武曉亮，焦娟，張連，張利民，張艷艷，趙瑞仝，李文金

（泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東 泰安 271000）

目前我國(guó)土壤次生鹽漬化現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，鹽堿地總面積3600萬(wàn)hm2，其中鹽堿耕地920萬(wàn)hm2［1］。選育耐鹽作物品種能夠有效開(kāi)發(fā)并利用鹽堿地，提高資源利用率。

花生（Arachis hypogaeaL.）是我國(guó)單產(chǎn)、總產(chǎn)和出口創(chuàng)匯額最高的油料作物，對(duì)保障我國(guó)食用油供給安全、改善和提高我國(guó)城鄉(xiāng)居民營(yíng)養(yǎng)水平具有重要意義?；ㄉ鷮僦械饶望}作物，以其扎根深、能夠充分利用所吸收的少量水分、適應(yīng)性強(qiáng)成為適應(yīng)鹽堿旱薄地的優(yōu)勢(shì)農(nóng)作物［2］。在全球范圍內(nèi)，70%的花生作物種植于相對(duì)鹽堿旱薄地區(qū)［3，4］。因此加強(qiáng)花生耐鹽性研究，發(fā)展鹽堿地花生生產(chǎn)，在提高鹽堿地區(qū)資源利用率方面具有重要作用。

脫落酸（abscisic acid，簡(jiǎn)稱ABA）是高等植物中普遍存在的一種植物調(diào)節(jié)激素，具有促進(jìn)葉片和果實(shí)脫落，促進(jìn)芽休眠和抑制萌發(fā)，抑制生長(zhǎng)、促進(jìn)衰老等作用。Bueno等［5］最早在煙草中發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化物酶（POD）的活性在ABA處理后明顯升高，緩解了過(guò)氧化氫對(duì)煙草植株的傷害。鹽脅迫下，ABA處理可通過(guò)減少玉米活性氧（ROS）的產(chǎn)生提高抗逆性［6］。2002年，研究人員發(fā)現(xiàn)ABA處理可通過(guò)提高植物體內(nèi)抗氧化酶［超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽還原酶（GR）和抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）］的活性提高抗逆性［7］。目前ABA被公認(rèn)為能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生對(duì)不良環(huán)境的抗性，是植物的“抗逆誘導(dǎo)因子”。

ABA生物合成途徑的關(guān)鍵基因包括編碼玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶的ZEP基因、編碼9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶的NCED基因和編碼鉬輔因子硫酸化酶的LOS5基因等［8-11］。Park等［8］在擬南芥中過(guò)表達(dá)AtZEP基因，鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)更旺盛。Aswath等［12］將豇豆VuNCED1基因轉(zhuǎn)化匍匐剪股穎，鹽脅迫時(shí)可增加內(nèi)源ABA的含量，提高轉(zhuǎn)基因植株的存活率。Zhang等［13］將擬南芥LOS5基因轉(zhuǎn)入玉米后，改善了根細(xì)胞離子通道和葉片含水量，耐鹽性得以提高；將LOS5基因分別轉(zhuǎn)入甘薯和黃瓜后，轉(zhuǎn)基因植株醛氧化酶活性顯著提高，ABA積累增多，耐鹽性增強(qiáng)［14，15］；LOS5基因轉(zhuǎn)入水稻和大豆后，轉(zhuǎn)基因植株均表現(xiàn)出良好的抗逆性［16，17］。因此，ABA生物合成相關(guān)基因在植物逆境脅迫中起著重要的調(diào)控作用，可能具有重要的育種應(yīng)用價(jià)值。

