，是一種有監(jiān)督的判別分析方法，其可以減少變量間多重共線性產(chǎn)生的影響，并根據(jù)不同處理樣本的特征建立一定的判別準(zhǔn)則，即要求由各因素構(gòu)成的數(shù)據(jù)矩陣X分解得到的隱變量t與由各目標(biāo)構(gòu)成的數(shù)據(jù)矩陣Y分解得到的隱變量u相關(guān)程度最大或重疊最大，并利用它對(duì)新的觀測(cè)對(duì)象進(jìn)行類別判定[17]。模型建好后，剔除異常值優(yōu)化模型，得到濕加松兒茶素和表兒茶素總量預(yù)測(cè)最優(yōu)近紅外模型。

1.2.5 近紅外模型的評(píng)價(jià)

在建立光譜模型的過程中，需要借助化學(xué)計(jì)量學(xué)指標(biāo)對(duì)模型的好壞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本研究采用樣本校正相關(guān)系數(shù)R2、校正均方根誤差RMSEC、交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)R2cv、交互驗(yàn)證均方根誤差RMSEV、預(yù)測(cè)均方根誤差RMSEP 等參數(shù)評(píng)價(jià)模型的質(zhì)量，公式如下[18]：

式（1）～（2）中：n為樣品數(shù)，Si為實(shí)測(cè)值，為實(shí)測(cè)值的平均值，為預(yù)測(cè)值。

在上述指標(biāo)中，R2、R2cv、RMSEC、RMSEV和RMSEP 是有效評(píng)價(jià)模型的指標(biāo)，其中，R2、評(píng)價(jià)模型的擬合效果，RMSEC、RMSEV 和RMSEP 評(píng)價(jià)模型的預(yù)測(cè)精度。模型中校正集相關(guān)系數(shù)R2和交互驗(yàn)證集相關(guān)系數(shù)的值越接近1，校正集均方根誤差（Root Mean Square Error of Calibration，RMSEC）和交互驗(yàn)證集均方根誤差（Root Mean Square Error of Validation，RMSEV）值越小，則模型的預(yù)測(cè)效果越好[19]。通過驗(yàn)證集進(jìn)行外部驗(yàn)證檢驗(yàn)?zāi)Ｐ唾|(zhì)量，得到的相關(guān)系數(shù)（Related coefficient，R）越高，預(yù)測(cè)均方根誤差（Root Mean Square Error of Prediction，RMSEP）越低，模型效果越好。此外，模型的校正集、預(yù)測(cè)集和驗(yàn)證集各個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)越接近，說明最終得到的模型效果越好、越理想。

2 結(jié)果與分析

2.1 松針粉兒茶素和表兒茶素實(shí)測(cè)值的數(shù)據(jù)特征

松針粉樣品的兒茶素和表兒茶素含量用液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定（表1），96 個(gè)校正集樣品兒茶素和表兒茶素總量最小值為2.7660 μg·g-1，最大值為66.9120 μg·g-1，平均值為17.5294 μg·g-1，標(biāo)準(zhǔn)差為11.1553 μg·g-1。15 個(gè)驗(yàn)證集樣品兒茶素和表兒茶素總量最小值為8.5960 μg·g-1，最大值為28.9250 μg·g-1，平均值為15.715 0 μg·g-1，標(biāo)準(zhǔn)差為5.6942 μg·g-1。

2.2 96 個(gè)樣品近紅外原始光譜

近紅外光譜是分子在近紅外光照射下，伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的倍頻與伸縮振動(dòng)和彎曲振動(dòng)產(chǎn)生的合頻吸收，其與分子的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，分子結(jié)構(gòu)不同或所處化學(xué)環(huán)境不同，產(chǎn)生的光譜信息有明顯差異，因此，可通過分析樣品吸收光譜時(shí)得到的光譜信息，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)建立模型。本實(shí)驗(yàn)通過軟件The Unscrambler 9.7 采集96 個(gè)濕加松松針粉樣品的近紅外反射光譜，得到樣品的近紅外原始光譜圖，如圖1所示。光譜波段為950～1 650 nm，從圖中可看到一個(gè)顯著的吸收峰，樣品的吸光度在0.2 以下，同一波長(zhǎng)不同樣品的吸收強(qiáng)度各不相同，但是不同波長(zhǎng)下所有樣品的走勢(shì)、波峰、波谷基本相似，在1 460 nm 處吸收峰較強(qiáng)。每份樣品在同一波長(zhǎng)下的吸光度不同，表明濕加松松針粉樣品間兒茶素和表兒茶素總量有差異，近紅外光譜和成分含量之間的關(guān)系可以通過建立數(shù)學(xué)模型來反映。

