張今君，夏慧麗，方如意

（臺州市食品檢驗(yàn)檢測中心，浙江 臺州 318000）

紅美人又名愛媛28，是引自日本的雜柑類品種[1]，近年來在浙江、福建、江西等多地引種。在試點(diǎn)栽培過程中發(fā)現(xiàn)，紅美人在結(jié)果習(xí)性、外觀、品質(zhì)等方面表現(xiàn)較為突出，成為各地主推的柑橘新品種之一。目前紅美人在市場定價、果品質(zhì)量存在一定的差異，人們對紅美人果品質(zhì)量的判斷也大都停留在外觀、口感等感官評價上，隨著社會發(fā)展和生活水平的提高，消費(fèi)者除了追求口感品質(zhì)，對功能性品質(zhì)的需求日益增加。目前與紅美人相關(guān)的文獻(xiàn)多集中在不同產(chǎn)地的引種表現(xiàn)及栽培技術(shù)的研究[2-5]，而有關(guān)紅美人中功能性成分研究甚少，對于果品等級劃分缺乏科學(xué)評價依據(jù)。

酚酸是結(jié)構(gòu)中帶有酚類基團(tuán)和有機(jī)羧酸官能團(tuán)的化合物[6]，具有潛在的抗氧化、抗病毒、抗菌消炎等多種生物活性[7-9]，是紅美人品質(zhì)指標(biāo)之一，也是重要的功能性成分。因此，測定及分析紅美人中酚酸物質(zhì)含量及組成，對評價紅美人果實(shí)品質(zhì)、挖掘功能性成分具有重要意義。目前柑橘中酚酸的檢測方法主要是高效液相色譜法[10-13]和超高效液相色譜法[14-15]，高效液相色譜法具有易操作、靈敏度高和穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，但存在溶劑用量大、分離度差、耗時長等缺點(diǎn)；超高效液相色譜法采用超高壓技術(shù)，具有高效、分離度高的優(yōu)勢，但不能對所檢物質(zhì)準(zhǔn)確定性。超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法既能發(fā)揮色譜法的高分離能力，又能發(fā)揮質(zhì)譜法的高鑒別能力，更適用多種酚酸的定量定性分析[16-21]。本文以浙江省6個產(chǎn)區(qū)的紅美人柑橘為研究對象，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定紅美人中酚酸化合物的含量，分析酚酸化合物的組成和含量，以期為紅美人品質(zhì)評價及功能性成分挖掘提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

紅美人柑橘：來源于寧波象山、麗水蓮都、衢州衢江、臺州黃巖、溫嶺和臨海6個主要生產(chǎn)基地。分別從每個基地隨機(jī)采集無病蟲害、無機(jī)械損傷且成熟度基本一致的樣品6份，-18℃冷凍保存。

沒食子酸、原爾茶酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸、咖啡酸等標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：加拿大多倫多研究化學(xué)品公司；乙腈、甲醇、甲酸（均為色譜純）：美國Thermo Fisher公司；鹽酸、氫氧化鈉、抗壞血酸、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；Oasis HLB 小柱（6 mL/200 mg）：美國Waters公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

QTRAP 4500三重四極桿-線性離子肼質(zhì)譜系統(tǒng)：美國AB Sciex公司；UPLC液相色譜系統(tǒng)：日本島津公司；Allegra X-30R冷凍離心機(jī)：美國貝克曼庫爾特公司；KS4000ic可控溫振蕩箱、VORTEX 3渦旋混勻器：德國IKA公司；2150 TH超聲波儀：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；PR 1602 ZH/Z電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取每種標(biāo)準(zhǔn)品各20 mg（精確至0.1 mg），分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為2 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液（-18℃保存）?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)中間液：準(zhǔn)確吸取上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液各25 μL置于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，配制成濃度均為5 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。配制合適濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，化合物峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取紅美人果肉2.00 g于50 mL離心管中，加入20 mL 2 mol/L氫氧化鈉溶液（含1%抗壞血酸和10 mmol/L EDTA），40℃避光振蕩水解2 h，離心吸取10 mL，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2，提取液轉(zhuǎn)入經(jīng)過預(yù)先處理的Oasis HLB小柱，棄去濾液，用5 mL甲醇分兩次清洗固相萃取小柱，加甲醇定容至5.0 mL，混勻，過0.22 μm濾膜，上機(jī)測試。

