趙海霞，肖欣，董玘鑫，吳花拉，李成磊，吳琦

苦蕎愈傷遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化及用于的過表達(dá)分析

趙海霞，肖欣，董玘鑫，吳花拉，李成磊，吳琦

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川雅安 625014

【】建立和優(yōu)化苦蕎愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系，為苦蕎基因功能驗(yàn)證及分子育種提供研究工具。以苦蕎品種“西蕎二號(hào)”為材料，對(duì)苦蕎愈傷遺傳轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，包括苦蕎外植體類型、誘導(dǎo)愈傷的激素比例、繼代培養(yǎng)基的激素比例及農(nóng)桿菌類型。利用苦蕎類黃酮生物合成關(guān)鍵酶基因的過表達(dá)驗(yàn)證優(yōu)化后的遺傳轉(zhuǎn)化體系。通過PCR篩選和熒光觀察鑒定陽(yáng)性株系，采用紫外分光光度法和高效液相色譜法（high performance liquid，HPLC）測(cè)定花青素及黃酮醇支路代謝物含量，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析類黃酮合成相關(guān)基因的表達(dá)，比較過表達(dá)愈傷組織與對(duì)照組的差異。苦蕎誘導(dǎo)愈傷組織的最佳外植體為下胚軸，其最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.8 mg·L-16-BA+3.5 mg·L-12,4-D，誘導(dǎo)率達(dá)72%；最優(yōu)繼代培養(yǎng)基為MS+3 mg·L-16-BA+1 mg·L-1KT，愈傷組織增殖率與增殖系數(shù)分別為98%和1.09；轉(zhuǎn)化過程中的最佳農(nóng)桿菌是GV3101，轉(zhuǎn)化效率達(dá)31.3%；過表達(dá)愈傷組織中，花青素、蘆丁和楊梅素的含量顯著高于對(duì)照（＜0.05），山奈酚和槲皮素的含量極顯著高于對(duì)照組（＜0.01）；外源的過表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)基因愈傷組織中5個(gè)內(nèi)源同源基因的表達(dá)水平?jīng)]有影響（＞0.05），而、、、、和等黃酮合成途徑關(guān)鍵酶基因均上調(diào)表達(dá)（＜0.05）。此外，特異性正調(diào)控黃酮醇合成的轉(zhuǎn)錄因子基因和上調(diào)表達(dá)，而花青素合成抑制子基因的表達(dá)降低（＜0.05）。建立了苦蕎愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系，過表達(dá)的苦蕎愈傷組織通過上調(diào)黃酮合成相關(guān)基因的表達(dá)增加類黃酮物質(zhì)的積累。

苦蕎；愈傷組織；遺傳轉(zhuǎn)化；查爾酮合酶基因

0 引言

1 材料與方法

1.1 植物材料及生長(zhǎng)條件

苦蕎品種“西蕎二號(hào)”由西昌學(xué)院王安虎教授惠贈(zèng)。用75%酒精和0.1%氯化汞消毒苦蕎種子，置于1/2 MS培養(yǎng)基（0.7%瓊脂、2.37 g·L-1MS和3%蔗糖，pH=5.8）上，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10—12 d（光照培養(yǎng)12 h，暗培養(yǎng)12 h，光照強(qiáng)度2.0 klx，25℃），獲得苦蕎幼苗。

1.2 苦蕎愈傷組織的誘導(dǎo)

選擇生長(zhǎng)良好的苦蕎幼苗子葉和下胚軸（距子葉節(jié)及根各1 cm的中段部分）作為外植體，子葉/下胚軸切成0.5 cm×0.5 cm小片/0.5 cm小段，置于25種不同激素配比的MS培養(yǎng)基（MS+0.2—1.0 mg·L-16-BA+2.0—4.0 mg·L-12,4-D）上誘導(dǎo)愈傷組織（電子附表1），共5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10個(gè)外植體，并于第10天統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。成功誘導(dǎo)愈傷組織后，置于9種繼代培養(yǎng)基（MS+2.0—4.0 mg·L-16-BA+1.0—3.0 mg·L-1KT）上培養(yǎng)（電子附表1），共3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20個(gè)愈傷組織，觀察其生長(zhǎng)增殖情況，于第25天統(tǒng)計(jì)增殖率和增殖系數(shù)。上述試驗(yàn)均在光照16 h/黑暗8 h，25℃條件下進(jìn)行。