表1 濕加松針葉兒茶素和表兒茶素總量校正集與驗(yàn)證集統(tǒng)計(jì)表Table 1 Statistical table of total amount of catechin and l-epicatechin correction set and verification set of Pinus elliottii×P.caribaea needles

圖1 96 個(gè)校正集樣品近紅外原始反射光譜Fig.1 Near infrared original reflection spectrum of 96 correction set samples

2.3 近紅外模型預(yù)處理結(jié)果

本研究用一種及多種處理方法結(jié)合對(duì)近紅外原始光譜進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果見表2。不同的預(yù)處理方式對(duì)濕加松兒茶素和表兒茶素總量的建模效果不同，分別采用Smoothing S.Golay、MSC 和Normalize 方式處理模型，模型并未得到明顯優(yōu)化，甚至處理后的參數(shù)值比原始參數(shù)低；而對(duì)模型分別進(jìn)行SNV、Derivatives S.Golay、Smoothing S.Golay+Derivatives S.Golay+SNV、Derivatives S.Golay+MSC、Smoothing S.Golay+Derivatives S.Golay+MSC、Derivatives S.Golay+SNV、Smoothing S.Golay+Derivatives S.Golay 預(yù)處理，模型得到了優(yōu)化，且預(yù)處理方式為Smoothing S.Golay+Derivatives S.Golay 時(shí)，模型的校正相關(guān)系數(shù)R2和交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)R2cv值最大，校正均方根誤差RMSEC 和交互驗(yàn)證均方根誤差RMSEV值最低，模型達(dá)到最佳。

2.4 近紅外模型的建立

使用The Unscrambler 9.7 軟件對(duì)近紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用偏最小二乘法（Partial least squares method,PLS）交叉驗(yàn)證（Cross validation）建立近紅外光譜預(yù)測(cè)模型，建模波段為950～1 650 nm，主成分?jǐn)?shù)為16，預(yù)處理方法為Smoothing S.Golay+Derivatives S.Golay，預(yù)處理后光譜圖如圖2所示。建模結(jié)果見圖3，兒茶素和表兒茶素總量最優(yōu)模型的校正相關(guān)系數(shù)R2為0.935 2，交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)R2cv為0.754 5，表明模型擬合度高，校正均方根誤差RMSEC 為2.145 8，交互驗(yàn)證均方根誤差RMSEV 為4.313 3，模型預(yù)測(cè)能力良好。

表2 濕加松兒茶素和表兒茶素總量不同預(yù)處理模型結(jié)果Table 2 Results of different pretreatment models of total catechin and l-epicatechin in Pinus elliottii × P.caribaea

圖2 Smoothing S.Golay+Derivatives S.Golay 處理紅外光譜圖Fig.2 Near infrared spectrogram processed by Smoothing S.Golay+Derivatives S.Golay Method

2.5 兒茶素和表兒茶素定量分析模型的驗(yàn)證

隨機(jī)選取15 份（不包括校正集樣品）樣品對(duì)已建立的近紅外模型進(jìn)行外部驗(yàn)證，結(jié)果表明，松針樣品的兒茶素和表兒茶素含量的外部檢驗(yàn)相關(guān)系數(shù)為0.833 9，預(yù)測(cè)均方根誤差RMSEP 為3.739 1，絕對(duì)誤差在0.02～8.82 之間，相對(duì)誤差在0.19%～50.53%之間，表明模型的預(yù)測(cè)值與真實(shí)值吻合程度高，可用于樣品含量的初步預(yù)測(cè)。

圖3 濕加松針葉兒茶素和表兒茶素總量模型預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.3 Prediction results of total needle catechin and l-epicatechin model of Pinus elliottii×P.caribaea

圖4 兒茶素和表兒茶素總量模型的外部驗(yàn)證結(jié)果Fig.4 External validation results of total catechin and l-epicatechin model

