張映曈，趙歡歡，周宏勝，凌軍，李鵬霞，，3*

（1．江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)設施與裝備研究所，江蘇 南京 210095；2．南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；3．江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇 南京 210095）

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是一項在動植物、真菌和線蟲等真核生物中保守存在的基因表達調(diào)控機制[1]。主要通過核酸序列特異性的相互作用抑制靶標基因表達，是真核生物預防病毒侵染、阻止轉(zhuǎn)座子等外來核酸入侵，以及調(diào)控基因表達的重要防御機制[2]?；谶@一原理，RNAi現(xiàn)在已經(jīng)普遍應用于基因功能分析和基因治療等領(lǐng)域[3-5]。近年來，通過RNAi抑制功能基因表達防治植物病蟲害和真菌性病害成為可能[6-8]，這也為果蔬采后真菌性病害的防治開辟了新的途徑[9]。噴霧誘導基因沉默（spray-induced gene silencing，SIGS）是一種基于RNAi，在體外合成靶標雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）并噴灑在附著病原菌的果蔬表面后，通過dsRNA的跨界轉(zhuǎn)運和對靶標基因的轉(zhuǎn)錄抑制實現(xiàn)防治病原菌的方法[10]。該方法操作簡便，不依賴于宿主遺傳轉(zhuǎn)化體系，主要成分為生物大分子dsRNA，無毒無殘留，在果蔬采后病害防治領(lǐng)域具有廣闊的應用前景[10-11]。

在SIGS中，制備dsRNA的方法通常是分別轉(zhuǎn)錄合成正義和反義RNA序列，然后退火產(chǎn)生dsRNA片段，該方法流程復雜、耗費較大，獲得的dsRNA質(zhì)量也不高。商業(yè)化試劑盒如MEGAscript Kit和Transcript T7 High Yied Transcription Kit應運而生，但因為價格昂貴導致dsRNA合成成本過高，限制了SIGS在果蔬病害防治領(lǐng)域的大規(guī)模應用。低成本的微生物反應器（如大腸桿菌）操作簡易且能在廉價的培養(yǎng)基上迅速繁殖，使dsRNA量產(chǎn)成為可能。大腸桿菌HTI15（DE3）是RNaseIII缺陷型菌株[12]，無法合成RNaseIII故能保持dsRNA完整性，是大規(guī)模制備dsRNA的理想菌株。另外，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）可誘導HTI15中T7 RNA聚合酶的合成，進而強力啟動帶有T7啟動子的RNAi載體的表達[13]，大量合成靶標dsRNA。

本研究以引起桃采后軟腐病的匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）為例，構(gòu)建能夠合成靶向β-1，3-葡聚糖合成酶（β-1，3-glucan synthase，GS）的 RNAi載體，并采用IPTG誘導gs-dsRNA的大量合成，為基于靶向β-1，3-葡聚糖合成酶的dsRNA綠色殺菌劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。以大腸桿菌為微生物反應器，大量合成特異性靶標dsRNA為未來dsRNA殺菌劑的規(guī)模化生產(chǎn)和應用提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）、DH5α、RNaseIII缺陷型大腸桿菌HT115：江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮實驗室保藏。

質(zhì)粒：克隆載體pMDTM20-T Vector：寶生物工程有限公司；質(zhì)粒L4440：江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮實驗室保藏。

試劑：真菌RNA提取試劑盒：Omega Bio-Tek公司；PrimeScriptcDNA第一鏈合成試劑盒：寶生物工程有限公司；DP103質(zhì)粒提取試劑盒、DP214 DNA純化試劑盒：天根生化科技有限公司；D2500-01瓊脂糖凝膠回收試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶：賽默飛世爾科技公司。

1.2 儀器與設備

5424R冷凍高速離心機、BioPhotometer Plus核酸蛋白測定儀：Eppendorf中國有限公司；EDC-810 PCR擴增儀：北京東勝科技有限公司；JS-680D凝膠成像儀：上海培清科技有限公司；SW-CJ-1B超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；420232恒溫培養(yǎng)箱：三洋電機株式會社；ZQTY-70V振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司；DW-HL678超低溫冰箱：中科美菱低溫科技股份有限公司；UV-1000紫外燈：上海嘉鵬科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 引物設計和cDNA的合成

1.3.1.1 引物設計

根據(jù)美國國家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中公布的匍枝根霉gs基因序列，采用Oligo7軟件進行引物設計用于擴增gs基因的片段，上下游引物分別帶有SalI和NheI酶切位點。引物序列見表1。