愈傷組織誘導(dǎo)率=愈傷組織形成數(shù)/所有外植體×100%；

愈傷組織增殖率=可增殖的愈傷組織總數(shù)/所有愈傷組織×100%；

增殖系數(shù)=增殖后重量/增殖前重量。

1.3 菌液的制備及侵染

為了探究不同種類根癌農(nóng)桿菌對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響，分別以根癌農(nóng)桿菌株系GV3101和C58C1侵染外植體。將根癌農(nóng)桿菌（已轉(zhuǎn)入pCHF3-YFP質(zhì)粒）在含80 mg·L-1抗生素（利福平/壯觀霉素）的YEB固體培養(yǎng)基（1.5%瓊脂），28℃黑暗養(yǎng)2 d。根據(jù)pCHF3-YFP載體MCS兩端序列設(shè)計(jì)引物MYFP-F/MYFP-R（電子附表2），通過菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆。將單一陽(yáng)性農(nóng)桿菌菌株接種于20 mL YEB液體培養(yǎng)基中，添加80 mg·L-1抗生素（利福平/壯觀霉素），28℃振蕩（180 r/min）培養(yǎng)。當(dāng)根癌農(nóng)桿菌OD600=1.5時(shí)，取1 mL菌液，置于添加80 mg·L-1抗生素（利福平/壯觀霉素）50 mL YEB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)培至OD600=0.6。擴(kuò)培后的農(nóng)桿菌菌液離心（4 000 r/min）5 min，用1/2 MS液體培養(yǎng)基（含200 mmol·L-1乙酰丁香酮）重懸至OD600=0.3。用重懸菌液侵染苦蕎子葉/下胚軸20 min，將外植體置于濾紙上，30 s吸干侵染液，移至MS愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，25℃黑暗培養(yǎng)3 d。后用無菌水（含300 mg·L-1頭孢噻肟）清洗子葉/下胚軸3—5次，濾紙吸干多余水分，置于MS愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含300 mg·L-1頭孢噻肟）培養(yǎng)10 d。

1.4 陽(yáng)性愈傷組織的篩選及鑒定

將誘導(dǎo)出的愈傷組織移至MS繼代培養(yǎng)基（含50 mg·L-1卡那霉素）培養(yǎng)，無菌培養(yǎng)30 d，其間每隔15 d更換培養(yǎng)基，并淘汰褐化愈傷組織。待愈傷組織直徑達(dá)3—5 cm時(shí)，通過CTAB法提取苦蕎愈傷組織的基因組DNA[18]。使用特異性引物MYFP-F/ MYFP-R通過PCR鑒定陽(yáng)性愈傷組織（電子附表1）。同時(shí)，在藍(lán)色激發(fā)光（420—485 nm）條件下，通過熒光顯微鏡（奧林巴斯BX53）觀察愈傷組織的YFP信號(hào)。

轉(zhuǎn)化率=陽(yáng)性愈傷組織數(shù)/所有外植體×100%。

如圖3所示，LPS刺激能顯著造成Caco-2細(xì)胞中MLCK 的轉(zhuǎn)錄水平升高(p＜0.05)。而辣木多肽能夠抑制模型細(xì)胞中MLCK的轉(zhuǎn)錄水平。與模型組相比，高濃度(100 μg/mL和150 μg/mL)的辣木多肽可顯著抑制MLCK的 mRNA轉(zhuǎn)錄水平(抑制率分別為 28.0%和31.3%)。肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)能夠通過促肌球蛋白輕鏈(MLC)的磷酸化使其參與肌動(dòng)蛋白收縮，引發(fā)細(xì)胞骨架重排，破壞細(xì)胞TJ結(jié)構(gòu)，最終造成細(xì)胞間通透性增高[21]。抑制腸上皮細(xì)胞中MLCK的過度活化，對(duì)于維持腸上皮細(xì)胞屏障和細(xì)胞間緊密連接的重要作用[22]。