1.2.3 儀器條件

色譜條件：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100mm×2.1mm，1.7μm），柱溫 35℃；流速 300 μL/min；進(jìn)樣體積5 μL；流動相：A為含0.01%甲酸水溶液，B為乙腈。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution of condition

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI源）；負(fù)離子掃描（ESI-）；多反應(yīng)監(jiān)測（multiple re action monitoring，MRM）；電噴霧電壓（ion spray，IS）5 500 V；霧化氣壓力（gas of nebulizer，GS1）0.34 MPa；輔助氣壓力（gas of heater，GS2）0.34 MPa；氣簾氣壓力（curtain，CUR）0.24MPa；離子源溫度（temperature，TEM）550℃，各化合物定性離子、定量離子對及其碰撞能量等參數(shù)見表2。

表2 化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 The mass spectrum parameters of compound

續(xù)表2 化合物的質(zhì)譜參數(shù)Continue table 2 The mass spectrum parameters of compound

1.3 數(shù)據(jù)處理

譜圖在SCIEX OS-Q軟件上處理，采用離子比及保留時間進(jìn)行定性確證，外標(biāo)法計(jì)算各組分含量。數(shù)據(jù)使用Micro-softExcel 2007軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

參照NY/T 3290-2018《水果、蔬菜及其制品中酚酸含量的測定液質(zhì)聯(lián)用法》[16]對紅美人中的酚酸進(jìn)行檢測。紅美人中游離型、游離酯型、結(jié)合酯型3類酚酸均有檢出，其中游離酯型、結(jié)合酯型酚酸需水解提取。本文通過比較不同濃度、不同體積NaOH溶液優(yōu)化水解條件。取紅美人樣品9份，分別加入20 mL 2、4、6 mol/L NaOH溶液，每個濃度測定3次，結(jié)果見圖1。

圖1 不同濃度NaOH溶液中酚酸的含量Fig.1 Content of phenolic acids in different concentration of NaOH solution

由圖1可知，沒食子酸、原爾茶酸、綠原酸、對香豆酸、阿魏酸在2 mol/L NaOH溶液水解時含量略高，對羥基苯甲酸、香草酸、芥子酸在6 mol/L NaOH溶液水解時含量略高，各目標(biāo)化合物在3個濃度下含量變化不大，綜合考慮選擇2 mol/L NaOH溶液進(jìn)一步考察不同體積NaOH溶液對水解效率的影響。

稱取紅美人樣品 15份，分別加入 5、10、15、20、25 mL 2 mol/L NaOH溶液，每個體積測定3次，按1.2.2方法對樣品進(jìn)行處理，各目標(biāo)物結(jié)果見圖2。

圖2 不同體積NaOH溶液中酚酸的含量Fig.2 Content of phenolic acids in different volume of NaOH solution

由圖2可知，在5 mL～20 mL范圍內(nèi)沒食子酸、原爾茶酸、對羥基苯甲酸、香草酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸測定含量隨NaOH溶液體積增加，在20 mL時含量最高，因此本文選擇2 mol/L、20 mLNaOH溶液對樣品進(jìn)行水解提取。

2.2 儀器條件優(yōu)化

2.2.1 色譜條件

選用HSS T3色譜柱對9種酚酸進(jìn)行分離[16-17]。流動相通過對比乙腈/水、乙腈/0.1%甲酸水、乙腈/0.01%甲酸水3種類型進(jìn)行比較優(yōu)化。結(jié)果顯示，在乙腈/水體系中所有組分在3 min出峰，保留時間短且峰型拖尾；在乙腈/0.01%甲酸水、乙腈/0.1%甲酸水流動相中各目標(biāo)化合物分離良好且峰型尖銳。這是因?yàn)榉铀峄衔镏泻?OH和-COOH，加入甲酸能有效調(diào)節(jié)酚酸化合物解離，改善峰型，提高化合物在色譜柱上的保留。另外酚酸化合物負(fù)離子掃描模式下，水中甲酸增加至0.1%時會導(dǎo)致各目標(biāo)化合物信號降低，因此本試驗(yàn)選擇乙腈/0.01%甲酸水對樣品進(jìn)行洗脫。3種不同流動相條件下的總離子流圖見圖3。

