楊清松 韋獻(xiàn)雅 楊青 王應(yīng)梅 陶永宏

（1.云南省文山壯族苗族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院 云南文山 663099；2.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院 四川成都 610000）

生姜（Zingiber officinaleRoscoe.）為姜科多年生草本植物，又稱生姜、黃姜等，我國(guó)中部、東南部至西南部各省區(qū)廣為栽培，亞洲熱帶地區(qū)亦常見(jiàn)栽培。生姜是藥用、食用、加工等多用途經(jīng)濟(jì)作物，是我國(guó)重要的外貿(mào)產(chǎn)品，具有市場(chǎng)需求大、產(chǎn)量高、經(jīng)濟(jì)效益好等特點(diǎn)，中國(guó)是世界上生姜栽培面積最大且生產(chǎn)總量最多的國(guó)家[1-4]。生姜一般不開(kāi)花，很難進(jìn)行有性繁殖，生產(chǎn)上主要進(jìn)行無(wú)性繁殖。無(wú)性繁殖的生姜容易受到多種病毒的侵染，造成品種嚴(yán)重退化、產(chǎn)量下降、種質(zhì)資源變劣，一般減產(chǎn)30%～50%，嚴(yán)重制約了生姜的生產(chǎn)發(fā)展[5]。云南地方生姜品種是當(dāng)?shù)刂匾?jīng)濟(jì)作物，主要靠農(nóng)戶自己留種種植，多年種植后種性退化嚴(yán)重，生姜產(chǎn)量和品質(zhì)受到很大影響，亟需快繁技術(shù)進(jìn)行品種提純復(fù)壯。國(guó)內(nèi)外目前尚無(wú)高抗病毒的生姜品種和高效殺滅病毒藥劑，因此采用莖尖組織培養(yǎng)脫毒生姜苗，成為防治病毒提高生姜產(chǎn)量和品質(zhì)的首選方法[6]。本研究利用熱處理和莖尖脫毒相結(jié)合的方法進(jìn)行催芽鈍化病毒、表面消毒、莖尖分生組織剝?nèi)?，?duì)無(wú)菌苗誘導(dǎo)培養(yǎng)（基本培養(yǎng)基為 MS附加不同比例的激素）、繼代誘導(dǎo)培養(yǎng)、生根誘導(dǎo)等一系列實(shí)驗(yàn)操作及培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化，旨在建立文山地方品種生姜快繁體系，為姜種的快速繁殖提供技術(shù)保障，同時(shí)為其生產(chǎn)應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為文山地方生姜品種小黃姜，2018年9月收獲，2019年2月份芽點(diǎn)萌發(fā)，待用。

1.2 方法

1.2.1 無(wú)菌苗誘導(dǎo)培養(yǎng)

1.2.1 .1 選材及熱處理選取優(yōu)良單株作莖尖剝離材料，采用熱處理結(jié)合莖尖脫毒技術(shù)。放置在光照培養(yǎng)箱中以長(zhǎng)光照高溫?zé)崽幚恚?6 h光照，38～41℃；8 h 黑暗，30～32℃）一周。

1.2.1 .2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基的制備MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+瓊脂 7 g/L+蔗糖30 g/L；MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L；MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+瓊脂 7 g/L+蔗糖 30 g/L，熬制好后分裝入瓶。在 0.12 Mpa/cm2壓力下滅菌20～ 23 min，冷卻備用。

1.2.1 .3 莖尖剝離接種將生姜 2～3 cm 的嫩芽放入紗布袋，加 1～2滴洗潔精，用自來(lái)水沖洗 1 h后，倒掉水，置于超凈工作臺(tái)中，在75%酒精中浸泡 20～30 s，再用 2%次氯酸鈉溶液消毒 12～18 min；取出用無(wú)菌水沖洗 3～5次，用滅菌濾紙吸干材料表面水分，在體視解剖鏡下用手術(shù)刀等工具輕、準(zhǔn)、快速地剝?nèi)ビ兹~，切取帶2～4個(gè)葉原基（1.0 mm左右）的生長(zhǎng)點(diǎn)，放入裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，每瓶放1個(gè)生長(zhǎng)點(diǎn)并注明品種、莖尖號(hào)、接種日期。培養(yǎng)條件：置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，日溫 21～25℃，夜溫15～18℃，光照時(shí)數(shù) l2～14 h/d，光照強(qiáng)度 2 000～3 000 1x。