1.5 苦蕎過表達(dá)FtCHS1愈傷組織的制備

基于苦蕎基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[2]，設(shè)計(jì)特異性引物（FtCHS1-F-KpnⅠ/FtCHS1-R-ScalⅠ），以苦蕎葉cDNA為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增獲得（）的開放閱讀框（open reading frame，ORF，電子附表2），并將其克隆到pCHF3-YFP質(zhì)粒中。參照1.3方法，使用含有pCHF3--YFP質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌侵染下胚軸，并參照1.4方法鑒定陽(yáng)性愈傷組織。含有空白/空載體（pCHF3-YFP）根癌農(nóng)桿菌作為試驗(yàn)對(duì)照組。

1.6 HPLC法測(cè)定愈傷組織中黃酮醇含量

將苦蕎愈傷組織（1 g）經(jīng)液氮冷凍10 min，研磨成細(xì)粉。用50 ml甲醇萃取2次，4℃保存24 h。60℃干燥后，加入10 mL甲醇，用0.45 μm有機(jī)濾膜過濾收集濾液，并加入2倍體積的甲醇稀釋。使用安捷倫1260型高效液相色譜儀（長(zhǎng)沙科美分析儀器有限公司），采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析槲皮素、山奈酚、楊梅素和蘆丁等黃酮醇的含量，色譜柱為C18（250×4.6 mm，5 μm），柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm，進(jìn)樣體積為20 μL，流速為1 mL·min-1。流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為水。梯度洗脫條件為0—20 min，乙腈從40%逐步上調(diào)至65%，水從60%逐步下調(diào)至35%。槲皮素、山奈酚、楊梅素和蘆丁的標(biāo)品購(gòu)自南京源植生物技術(shù)有限公司。

1.7 愈傷組織中花青素的測(cè)定

將新鮮愈傷組織液氮冷凍研磨成粉，取2 g粉末溶于10 mL酸性甲醇（1%鹽酸，v/v）。100 r/min，25℃黑暗振蕩18 h。4℃12 000 r/min離心15 min后，取5 mL上清液轉(zhuǎn)移到新離心管中。加入5 mL去離子水和3 mL氯仿，4℃ 9 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液轉(zhuǎn)移到新離心管中。測(cè)定樣品530和657 nm吸光值。計(jì)算公式如下：花青素含量＝（A530－0.25×A657）×M-1（A530為530 nm吸光值，A657為657 nm吸光值，M單位為g），每個(gè)樣品3個(gè)獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)。

1.8 愈傷組織中類黃酮合成相關(guān)基因的表達(dá)量測(cè)定

使用RNeasy Plant Mini試劑盒（Aidlab Biotech，Beijing，China）提取苦蕎愈傷組織總RNA，使用ReverTra Ace（Toyobo，Osaka，Japan）反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定類黃酮合成及其調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平，包括5個(gè)苦蕎FtCHSs同源基因（、、、和、（GenBank：KF831243）、（GenBank：JF274262）、（GenBank：JX401285）、（GenBank：KJ094503）、（GenBank：GU169468）、（GenBank：LC216399）、（GenBank：MK128409)[19]、[20]和[21]（GenBank：MT333222.1）。使用Premier5軟件設(shè)計(jì)上述基因引物，管家基因（GenBank：HM628903）作為內(nèi)參基因（電子附表2）。使用SYBR Premix EX Taq試劑盒（TaKaRa，Japan）及CFX Connect系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)條件為95℃ 3 min；95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。使用2?ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 不同激素組合及不同外植體對(duì)苦蕎愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

