任秋萍 吳憂 沈建英 黃睿婷 梁文娜

摘要：目的 研究柴胡疏肝散對圍絕經期綜合征肝郁證模型大鼠行為學的影響及對血清中PROG（孕酮）、T（睪酮）含量的影響。方法 選取30只雌性SD大鼠，隨機分成正常組、模型組和給藥組，采用雙側卵巢去勢手術加上經典的CUMS（慢性溫和不可預知刺激）方法建立圍絕經期綜合征肝郁證的大鼠模型，用柴胡疏肝散在造模同時進行灌胃干預，共計21 d。造模前后2次進行行為學實驗;實驗結束后采用ELISA法（酶聯免疫吸附法）測定各組大鼠血清中相應指標PROG（孕酮）、T（睪酮）的含量。結果 在曠場實驗結果中，模型組的移動總距離和直立次數較正常組均下降（P<0.05），給藥組的移動總距離比模型組顯著增加（P<0.01），給藥組直立次數比模型組增多（P<0.05）;在強迫游泳實驗中，各組大鼠的游泳不動時間無差異（P>0.05）;ELISA實驗結果中，模型組的睪酮、孕酮水平比正常組均下降（P<0.01）;給藥組大鼠血清睪酮含量比模型組顯著提高（P<0.01），給藥組血清孕酮含量與模型組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結論 柴胡疏肝散可改善圍絕經期綜合征肝郁證大鼠的抑郁樣行為，提高大鼠血清中的睪酮激素水平。

關鍵詞：圍絕經期綜合征;肝郁證;孕酮;睪酮;行為;柴胡疏肝散

中圖分類號：R285.5?? 文獻標志碼：A?? 文章編號：1007-2349（2022）05-0062-04

Effects of Chaihu Shugan Powder on Behavior and Serum T and PROG Levels in Ratswith Perimenopausal Syndrome and Liver Stagnation Syndrome

REN Qiu-ping1，2， WU You1，2， SHEN Jian-ying1， HUANG Rui-ting1， LIANG Wen-na1，2

（1. Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China;2. Key Laboratory of TCM Health Status Identification of Fujian， Fuzhou 350122， China）

【Abstract】Objective： To study the effect of Chaihu Shugan Powder on the behavior of rats with perimenopausal syndrome and liver stagnation syndrome and the effect on the level of PROG （progesterone） and T （testosterone） in serum. Methods： 30 female SD rats were selected and randomly divided into normal group， model group and administration group. Bilateral ovariectomy combined with classical CUMS （chronic mild and unpredictable stimulation） method was used to establish rat model with perimenopausal syndrome and liver stagnation syndrome. Chaihu Shugan Powder was used for gavage intervention at the same time as the model was established， for 21 days. Behavioral experiments were conducted twice before and after modeling. After the experiment， ELISA （enzyme-linked immunosorbent assay） was used to determine the contents of corresponding indexes PROG （progesterone） and T （testosterone） in the serum of rats in each group. Results： In the open field test results， the total moving distance and standing times of the model group were decreased than those of the normal group （P<0.05）. The total moving distance of the administration group was obviously increased than that of model group. The times of standing uprights of the administration group was more than that of the model group （P<0.05）. In the forced swimming test， there was no difference in the swimming immobility time of the rats in each group （P>0.05）. In the ELISA test results， the levels of testosterone and progesterone in the model group were decreased than those in the normal group （P<0.01）. Compared with that of the model group， the levels of serum testosterone in the administration group were significantly increased （P<0.01）. There was no statistically significant difference in serum progesterone levels between the administration group and the model group （P>0.05）. Conclusion： Chaihu Shugan Powder can improve the depression-like behavior of rats with perimenopausal syndrome and liver stagnation syndrome and increase the level of testosterone in serum of rats.

【Key words】Perimenopausal Syndrome; Liver Stagnation Syndrome; Progesterone; Testosterone; Behavior; Chaihu Shugan Powder

目前，我國已進入老齡化社會，圍絕經期的人數也逐年增加。而圍絕經期綜合征是婦科常見病，主要包括失眠、月經改變、潮熱、易激動、疲乏、頭痛等，而該病的主要病因是性激素分泌紊亂以及植物神經功能紊亂[1-2]。圍絕經期綜合征發(fā)病率呈逐年升高趨勢，并可引起骨質疏松、心血管疾病等一系列疾病。據世界衛(wèi)生組織統計，2030年，將有12億的婦女進入圍絕經期[3-4]，且圍絕經期綜合征發(fā)病人群越來越年輕化，其發(fā)病率可高達91.2%[5]。婦女進入圍絕經期發(fā)生的一系列變化與天癸竭、肝氣衰、腎藏衰密切相關，肝失疏泄，則情志異常，臨床以肝郁多見，而婦女圍絕經期是“郁病”的高發(fā)年齡[6]。