表1 聚合酶鏈式反應引物序列Table 1 Sequence of primers for polymerase chain reaction

1.3.1.2 匍枝根霉cDNA合成

收集匍枝根霉菌體，添加液氮研磨。采用RNA提取試劑盒進行總RNA提取，分別使用瓊脂糖凝膠電泳和BioPhotometer Plus核酸蛋白測定儀檢測RNA的完整性和濃度。使用PrimeScript第一鏈合成試劑盒，對檢測合格的R NA進行反轉(zhuǎn)錄，反應體系為5×Prime－Script Buffer 2，4.0 μL；PrimeScript R T Enzyme Mix I，1.0 μL；R T Primer Mix，1.0 μL；R NA，10.0 μL；R Nase Free dH2O，補足至20 μL。37℃孵育15 min，85℃孵育5 s，立即置于冰上。獲得的cDNA于-80℃保存。

1.3.2 L4440-gs大腸桿菌表達體系構(gòu)建

1.3.2.1 目的片段的擴增

以cDNA第一鏈為模板，使用1.3.1.1中設計的引物gs-F和gs-R，聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增目的基因片段。反應體系為2×Phanta Master Mix：25 μL；上游引物：2 μL；下游引物：2 μL；模板：1 μL；ddH2O：20 μL。PCR 反應程序：94 ℃預變性2 min；94℃變性 30 s；58℃退火 30 s；72℃延伸 30 s；30個循環(huán)，72℃補充延伸2 min。

通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR產(chǎn)物的大小，在紫外燈下切下大小正確目的片段進行膠回收。首先根據(jù)膠條的質(zhì)量加入Binding Buffer，60℃水浴10 min；將溶膠液轉(zhuǎn)移至吸附柱，10 000×g離心1 min，丟棄收集管中液體；加入 500 μL wash buffer至吸附柱，10 000×g離心1min，棄濾液；重復上一步驟；12000×g空轉(zhuǎn)2min，棄收集管；將吸附柱置于新的1.5 mL離心管中，在吸附膜上方懸空滴加50 μL無菌水，室溫（22±1）℃放置2 min，12 000×g離心 1 min；取 1 μL DNA，檢測濃度。

1.3.2.2 克隆載體的構(gòu)建

將回收后的目的片段與T載體pMDTM20-T Vector按照摩爾比1∶3進行混合，16℃過夜連接。連接體系為pMDTM20-TVector1.0μL；目的片段2.0 μL；dH2O 3.0 μL；Solution I溶液 5.0 μL。

取連接液5 μL轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，具體步驟如下：取大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞置于冰上；加入連接產(chǎn)物，用槍輕柔吹吸混勻，冰浴30 min；迅速置于42℃水浴鍋中熱擊90 s，轉(zhuǎn)移至冰上靜置2 min；添加800 μL LB液體培養(yǎng)基，37℃下200 r/min 復蘇 1 h；4 000×g，離心 5 min，吸出 800 μL上清；剩余菌液用移液器吹吸均勻，涂布于LB固體培養(yǎng)基上（氨芐青霉素Amp終濃度100 μg/mL，IPTG濃度 50 mg/mL，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside，XGal）濃度 20 mg/mL）；倒置培養(yǎng)皿，37 ℃培養(yǎng) 16 h～18 h后進行藍白斑篩選。挑取白色單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基（Amp+）37℃振蕩培養(yǎng)12 h～16 h。吸取1 μL 菌液進行PCR鑒定，使用的引物為pMDTM20-T Vector通用引物M13-47和RV-W。檢驗正確的送公司測序進行進一步鑒定。

1.3.2.3 L4440-gs重組菌的構(gòu)建

將測序正確的重組質(zhì)粒和L4440干擾載體分別使用NheI和SalI進行酶切，酶切體系為10×Buffer，5 μL；DNA，約 2.5 μg；限制性內(nèi)切酶，2 μL；ddH2O，補足至50 μL。37℃孵育約3 h～4 h。

瓊脂糖凝膠電泳分離目的片段，采用T4 DNA連接酶將回收后的目的基因片段和L4440干擾載體按物質(zhì)的量之比1∶3在22℃過夜連接。反應體系為10×Buffer，2 μL；目的片段，4 μL；L4440 載體，6 μL；T4 Ligase，1 μL；ddH2O，補足至 20 μL。