參考之前報(bào)道的方法[22]，以25種不同激素組合誘導(dǎo)苦蕎下胚軸和子葉產(chǎn)生愈傷組織（圖1）。處理組C19（MS+0.8 mg·L-16-BA+3.5 mg·L-12,4-D）、C20（MS+0.8 mg·L-16-BA+4 mg·L-12,4-D和C22（MS+1 mg·L-16-BA+2.5 mg·L-12,4-D）可獲得更多的愈傷組織（＜0.05），愈傷組織誘導(dǎo)率分別達(dá)到72%、66%和66%（圖1）。與下胚軸相比，苦蕎子葉的誘導(dǎo)率更低（0—6%）。

以上結(jié)果表明，下胚軸是苦蕎愈傷組織誘導(dǎo)的最佳材料，故下胚軸被用于后續(xù)試驗(yàn)。上述3種處理均可用于確定不同農(nóng)桿菌菌株對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。

C1—C25：25種不同愈傷誘導(dǎo)激素組合（電子附表1）；不同字母代表差異顯著（P＜0.05），誤差棒表示±SDs。下同

2.2 苦蕎愈傷組織繼代培養(yǎng)

為了獲得足夠的愈傷組織材料進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，設(shè)置S1—S9共9組添加了不同激素配比的培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織的繼代培養(yǎng)[9]（電子附表1）。繼代培養(yǎng)5 d后，整個(gè)愈傷組織開始膨脹（圖2-A）。繼代25 d后統(tǒng)計(jì)增殖率及增殖系數(shù)。結(jié)果表明，處理組S4在繼代培養(yǎng)25 d后具有最高的增殖率（98%）和增殖系數(shù)（1.09），其余各組增殖系數(shù)和增殖率顯示出相同的變化趨勢(shì)（圖2-B和圖2-C）。由此可知，處理組S4（MS+3 mg·L-16-BA+1 mg·L-1KT）所用激素組合是愈傷組織繼代培養(yǎng)的最佳配比。

2.3 不同根癌農(nóng)桿菌對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

含pCHF3-YFP質(zhì)粒的2種根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101和C58C1用于苦蕎下胚軸侵染，使用處理組C19、C20和C22的激素組合對(duì)侵染過的外植體進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)并在處理組S4的條件下繼代篩選（電子附表1）。結(jié)果顯示，在6個(gè)處理中，農(nóng)桿菌GV3101侵染下胚軸的轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)31.3%，且侵染后的下胚軸色澤健康呈淡黃色（圖3-A）。農(nóng)桿菌C58C1侵染過的下胚軸，則表現(xiàn)出較低的轉(zhuǎn)化率（16%—24%），下胚軸產(chǎn)生明顯褐化（圖3-A和圖3-B）。

A：在繼代培養(yǎng)處理組S4條件下培養(yǎng)5和25 d的愈傷組織；B：不同繼代條件下的愈傷組織增殖率；C：不同處理后的愈傷組織增殖系數(shù)。S1—S9：9種不同繼代激素組合（電子附表1）

A：農(nóng)桿菌GV3101/C58C1侵染下胚軸7 d后表型；B：C19、C20和C22 3種處理下的轉(zhuǎn)化率

因此，選擇農(nóng)桿菌GV3101作為苦蕎外植體侵染菌株，以處理組C19誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)愈傷組織，在處理組S4條件下繼代可作為遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化方案。

2.4 苦蕎FtCHS1的克隆及轉(zhuǎn)基因苦蕎愈傷組織的獲得

從苦蕎葉cDNA中擴(kuò)增出約1.2 kb的ORF（已去除終止密碼子），構(gòu)建植物表達(dá)載體pCHF3--YFP（圖4-A）。用含有pCHF3--YFP質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101侵染下胚軸，在C19（3.5 mg·L-12,4-D+0.8 mg·L-16-BA）條件下培養(yǎng)7 d，其中，轉(zhuǎn)基因組在愈傷組織誘導(dǎo)階段呈現(xiàn)明顯的紅色（圖4-B）。當(dāng)愈傷組織直徑達(dá)3—5 cm時(shí)，采用特異性PCR引物（MYFP-F/MYFP-R）鑒定7個(gè)株系，結(jié)果均為陽(yáng)性（圖4-C）。在熒光顯微鏡下，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組呈現(xiàn)明顯的黃色熒光（圖4-D）。經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)外源的表達(dá)水平，篩選出表達(dá)量最高的＃1、＃3和＃6等3個(gè)株系用于后續(xù)試驗(yàn)（圖4-F）。在繼代培養(yǎng)期間，試驗(yàn)組和對(duì)照組之間的增殖率無明顯差異（圖4-E，＞0.05），但后15 d轉(zhuǎn)基因愈傷組織的增殖系數(shù)高于對(duì)照組（圖4-G）。