臨床研究表明，圍絕經期婦女孕酮、睪酮水平較非圍絕經期婦女降低[7-9]。本研究的目的是觀測圍絕經期綜合征肝郁證大鼠的行為學表現以及驗證柴胡疏肝散的解郁功效，并測定相關性激素指標的水平變化，為柴胡疏肝散的臨床治療提供更多的理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物 雌性SD大鼠30只，體質量為（230±20）g，于福建中醫(yī)藥大學動物實驗動物研究中心進行喂養(yǎng)，大鼠來源于上海吉輝實驗動物飼養(yǎng)有限公司（許可證：SCXK（滬）2007-0012）。

1.2 藥物 其藥物組成為柴胡、陳皮各6 g，白芍、枳殼、香附、川芎各4.5 g，炙甘草1.5 g（來源《景岳全書》），購買于實驗室采購系統。

1.3 主要試劑 大鼠睪酮（T）/孕酮（PROG）ELISA 檢測試劑盒（武漢華美生物科技公司，批號：CSB-E07282r）

1.4 主要儀器 Infinite M200 F200多功能酶標儀（美國無限公司）、 3K30冷凍高速離心機（美國賽格瑪公司）;自制黑色木箱（長100 cm，寬100 cm，高40 cm）;圓柱形透明玻璃桶（底部直徑20 cm，高45 cm）。

1.5 方法

1.5.1 分組 大鼠分3組，每組隨機10只，分別為正常組、模型組和給藥組。正常組大鼠只進行假手術;模型組進行雙側卵巢摘除手術與CUMS法;給藥組在建立圍絕經期綜合征肝郁證模型的同時予以藥物干預。

1.5.2 模型建立 正常組大鼠進行假手術，不摘除雙側卵巢，摘除卵巢旁部分脂肪組織。而模型組與給藥組大鼠進行雙側卵巢去勢手術，麻醉劑為10%水合氯醛，劑量為3 mL/kg，卵巢摘除后，肌內注射青霉素鈉消炎（6萬U/只）。術后休息1周后，除正常組外，其余大鼠接受21 d慢性溫和不可預知應激處理。應激源包括禁水24 h、禁食24 h、4 ℃冰水刺激5 min、夾尾2 min、45°傾斜鼠籠24 h、束縛4 h、45 ℃熱環(huán)境5 min，造模期間每天隨機給予1種刺激，每種刺激1周不超過1次。

1.5.3 給藥 正常組與模型組均以等量生理鹽水灌胃;給藥組在常規(guī)喂養(yǎng)同時采用柴胡疏肝散水煎劑灌胃，參照文獻，大鼠的給藥劑量為 3.31 g/kg，共灌胃21 d。

1.5.4 行為學實驗

1.5.4.1 強迫游泳實驗 將大鼠放進一圓柱形透明玻璃桶（玻璃桶高度50 cm）中并進行觀察，記錄大鼠4 min內的靜止時間，實驗前需對每組大鼠進行游泳適應性訓練。

1.5.4.2 曠場實驗 于造模前、造模后兩次進行曠場實驗;方法為將1只大鼠放入曠場箱最中央，記錄大鼠的跑動軌跡以及垂直次數（以大鼠雙前掌抬起離開地面記為一次垂直站立），記錄時間為5 min，每只大鼠實驗結束后，用酒精噴灑曠場箱并用毛巾清理干凈，再進行下一只大鼠實驗，重復之前的步驟。

1.5.5 血清孕酮、睪酮含量測定 ELISA法進行測定，使用相應的試劑盒并嚴格按照說明書步驟進行實驗，以酶標儀測定出的吸光值計算相應指標在血清中的濃度。

1.5.6 統計學方法 符合正態(tài)分布的實驗數據，采用單因素方差分析方法，結果以均值±標準差（x±s）表示;對于不符合正態(tài)分布的數據，采用非參數檢驗的方法，結果以中位數和四分位數（M（P25，P75））表示，運用統計學軟件SPSS 25.0進行數據分析，得出相應結果;