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至RNaseIII缺陷型大腸桿菌HT115（DE3）感受態(tài)細胞中，涂布于添加氨芐青霉素和四環(huán)素Tet（50 μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12 h～16 h。挑取陽性單克隆接種至LB液體培養(yǎng)基（Amp+，Tet+），37 ℃振蕩培養(yǎng) 12 h～16 h。提取重組質(zhì)粒，使用通用引物SK-primer和KS-primer進行PCR驗證。驗證正確的質(zhì)粒繼續(xù)使用XmnI，以及NaeI和StuI分別進行單酶切和雙酶切驗證。根據(jù)酶切后片段大小判斷質(zhì)粒構(gòu)建是否正確。將驗證正確的重組質(zhì)粒送公司進一步測序鑒定。質(zhì)粒構(gòu)建流程演示圖見圖1。

圖1 L4440-gs質(zhì)粒構(gòu)建流程圖Fig.1 Flow chart of construction of L4440-gs plasmid

1.3.3 L4440-gs dsRNA的誘導表達

1.3.3.1 IPTG誘導

將1.3.2.3中獲得的L4440-gs重組大腸桿菌接種至添加Amp+和Tet+的LB液體培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)12 h～16 h。將培養(yǎng)好的菌液按照1∶100的體積比擴大培養(yǎng)，當OD600值約為0.5時加入IPTG使其終濃度為0.4 mmol/L。繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 h～5 h以誘導L4440-gs dsRNA的合成。

1.3.3.2 L4440-gs dsRNA的提取

收集1.3.3.1中獲得的菌液，置于80℃烘箱20 min后，10 000×g離心5 min獲得菌體。采用細菌RNA提取試劑盒從獲得的菌體中提取總RNA：加180 μL TE buffer（20 μL 50 mg/mL 裂解酶）重懸菌體，30℃孵育10 min；加入 350 μL buffer BRK/2-ME 和 25 mg～40 mg玻璃粉，充分振蕩，離心5 min；取400 μL上清置于1.5 mL離心管，加70%酒精于溶菌產(chǎn)物中，吹吸混勻；將樣品加入吸附柱中，10 000×g離心30 s，棄廢液；加入300μL RNA wash buffer I，10 000×g離心 30 s，棄濾液，重復兩次；加入 500 μL RNA wash buffer II，10 000×g 離心30 s，棄濾液，重復兩次；10 000×g 空甩 2 min；將吸附柱置于新的1.5 mL離心管中，加入50 μL焦炭酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水，10 000×g離心 30 s，得到RNA。向總RNA中添加RNaseA酶（1.0 μg/mL），37℃孵育1 h，以去除總RNA中的單鏈RNA。使用三氯甲烷抽提dsRNA并用等體積異丙醇沉淀、75%乙醇洗滌，并用DEPC水溶解，分別使用瓊脂糖凝膠電泳和BioPhotometer Plus核酸蛋白測定儀檢測dsRNA的大小和濃度。獲得的dsRNA保存于-80℃。

1.3.3.3 L4440-gs dsRNA的鑒定

分別使用DNase I和RNaseA酶分別對dsRNA進行酶解，并提取HT115菌株的總RNA為對照。酶解反應體系分別為 10×DNase I buffer：1.0 μL；DNase I（1 U/μL）：1.0 μL；dsRNA：1.0 μL，ddH2O：7.0 μL。37 ℃下孵育 30 min；或 10×DNase I buffer：1.0 μL；DNase I（1 U/μL）：1.0μL；dsRNA：1.0μL，ddH2O：7.0 μL。37℃孵育30 min；RNaseA（1.0 μg/mL）：0.75 μL；dsRNA：1.0 μL；ddH2O：4.0 μL；1 mmol/L NaCl：5.75 μL。37℃下孵育1 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 gs基因片段的克隆

在選擇目的片段時應盡量避免基因的保守區(qū)域，以防與果蔬對應基因具有較高同源性，從而造成對果蔬相關(guān)基因的抑制。通過同源性比對，選擇gs基因中的非保守區(qū)域（559 bp～851 bp）片段作為目的片段。以匍枝根霉cDNA為模板，使用引物gs-F和gs-R擴增該片段，得到300 bp左右大小條帶，如圖2A所示。

圖2 gs基因片段的擴增結(jié)果和克隆載體pMD20T-gs的PCR鑒定結(jié)果Fig.2 Amplification result and PCR verification of gs gene fragment

由圖2可知，條帶大小符合預期，切膠回收后連接至pMDTM20-T載體。挑取白色菌落，采用pMDTM20-T載體上的通用引物M13-47和RV-WPCR進行菌落PCR驗證，得到500 bp左右條帶（圖2B），與預期一致。將菌液送公司測序，序列比對結(jié)果表明目的片段已成功克隆。