3 討 論

近紅外光譜分析的核心在于基于化學(xué)計(jì)量學(xué)的數(shù)學(xué)模型建立，在采集光譜的過程中往往會(huì)受到儀器自身或者外部測(cè)試環(huán)境等因素的影響而產(chǎn)生噪聲，需對(duì)原始光譜進(jìn)行預(yù)處理。光譜預(yù)處理方法對(duì)建立預(yù)測(cè)能力強(qiáng)、穩(wěn)定性好的模型尤為重要，在不同物種最優(yōu)近紅外模型建立中，預(yù)處理方法不盡相同，如油菜硫苷近紅外模型采用Derivatives SG3+SNV 預(yù)處理，建立的模型較好[20]；向日葵籽仁油酸、亞油酸和棕櫚酸的最佳光譜預(yù)處理方法分別為SNV+1st，MSC+1st，SNV[21]；在建立杉木中綜纖維素和木質(zhì)素含量近紅外模型時(shí)，采用二階微分處理和平滑預(yù)處理，所得模型可快速測(cè)定木材中綜纖維素和木質(zhì)素含量[22]；在梨果糖濃度的近紅外光譜預(yù)處理方法研究中，王偉明等[23]發(fā)現(xiàn)使用平滑預(yù)處理得到的模型較好。本研究對(duì)濕加松兒茶素和表兒茶素總量的近紅外模型采用了10 種預(yù)處理方式，發(fā)現(xiàn)預(yù)處理方法為Smoothing S.Golay+Derivatives S.Golay 時(shí)模型最優(yōu)，建立的模型能夠滿足樣品成分含量的快速測(cè)定。

利用近紅外光譜技術(shù)測(cè)定兒茶素和表兒茶素含量，目前已有相關(guān)報(bào)道，因材料、方法等不同，有些方法對(duì)兒茶素含量的評(píng)估效果較為理想，有些則效果不佳。李賽楠等[24]建立火炬松表兒茶素近紅外預(yù)測(cè)模型，經(jīng)過MSC+FD+S.Golay 預(yù)處理后，校正相關(guān)系數(shù)RC為0.973 9，模型達(dá)到最優(yōu)；黃俊仕等[25]建立了檢測(cè)綠茶滋味品質(zhì)指標(biāo)酚氨比近紅外預(yù)測(cè)模型，并將近紅外光譜技術(shù)與化學(xué)計(jì)量學(xué)方法結(jié)合，有效提高檢測(cè)精度；陳華才等[26]用近紅外光譜技術(shù)對(duì)茶多酚中的總兒茶素含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)波長(zhǎng)為1 000～2 500 nm，光譜經(jīng)過SNV 預(yù)處理后，建模效果最好；劉洪林[27]對(duì)功夫紅茶咖啡堿和5 種兒茶素組分進(jìn)行近紅外快速測(cè)定，發(fā)現(xiàn)6 種成分中兒茶素模型預(yù)測(cè)能力最低，表兒茶素居中，總體上各模型預(yù)測(cè)性能優(yōu)；郭志明[28]利用近紅外光譜檢測(cè)綠茶中的有效成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LS-SVM 模型的泛化能力和預(yù)測(cè)精度俱佳；陳美麗等[29]對(duì)茉莉花中的主要成分建立近紅外光譜分析模型，發(fā)現(xiàn)模型中兒茶素和表兒茶素的預(yù)測(cè)值與真實(shí)值間相關(guān)系數(shù)達(dá)0.9 以上，模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性高。

迄今為止，基于近紅外光譜技術(shù)對(duì)濕加松針葉兒茶素和表兒茶素總量測(cè)定的研究未見報(bào)道。本研究建立的濕加松針葉兒茶素和表兒茶素總量近紅外預(yù)測(cè)模型，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，可靠性好，可用于濕加松針葉兒茶素和表兒茶素總量的快速測(cè)定和質(zhì)量評(píng)價(jià)，有助于今后濕加松高含量活性成分的優(yōu)良個(gè)體的篩選，為今后培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的濕加松個(gè)體奠定基礎(chǔ)。但本試驗(yàn)對(duì)儀器的穩(wěn)定性要求嚴(yán)格且建模所采用的松針樣品數(shù)量有限，故建立的模型有一定的局限性，今后可加大建模樣本量進(jìn)一步提高模型的預(yù)測(cè)效果。

4 結(jié) 論

本研究采用近紅外光譜技術(shù)，選擇Smoothing S.Golay+Derivatives S.Golay 預(yù)處理方法，剔除數(shù)據(jù)中的異常值，建立了濕加松針葉兒茶素和表兒茶素含量的近紅外預(yù)測(cè)模型。校正相關(guān)系數(shù)R2為0.935 2，校正均方根誤差（RMSEC）為2.145 8，交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)R2cv=0.754 5，交互驗(yàn)證均方根誤差（RMSEV）為4.313 4，外部驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)R為0.833 9，預(yù)測(cè)均方根誤差（RMSEP）為3.739 1。模型的相關(guān)系數(shù)較高，表明建立的近紅外光譜預(yù)測(cè)模型精度高，預(yù)測(cè)效果佳，適用于濕加松針葉兒茶素和表兒茶素含量的快速鑒定，有利于加快對(duì)高含量生物活性成分的濕加松個(gè)體篩選的研究。