2 結果

2.1 曠場實驗結果比較 在造模前后分別進行曠場實驗，記錄每組大鼠總移動距離與垂直次數。結果顯示，造模后，模型組的總移動距離與垂直次數比正常組均明顯下降，差異有統計學意義（P<0.01）;給藥組大鼠在總移動距離方面比模型組有上升趨勢（P>0.05），給藥組大鼠比模型組大鼠直立次數增多，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 強迫游泳實驗結果 在模型建立前后兩次進行強迫游泳實驗，記錄每組大鼠4 min內的靜止不動時間。結果表明，造模后，模型組的游泳不動時間與正常組相比有上升趨勢（P>0.05）;給藥組大鼠不動時間較模型組有下降趨勢（P>0.05）。見表2。

2.3 大鼠血清睪酮、孕酮含量比較 ELISA結果顯示，實驗后，模型組的大鼠血清中睪酮、孕酮含量較正常組顯著下降，差異具有統計學意義（P<0.01）;給藥組大鼠血清中的睪酮含量比模型組明顯升高，差異具有統計學意義（P<0.01）。給藥組血清孕酮含量與模型組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。

3 討論

3.1 圍絕經期綜合征肝郁證模型的評價 文獻研究表明，采用去勢法建立圍絕經期綜合征大鼠模型已有較長的歷史，摘除大鼠雙側卵巢后雌二醇等雌激素水平迅速降低，在組織形態(tài)學層面觀察大鼠子宮會出現子宮內膜上皮萎縮的變化，且血管明顯變細或數量減少[10]，與臨床上圍絕經期綜合征婦女卵巢衰退的特征趨同，且手術簡便，成本較低，完成度高，由此證明摘除大鼠雙側卵巢的方式是成熟可行的。而CUMS法建立肝郁證模型是目前較為公認的一種造模方式，大鼠在一段時間內受到連續(xù)的隨機溫和負向刺激，來模擬臨床郁證患者的生活工作環(huán)境，研究發(fā)現此種造模方式會使動物出現類似抑郁癥的臨床表現，如情緒低落，活動減弱等[11]。另有研究發(fā)現，CUMS方法建立模型，動物體溫出現升高的趨勢，而抗抑郁藥物地西帕明可以有效降低動物體溫，因而認為體溫升高和焦慮指數匹配[12-13]，證明該模型可信度較高。且課題組前期多次采用去勢法結合CUMS法建立圍絕經期綜合征肝郁證大鼠模型，成模率較高，造模方法已較為完善和成熟[14-15]。

3.2 圍絕經期綜合征肝郁證對大鼠行為學的影響 在本研究的行為學實驗中，結果顯示在各組大鼠的曠場移動總距離、垂直次數以及強迫游泳的相對靜止時間在進行CUMS造模之前基本相同，差異無統計學意義。在造模后，模型組的移動總距離顯著下降，說明肝郁狀態(tài)會導致大鼠的活躍程度降低，出現明顯的情緒異常;同時大鼠的垂直次數也顯著減少，說明大鼠的探索欲下降。在強迫游泳實驗中，造模后的大鼠不動時間有延長的趨勢。研究表明，抑郁狀態(tài)下的大鼠會出現行為絕望的表現[16]，這與本研究的實驗結果一致。而給予柴胡疏肝散治療后，大鼠移動總距離和垂直次數均上升，說明柴胡疏肝散可以有效改善大鼠的行為絕望狀態(tài)，使大鼠活躍度與探索欲回升[17]。

3.3 柴胡疏肝散對大鼠血清性激素水平的影響 近年來，女性圍絕經期綜合征及相關疾病嚴重影響到這一階段婦女的生活質量和健康水平，因而受到人們關注。

圍絕經期婦女由于卵巢功能下降會導致內分泌紊亂，睪酮是雄激素的一種，在女性體內分泌，可以調節(jié)脂肪在機體的分布并且能促進蛋白質合成[18]。臨床研究中圍絕經期婦女睪酮水平下降也與本研究的實驗結果一致，在柴胡疏肝散進行干預治療后，大鼠血清中睪酮水平明顯上升，說明柴胡疏肝散可以有效改善睪酮的異常分泌情況。

中醫(yī)藥對治療圍絕經期綜合征相關疾病的效果尚佳，本研究所使用的的方劑為柴胡疏肝散，為解郁的經典方。過往研究表明柴胡疏肝散在改善圍絕經期綜合征肝郁證大鼠的抑郁焦慮狀態(tài)有較好效果[19]。方中柴胡為君藥，意在疏肝解郁，調暢情志;香附既能理氣又具有較好的止痛效果，川芎既活血又行氣，二者相合，功效更甚，此二味共為臣藥;陳皮、枳殼、芍藥與甘草理氣、柔肝，為佐藥;另外，甘草調和諸藥，因而兼為使藥。