2.2 L4440-gs重組載體的鑒定

借助克隆載體pMD20T-gs中g(shù)s基因片段兩側(cè)以及L4440干擾載體多克隆位點中的NheI和SalI進行雙酶切，通過電泳分離和膠回收得到各自片段，再使用T4 DNA連接酶將gs基因片段和L4440載體進行連接。轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞后涂布于LB平板（Amp++Tet+），挑取白色菌落進行菌落PCR驗證，結(jié)果如圖3所示。

圖3 L4440-gs重組載體的PCR和酶切驗證結(jié)果Fig.3 PCR and digestion verification of L4440-gs recombinant plasmid

由圖3可知，PCR擴增得到的片段大小約為400bp左右，與預期一致。進一步使用內(nèi)切酶進行酶切驗證，當使用XmnI單酶切時得到3 000 bp左右條帶；當使用StuI和NaeI進行雙酶切后分別得到550 bp和2 500 bp左右大小的片段，與預期一致。將酶切正確的重組質(zhì)粒送公司測序，結(jié)果進一步證實gs基因片段已成功連接至L4440干擾載體中。

2.3 HT115-L4440-gs重組菌的構(gòu)建及dsRNA的誘導表達

將2.2中獲得的L4440-gs重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至RNaseIII缺陷型的大腸桿菌HT115（DE3）感受態(tài)細胞中，經(jīng)篩選鑒定得到重組菌，菌液PCR鑒定結(jié)果見圖4。

圖4 HT115-L4440-gs重組菌的菌液PCR驗證Fig.4 PCR verification of HT115-L4440-gs recombinant

將重組菌接種至5 mL LB液體培養(yǎng)基（Amp++Tet+）中，并進行擴大培養(yǎng)，加入IPTG誘導后繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 h～5 h以誘導L4440-gs dsRNA的合成。收集菌體后提取總RNA，然后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖5。

圖5 L4440-gs dsRNA的誘導表達及鑒定Fig.5 Induced expression of L4440-gs dsRNA and digestionresults of gs dsRNA with DNaseI and RNase A

由圖5可知，重組菌中的dsRNA正確表達，大小與預期一致。以HT115總RNA為對照，使用DNaseI和RNase A對dsRNA進行消化處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)dsRNA條帶亮度沒有發(fā)生明顯變化，而HT115總RNA在經(jīng)RNase A處理后完全降解，而兩種樣品經(jīng)DNaseI處理后基因組條帶也全部降解，進一步證實了提取得到的300 bp左右的核酸分子主要為dsRNA，不是RNA或者DNA。但實際上，經(jīng)RNase A酶消化處理后仍然存在少部分核糖體RNA，因此想要獲得完全純凈的dsRNA還需進行進一步純化，這與張濤[14]、陳瑤[15]和包文化[16]的研究結(jié)果相似。這意味著dsRNA的純化是未來基于工程菌合成dsRNA產(chǎn)業(yè)化中有待解決的關(guān)鍵問題之一，但不完全純凈的dsRNA并不影響使用殺菌效果，只是在評價dsRNA效價時存在一定障礙。

3 討論與結(jié)論

本研究建立了基于工程菌的桃軟腐病菌（匍枝根霉）靶標基因dsRNA的合成體系，可實現(xiàn)靶標dsRNA的低成本量產(chǎn)，為RNAi殺菌劑的研發(fā)和應用奠定了基礎(chǔ)，推動了以RNAi為核心的果蔬采后真菌性病害防治技術(shù)的發(fā)展。但dsRNA的體外穩(wěn)定性較低是值得我們關(guān)注的問題。dsRNA屬于生物大分子，易降解，作為殺菌劑使用時，從安全性和環(huán)保性角度來說可以實現(xiàn)無毒無殘留，但提高dsRNA的穩(wěn)定性可有效延長dsRNA殺菌劑的有效期，提高對果蔬產(chǎn)品在惡劣環(huán)境下的長效保護機制[17]。有研究表明納米材料包埋可有效提高核苷酸的穩(wěn)定性[18]，同時納米材料作為載體可以攜帶核苷酸進入細胞內(nèi)部，提高dsRNA對病原菌的滲透性，有助于dsRNA進入病原菌體內(nèi)發(fā)揮作用[19-20]。因此原核表達dsRNA結(jié)合納米材料提高dsRNA的穩(wěn)定性和滲透率是未來重要的研究方向。同時，對原核表達系統(tǒng)進行改造和優(yōu)化，進一步提高表達水平提高dsRNA產(chǎn)量，以及建立多靶標dsRNA合成體系，實現(xiàn)多靶標抑制也是重要的攻關(guān)方向。