A：pCHF3-FtCHS1-YFP結(jié)構(gòu)圖；B：GV3101農(nóng)桿菌侵染下胚軸侵染5 d后表型，#1、#2和#3為不同株系；C：轉(zhuǎn)基因愈傷組織的PCR鑒定；D：愈傷組織熒光檢測(cè)；E：不同愈傷組織增殖率；F：轉(zhuǎn)基因愈傷組織和對(duì)照組愈傷組織中FtCHS1表達(dá)量；G：繼代培養(yǎng)0—5 d、10—15 d、15—20 d和20—25 d愈傷組織增殖系數(shù)。**P＜0.01；*P＜0.05。下同

2.5 過表達(dá)FtCHS1對(duì)苦蕎黃酮含量的影響

為了確定過表達(dá)對(duì)愈傷組織中類黃酮含量的影響，測(cè)定黃酮醇和花青素的積累情況。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因愈傷組織中，槲皮素和山奈酚含量極顯著高于對(duì)照組（＜0.01），蘆丁和楊梅素含量也較對(duì)照組有所增加（＜0.05，圖5-A）。此外，所有陽(yáng)性株系中的花青素含量也比對(duì)照組高約40%（＜0.05，圖5-B）。

A：轉(zhuǎn)基因愈傷組織中黃酮醇（蘆丁、山奈酚、槲皮素和楊梅素）含量的測(cè)定；B：測(cè)定轉(zhuǎn)基因愈傷組織中花青素含量

2.6 過表達(dá)FtCHS1對(duì)苦蕎黃酮合成相關(guān)基因的影響

基于熒光定量PCR的基因表達(dá)水平分析，表明過表達(dá)的外源對(duì)其同源基因的表達(dá)沒有顯著影響（＞0.05，圖6-A），但影響了其他黃酮合成相關(guān)基因的表達(dá)。其中，黃酮醇合成支路關(guān)鍵酶基因和的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（＜0.01），、3和花青素支路的表達(dá)也顯著上調(diào)（＜0.05），但的表達(dá)卻被下調(diào)（＜0.05，圖6-B）。此外，還對(duì)歸屬轉(zhuǎn)錄因子R2R3-MYB家族SG7亞組中的黃酮醇特異性正轉(zhuǎn)錄因子基因和的表達(dá)均顯著上調(diào)增加（＜0.05，＜0.01），而歸屬SG4亞組中花青素抑制性轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)顯著下調(diào)（＜0.05，圖6-C）。說明從轉(zhuǎn)錄水平上支持了過表達(dá)轉(zhuǎn)基因愈傷組織中黃酮含量的變化結(jié)果。