1.2.2 繼代培養(yǎng)待誘導(dǎo)出芽后，在超凈工作臺(tái)中用剪刀將生姜小芽（不帶葉片）切下來(lái)接種到繼代培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方：MS+6-BA 0.5 mg/L+瓊脂 7 g/L+蔗糖 30 g/L；MS+瓊脂 7 g/L+蔗糖30 g/L；1/2 MS+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L。培養(yǎng)條件同1.2.1。

1.2.3 生根培養(yǎng)待誘導(dǎo)出芽后，在超凈工作臺(tái)中用剪刀將生姜小芽（不帶葉片）切下來(lái)接種到生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方：1/2 MS+NAA 0.1 mg/L+卡拉膠7 g/L+蔗糖30 g/L；1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+卡拉膠7 g/L+蔗糖30 g/L；1/2 MS+卡拉膠7 g/L+蔗糖30 g/L。培養(yǎng)條件同1.2.1。

1.2.4 馴化移栽基質(zhì)配方：蛭石∶珍珠巖=1∶1（m∶m，下同）（CK）；蛭石∶椰糠=2∶1；蛭石∶椰糠=1∶1；椰糠；營(yíng)養(yǎng)土；營(yíng)養(yǎng)土∶椰糠=1∶1。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方式對(duì)莖尖的影響

從表1可以看出，最佳消毒方法是75%酒精20 s+2%次氯酸鈉15 min，這種消毒方法污染率僅為5%，未污染的莖尖顏色正常，沒(méi)有出現(xiàn)壞死現(xiàn)象。酒精的消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)容易導(dǎo)致外植體邊緣褐化變色，次氯酸鈉消毒時(shí)間過(guò)程容易導(dǎo)致外植體出現(xiàn)壞死現(xiàn)象，培養(yǎng)一段時(shí)間后莖尖死亡。因此，合適的消毒方式不僅要考慮污染率，還要看后期的生長(zhǎng)狀況。

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)莖尖誘導(dǎo)的影響

從表2可以看出，在培養(yǎng)基1中，莖尖長(zhǎng)勢(shì)弱，生長(zhǎng)緩慢，芽分蘗慢；培養(yǎng)基2中，莖尖長(zhǎng)勢(shì)較快，芽分蘗側(cè)芽速度快；培養(yǎng)基3中，前期長(zhǎng)勢(shì)較快，但是長(zhǎng)了很多根毛，后期長(zhǎng)勢(shì)緩慢。可能是生姜對(duì) 6-BA濃度敏感度低，較高濃度有利于莖尖分蘗，但對(duì) NAA濃度非常敏感，容易長(zhǎng)根毛[7-8]。誘導(dǎo)生長(zhǎng)40 d的莖尖見(jiàn)圖1。

圖1 誘導(dǎo)生長(zhǎng)40 d的莖尖

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)莖尖誘導(dǎo)的影響

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)繼代培養(yǎng)的影響

使用3種不同配方培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，結(jié)果（表3）發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基 2的增殖系數(shù)較高，達(dá)到 5，并且組培苗長(zhǎng)勢(shì)正常，這可能是由于生姜本身內(nèi)源激素充足，足夠組培苗生長(zhǎng)，不需要單獨(dú)添加外源激素。培養(yǎng)基 3增殖系數(shù)僅為 3，組培苗長(zhǎng)勢(shì)比較弱，生長(zhǎng)緩慢。培養(yǎng)基1增殖系數(shù)最高，達(dá)到了 7，但是發(fā)出的芽非常弱小，后期部分死亡。

表3 不同培養(yǎng)基對(duì)繼代培養(yǎng)的影響

2.4 不同培養(yǎng)基對(duì)生根培養(yǎng)的影響

從表4可以看出，培養(yǎng)基1的生根率為100%，根系3～5根，根系粗短，為較適宜的生根培養(yǎng)基；培養(yǎng)基2生根率100%，但是根系多，根系細(xì)長(zhǎng)；培養(yǎng)基3生根率80%，根系多，細(xì)小，容易折斷。生根階段使用卡拉膠，移栽時(shí)根部培養(yǎng)基易清洗，減少根部損傷，增加移栽成活率。培養(yǎng)基1生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖2。