根據本研究的結果，在連續(xù)灌胃柴胡舒肝散21 d后，可以降低大鼠在曠場實驗移動距離，減少直立次數，縮短強迫游泳不動時間，改善大鼠抑郁狀態(tài)，從行為學角度驗證了柴胡疏肝散作為疏肝解郁的經典方劑，具有較好的解郁功效。

綜上而言，柴胡疏肝散可以改善圍絕經期綜合征肝郁證大鼠的行為學表現，提高血清睪酮水平，對圍絕經期綜合征肝郁證有積極治療作用，但本研究也存在不足和局限，如其他更多性激素與疾病之間的關系，另外大鼠的抑郁狀態(tài)可能與多種神經遞質變化相關，未來可進行進一步的探索。

參考文獻：

[1]王偉，張麗萍.于波主任針藥結合治療圍絕經期綜合征經驗擷菁[J].醫(yī)學信息，2020，33（1）：158-160.

[2]李玉英，馬明福，姚勇利，等.青海地區(qū)100例圍絕經期綜合征的流行病學及激素補充治療分析[J].中華保健醫(yī)學雜志，2019，21（6）：578-580.

[3]董勝蓮，劉端，陳長香.22?。ㄊ校┡愿昶诰C合征現狀調查和影響因素分析[J].中國婦幼保健，2010，25（25）：3604-3605.

[4]Caufriez A，Leproult R，Copinschi G.Circadian profiles of progesterone，gonadotropins，cortisol and corticotropin in cycling and postmenopausal women[J].Chronobiol Int 2018，35（1）：72-79.

[5]胡倩，段培蓓，龔秀琴，等.門診圍絕經期綜合征患者健康狀況調查[J].中國婦產科臨床雜志，2017，18（1）：61-62.

[6]王聰，徐書君，原嘉民，等.奇經四穴在改善圍絕經期郁病（肝郁證）生存質量中的應用[J].中國老年學雜志，2015，35（14）：3977-3979.

[7]卿朝暉.女性激素水平與圍絕經期癥狀相關性分析[J].深圳中西醫(yī)結合雜志，2017，27（9）：127-129.

[8]鄧飛.圍絕經期婦女80例性激素水平變化的研究[J].實用醫(yī)技雜志，2020，27（12）：1638-1639.

[9]秦家云，劉曉燕，王麗平，等.血清性激素、血脂水平與圍絕經期癥狀的相性小[J].中國婦幼保健2013，28（9）：1483-1486.

[10]臧凱，羅小光，李偉，等.圍絕經期綜合征漸衰動物模型選擇[J].貴州醫(yī)科大學學報，2017，42（11）：1262 -1265.

[11]信欣，韋彩川，畢文鵬，等.慢性應激刺激對抑郁模型小鼠構建的行為學研究[J].Journal of Medical ScienceYanbian University，2017（2），40：92-96.

[12]Schmelting B，Corbach-Sohle S，Kohlhause S，et al. Agomelatine in the tree shrew model of depression：effects on stress-induced nocturnal hyperthermia and hormonal status[J].EurNeuropsychopharmacol，2014，24（3）：437-447.

[13]Pechlivanova D M，Tchekalarova J D，et al.Effect of long-term caffeine administration on depressive-like behavior in rats exposed to chronic unpredictable stress[J].Behav Pharmacol，2012，23（1）：339-347.

[14]卓澤偉.疏肝補腎法對圍絕經期綜合征肝郁證大鼠的行為及海馬p38MAPK/ERK5表達影響的研究[D].福州：福建中醫(yī)藥大學，2019.

[15]阮璐薇，張鵬橫，黃睿婷，等.去勢法聯合慢性不可預知性溫和應激法建立圍絕經期綜合征肝郁證動物模型的研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2021，36（1）：394-397.

[16]Pryce C R，Azzinnari D，Spinelli S，et al.Helplessness：a systematic translational review of theory and evidence for its relevance to understanding and treating depression[J].Pharmacol Ther，2011，132：242-267.

[17]楊一帆，王豆，李濤，閆詠梅.慢性不可預知溫和刺激抑郁模型及其評價指標的研究進展[J].山東醫(yī)藥，2021，61（25）：96-99.

[18]李繼俊.婦產科內分泌治療學[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2010.

[19]李生強，謝冰穎，謝麗華，等.疏肝法對圍絕經期綜合征肝郁證模型大鼠雌激素受體mRNA表達的影響[J].國際中醫(yī)中藥雜志，2016，38（9）：826-830.

（收稿日期：2021-11-11）