3 討論

3.1 建立苦蕎愈傷遺傳轉(zhuǎn)化體系的重要性

苦蕎富含黃酮且耐貧瘠，是研究黃酮代謝分子機(jī)制及逆境響應(yīng)的理想植物。因此，利用苦蕎基因開展相關(guān)研究的報(bào)道并不少見，如、和等的異位表達(dá)可調(diào)控?zé)煵莼驍M南芥中類黃酮的合成[5, 19-20]，、及等基因轉(zhuǎn)入擬南芥后增強(qiáng)了其對(duì)干旱和鹽的耐受性[6, 23-24]。但此類研究多在異源植物中進(jìn)行，難以反映這些基因在苦蕎中的真實(shí)生物學(xué)效應(yīng)。因此，回歸苦蕎進(jìn)行基因功能驗(yàn)證，一直是苦蕎研究工作者所急于攻克的難點(diǎn)，而建立穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系就是突破的關(guān)鍵。得益于毛狀根技術(shù)的發(fā)展，基于毛狀根的遺傳轉(zhuǎn)化體系逐漸成為研究苦蕎基因的常用工具[25-27]。但毛狀根分化潛力低，難以據(jù)此獲得完整植株。而愈傷組織作為一種具有多能性或全能性的細(xì)胞團(tuán)，較毛狀根而言更具分化潛力，以此建立遺傳轉(zhuǎn)化體系，不僅回歸了本植物，還可降低后續(xù)轉(zhuǎn)基因植株獲取難度。

3.2 影響苦蕎愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的因素

本研究?jī)?yōu)化了苦蕎愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化條件。苦蕎下胚軸的愈傷組織誘導(dǎo)率高于子葉，這與前人研究相符[28]。激素配比是誘導(dǎo)愈傷組織形成的關(guān)鍵，不同苦蕎品種對(duì)激素的敏感程度可能存在差異，從而導(dǎo)致不同苦蕎品種的最佳愈傷組織誘導(dǎo)激素組合不同[29]。本研究以苦蕎“西蕎二號(hào)”下胚軸為外植體時(shí)，在MS培養(yǎng)基中添加0.8 mg·L-16-BA及3.5 mg·L-12,4-D時(shí)，可達(dá)到最佳的誘導(dǎo)效果，繼代培養(yǎng)基里6-BA與KT含量分別為3和1 mg·L-1時(shí)，愈傷組織增殖效果最好，有別于前人報(bào)道的九江苦蕎及園子蕎[11, 28]。此外，不同農(nóng)桿菌菌株會(huì)根據(jù)目標(biāo)植物種類的不同，表現(xiàn)出不同的毒性強(qiáng)弱，從而導(dǎo)致侵染效率的差異[30]。例如，小果咖啡中GV3101菌株侵染效率高于LBA4404菌株[31]，蘋果中EHA101菌株侵染效率優(yōu)于LBA4404菌株和C58C1菌株[32]。本研究結(jié)果顯示，GV3101菌株相較于C58C1菌株侵染效率更高，更適于苦蕎的遺傳轉(zhuǎn)化。綜上所述，本研究初步建立了穩(wěn)定的苦蕎愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系，并成功獲得了過表達(dá)的陽(yáng)性苦蕎轉(zhuǎn)基因愈傷組織。此外，先前的研究表明愈傷組織的再分化需要外源激素誘導(dǎo)，6-BA與IAA、NAA和KT的多種組合添加到分化培養(yǎng)基里可誘導(dǎo)苦蕎愈傷組織芽的產(chǎn)生[10-11, 28]。但適用于本研究遺傳轉(zhuǎn)化體系的分化培養(yǎng)基還需進(jìn)一步探索。

A：FtCHSs基因；B：類黃酮代謝分支酶基因；C：SG7亞家族轉(zhuǎn)錄因子基因和SG4類亞家族轉(zhuǎn)錄因子基因

A: FtCHSs gene; B: flavonoid metabolic branch enzyme genes; C: SG7 subfamily transcription factors genes and SG4-like gene subfamily transcription factor

圖6 過表達(dá)愈傷組織中黃酮合成相關(guān)基因的表達(dá)量分析

Fig. 6 Expression analysis of flavonoid synthesis related genes in overexpressedcallus