圖2 培養(yǎng)基1生姜生長(zhǎng)情況

表4 不同培養(yǎng)基對(duì)生根培養(yǎng)的影響

2.5 不同材料配制栽培基質(zhì)對(duì)生姜種姜繁育的影響

基質(zhì)栽培是用自身不含營(yíng)養(yǎng)成分的珍珠巖、蛭石、河沙等代替土壤作為基質(zhì)，高密度栽植試管苗，在部分或全部人工控制溫、光、水、肥及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等條件下，快速繁育種姜獲得下代姜種[9-10]。本試驗(yàn)將資源豐富的營(yíng)養(yǎng)土（屬于優(yōu)質(zhì)低位泥炭土）、椰糠（椰子外殼纖維粉末）運(yùn)用到生姜種姜的生產(chǎn)中，試驗(yàn)效果良好。以小黃姜為材料，經(jīng)栽培基質(zhì)配制試驗(yàn)可知，在相同栽培條件和管理措施下，不同材料配制栽培基質(zhì)中，最優(yōu)栽培基質(zhì)為“營(yíng)養(yǎng)土∶椰糠=1∶1”（表5），比傳統(tǒng)對(duì)照采用“蛭石+珍珠巖=2∶1”的基質(zhì)，產(chǎn)量提高50%，經(jīng)濟(jì)效益明顯增加。處理6生姜移栽生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖3。

表5 不同材料配制栽培基質(zhì)對(duì)生姜種姜繁育的影響

圖3 處理6生姜移栽生長(zhǎng)情況

3 討論與結(jié)論

姜種的快速繁殖可提供技術(shù)保障，為生產(chǎn)應(yīng)用提供支撐。生姜有許多個(gè)品種，在具體的組培快繁中應(yīng)根據(jù)生姜品種選擇合適的培養(yǎng)基、激素配比及培養(yǎng)條件，以完善生姜的組培快繁技術(shù)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，6-BA能促進(jìn)生姜愈傷組織誘導(dǎo)與分化，但不同生姜品種在組織培養(yǎng)中對(duì)6-BA和NAA的濃度配比要求不同，這可能與生姜不同品種的基因型和培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。過(guò)高的NAA 濃度也會(huì)抑制生姜幼苗不定芽的形成，適宜的較低濃度的 NAA能和 6-BA起到協(xié)同增益的作用，既能促進(jìn)生姜幼苗不定芽的發(fā)生，又能促進(jìn)生姜組培苗生長(zhǎng)[5,11]。葛勝娟[12]研究認(rèn)為，添加6-BA和NAA的培養(yǎng)基更能促進(jìn)生姜幼芽的分化和增殖。本實(shí)驗(yàn)表明，在誘導(dǎo)階段，NAA濃度同為0.1 mg/L時(shí)，6-BA濃度為1.0 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)效果最好；NAA濃度增加到 0.5 mg/L，誘導(dǎo)效果降低。呂金麗等[13]的研究結(jié)果也表明，當(dāng) 6-BA濃度相同，NAA濃度過(guò)大時(shí)，會(huì)抑制愈傷的形成。此外，本實(shí)驗(yàn)表明，最佳繼代培養(yǎng)基為MS+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L，當(dāng)加入6-BA后，發(fā)出的芽非常弱小，后期部分死亡，這與呂金麗等[13]和王少銘等[14]研究得出的最佳繼代培養(yǎng)基都加入了 6-BA和 NAA的結(jié)果不一致，這可能是地域及地方品種的不一致所造成的差異。本研究結(jié)果可為云南文山當(dāng)?shù)厣獌?yōu)良種苗的快速繁殖提供技術(shù)支撐，同時(shí)為文山種質(zhì)資源保存、組培擴(kuò)繁、品種改良、育種等研究奠定基礎(chǔ)，促進(jìn)文山州及周邊地區(qū)生姜產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。