圖3 3種不同流動相條件下的總離子流圖Fig.3 Total ion chromatograms under 3 mobile phases

2.2.2 質(zhì)譜條件

將0.1 μg/mL各標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)蠕動泵以7 μL/min流速進(jìn)入ESI源進(jìn)行質(zhì)譜分析。通過Q1全掃模式獲得分子離子峰，用子離子模式對分子離子峰進(jìn)行分析，從打碎的離子中選取兩個特征離子作為定性和定量離子。用MRM掃描模式優(yōu)化去簇電壓（declustering potential，DP）和碰撞能量（collision energy，CE）值，使得定量與定性離子強(qiáng)度響應(yīng)最大，優(yōu)化后的9種酚酸化合物質(zhì)譜參數(shù)（表2）。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性范圍、檢出限、定量限、精密度、穩(wěn)定性

配制不同濃度梯度的酚酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.3儀器條件上機(jī)測試，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)；以3倍和10倍信噪比確定化合物的檢出限和定量限。取200 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)行6次，計(jì)算峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），考察精密度；取同一份混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測試，計(jì)算峰面積RSD，考察穩(wěn)定性。具體結(jié)果見表3。

表3 9種酚酸的相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、精密度及穩(wěn)定性Table 3 Correlated coefficient、precision、stability、detection and quantification limit of 8 kinds of phenolic acids

由表 3可知，9種酚酸在 5 μg/L～5 000 μg/L 濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)（r）≥0.999 1，檢出限濃度范圍為0.05 μg/L～0.73 μg/L，定量限的濃度范圍為0.17 μg/L～2.44 μg/L。9 種酚酸化合物的精密度為1.3%～3.0%，穩(wěn)定性為1.9%～3.9%。

2.3.2 回收率及重復(fù)性

稱取6份已知含量的樣品2.00 g，添加5.0 μg/g阿魏酸及0.5 μg/g另外7種酚酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照試驗(yàn)方法進(jìn)行測定并計(jì)算目標(biāo)化合物的回收率和RSD，具體結(jié)果見表4。

表4 8種酚酸回收率及重復(fù)性Table4 Recovery rate and repeatability of 8 kinds of phenolic acids

由表4可知，8種酚酸化合物回收率為85.7%～103.9%、重復(fù)性為0.92%～5.28%。

2.4 6個產(chǎn)地紅美人果肉中酚酸的組成和含量

各產(chǎn)地紅美人中8種酚酸含量見表5。

表5 6個產(chǎn)地紅美人中酚酸的組成和含量Table 5 Content and composition of phenolic acids in Hongmeiren from 6 origins

續(xù)表5 6個產(chǎn)地紅美人中酚酸的組成和含量Continue table 5 Content and composition of phenolic acids in Hongmeiren from 6 origins

由表5可知，樣品中均檢出沒食子酸、原爾茶酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸，8 種酚酸的總量為 68.82 μg/g～98.96 μg/g，其中阿魏酸含量最高，為 38.02 μg/g～53.79 μg/g，占總酚酸50%以上，綠原酸含量次之，為 15.84 μg/g～25.90 μg/g，其余6種酚酸含量較低，分別為沒食子酸0.05 μg/g～0.12 μg/g、原爾茶酸 1.01 μg/g～1.81 μg/g、對羥基苯甲酸0.77 μg/g～1.38 μg/g、香草酸 1.43 μg/g～2.72 μg/g、對香豆酸 6.38 μg/g～11.00 μg/g、芥子酸 2.00 μg/g～6.95 μg/g。分析發(fā)現(xiàn)，各產(chǎn)地紅美人中酚酸組成比例基本穩(wěn)定，其中阿魏酸占比均在51.10%～57.51%，綠原酸占比均在22.29%～27.86%。

3 結(jié)論

研究建立了超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜同時測定紅美人中8種酚酸的檢測方法，方法采用NaOH溶液水解提取樣品中游離酯型、結(jié)合酯型酚酸，使紅美人中酚酸測定更加全面。該方法準(zhǔn)確可靠、靈敏度高，適合紅美人中酚酸的定性和定量檢測，可推廣應(yīng)用于其他柑橘中酚酸含量的測定。

利用建立的方法對浙江省6個產(chǎn)區(qū)的紅美人進(jìn)行測定，樣品中均檢出沒食子酸、原爾茶酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、對香豆酸、阿魏酸及芥子酸，酚酸含量豐富，其中阿魏酸含量最高，綠原酸次之。酚酸的組成和含量分析為后續(xù)紅美人功能成分的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)參考。