3.3 FtCHS1促進(jìn)類黃酮積累的機(jī)制

查爾酮合酶作為植物類黃酮合成途徑中的第一個(gè)關(guān)鍵酶，在黃酮類化合物合成起重要作用[33-34]。本研究中，過表達(dá)轉(zhuǎn)基因愈傷組織均增加了黃酮醇和花青素含量，、、和等其他黃酮合成途徑酶基因也在轉(zhuǎn)錄水平顯著增強(qiáng)，表明的過表達(dá)可以可通過調(diào)節(jié)上游代謝流量來促進(jìn)下游黃酮醇和花青素的生物合成。查爾酮合酶基因的轉(zhuǎn)錄活性通常由轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)，尤其是R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子家族[35-36]。本研究表明，過表達(dá)還可以反向影響相關(guān)R2R3-MYB基因的表達(dá)水平，即分別上調(diào)正控黃酮醇合成SG7亞家族成員和下調(diào)負(fù)控花青素合成SG4亞家族成員的表達(dá)[21-22]?？梢姡^表達(dá)可能對(duì)苦蕎黃酮代謝具有更為復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)，有待進(jìn)一步深入解析。

4 結(jié)論

通過對(duì)苦蕎愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系條件的優(yōu)化，建立了穩(wěn)定有效的轉(zhuǎn)基因苦蕎愈傷組織誘導(dǎo)體系。過表達(dá)的愈傷組織可以通過調(diào)節(jié)類黃酮相關(guān)基因的表達(dá)來促進(jìn)黃酮醇和花青素的積累。

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Optimization of callus genetic transformation system and its application inoverexpression in tartary buckwheat

ZHAO HaiXia, XIAO Xin, DONG QiXin, WU Huala, LI ChengLei, WU Qi

College of Life Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, Sichuan

【】To develop a novel tool for functional verification and molecular breeding in tartary buckwheat, this study focused on establishing and optimizing an efficient callus genetic transformation system. 【】Callus induction factors including different explants, ratios of diverse growth regulators, andtypes were systematically evaluated using “Xiqiao No. 2” as the derived plant. We further overexpressed, a key enzyme gene involved in the biosynthesis of tartary buckwheat flavonoids in obtained calli to validate the optimized genetic callus transformation system. The positive transgenic lines were confirmed by PCR and fluorescent observation. Subsequently, the content of anthocyanins and metabolites in flavonol branch pathway were determined by UV spectrophotometry and High Performance Liquid Chromatography (HPLC), respectively. Furthermore, quantitative real-time PCR was performed to analyze expression levels of genes involved in flavonoid synthesis, in order to compare the differences between theoverexpressed calli and the control. 【】The optimal explant was hypocotyls and the optimal induction medium was the Murashige and Skoog (MS) medium supplemented with the addition of 0.8 mg·L-16-BA (6-Benzylaminopurine) and 3.5 mg·L-12,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid). The induction rate of calli grown on the above medium reached up to 72%. Moreover, the optimized subculture medium containing MS with the additives of 3 mg·L-16-BA and 1 mg·L-1KT (Kinetin) increased the percentage and coefficient of callus proliferation to 98% and 1.09, respectively. Additionally, the bestin the transformation process was GV3101, and the transformation efficiency was up to 31.3%. The functional analysis ofoverexpressing in transgenetic calli demonstrated that: (1) the accumulations of kaempferol and quercetin in transgenic calli overexpressingwere dramatically higher than those in control groups (＜0.01), and anthocyanin, rutin and myricetin contents were also remarkably higher (＜0.05); (2) overexpression of the exogenousdid not affect the expression levels of 5 endogenous orthologous genesin the transgenic calli (＞0.05), whereas genes encoding key enzymes of the flavonoid synthesis pathway, such as,,,,,and, were up-regulated (＜0.05); (3)and, the transcription factor genes that specifically positively regulated the flavonol synthesis, were up-regulated, while, a suppressor gene of anthocyanin synthesis, was down-regulated (＜0.05). 【】In this study, the callus genetic transformation system of tartary buckwheat was successfully established from “Xiqiao No. 2”.1 overexpression in the transgenic calli up-regulated genes related to flavonoid synthesis, resulting in flavonoids accumulation.

tartary buckwheat; callus; genetic transformation; chalcone synthase gene

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.09.003

2021-11-01；

2021-12-30

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31871699）

趙海霞，E-mail：zhaohaixia@sicau.edu.cn。通信作者吳琦，E-mail：wuqi@sicau.edu.cn

（責(zé)任編輯 李莉）