為了探究花生ABA途徑抗逆基因AhLOS5的耐鹽性功能，本研究以野生型（WT）三生煙、T1代AhLOS5過(guò)表達(dá)以及RNAi轉(zhuǎn)基因煙草株系為研究對(duì)象，進(jìn)行了耐鹽性生物學(xué)功能分析，以期為進(jìn)一步研究AhLOS5基因的功能，并指導(dǎo)花生耐鹽育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2020年4月在泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物工程研究所進(jìn)行。三生煙（Nicotiana tabacumL.cv.Samsun）溫室常規(guī)管理。轉(zhuǎn)基因煙草株系為本實(shí)驗(yàn)室前期獲得：AhLOS5基因過(guò)表達(dá)株系和RNAi株系分別通過(guò)攜帶AhLOS5基因相關(guān)片段的pBI121正義表達(dá)載體和反義表達(dá)載體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化三生煙葉片獲得。其中正義表達(dá)載體攜帶AhLOS5基因全長(zhǎng)cDNA；反義表達(dá)載體攜帶與煙草中LOS5基因同源性達(dá)84.07%的269 bp片段，該片段位于1288～1557 bp，最長(zhǎng)的完全一致序列長(zhǎng)度為28 bp，符合RNAi要求。本試驗(yàn)所用轉(zhuǎn)基因株系為T(mén)1代正義轉(zhuǎn)基因株系LOS5-9和反義轉(zhuǎn)基因株系LOS5-R-7。

1.2 RNA提取

采用RNA simple總RNA提取試劑盒（QIAGEN公司）提取，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。

1.3 Northern blot檢測(cè)

將經(jīng)6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的RNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，65℃雜交箱預(yù)雜交12 h；以α-32P-dCTP標(biāo)記的目標(biāo)基因片段為探針，65℃過(guò)夜雜交；雜交后的膜于2×SSC（含0.1%SDS）及0.2×SSC（含0.1%SDS）洗液中清洗2次；將尼龍膜與X-光片緊密貼合，置于X射線曝光暗盒中，放置在-80℃冰箱中放射自顯影48 h。在暗室中經(jīng)顯影、停影和定影，觀測(cè)Northern blot檢測(cè)結(jié)果。

1.4 轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽性測(cè)定

幼苗根長(zhǎng)測(cè)定：將野生型與正義和反義轉(zhuǎn)基因植株的T1代種子分別播種于1/2MS培養(yǎng)基上，置于25℃光照培養(yǎng)箱（16 h光照/8 h黑暗）。萌發(fā)后，選擇生長(zhǎng)一致的煙草苗各20株，分別置于含有100 mmol/L NaCl的1/2MS液體培養(yǎng)基（NaCl）和正常1/2MS液體培養(yǎng)基（CK），7 d后測(cè)量根長(zhǎng)。

葉片萎蔫癥狀檢測(cè)：將生長(zhǎng)至6葉期的野生型和正義以及反義轉(zhuǎn)基因煙草各20株帶根部取出，自來(lái)水洗凈土壤，浸入含100 mmol/L NaCl溶液的1/2MS液體培養(yǎng)基。以正常1/2MS液體培養(yǎng)基處理為對(duì)照（CK）。鹽脅迫處理4 d后觀察植株葉片萎蔫程度。

1.5 轉(zhuǎn)基因煙草理化指標(biāo)的測(cè)定

將種子用75%乙醇清洗3 min，用含50 mL Tween-20、有效氯2.6%的NaClO消毒10 min，無(wú)菌ddH2O（含100 mL Tween-20）清洗2次。將消毒后的煙草種子播于篩選培養(yǎng)基（1/2MS培養(yǎng)基，含卡那霉素100 mg/L，羧芐青霉素250 mg/L）上，4℃培養(yǎng)3 d，轉(zhuǎn)到28℃培養(yǎng)7 d。7 d后選擇根系發(fā)達(dá)、葉色濃綠的幼苗進(jìn)行移栽，室溫生長(zhǎng)7 d后進(jìn)行理化指標(biāo)測(cè)定。葉綠素含量、丙二醛含量（MDA）、相對(duì)電導(dǎo)率、抗氧化酶活性（APX、POD、SOD、CAT）、抗氧化物質(zhì)含量（GSH和ASA）、脯氨酸（proline）及內(nèi)源ABA含量測(cè)定方法參照《植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)》［18］，重復(fù)3次。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Sigma Plot進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用SPSS 21.0進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)煙草植株AhLOS5基因的表達(dá)量

Northern blot檢測(cè)結(jié)果（圖1）顯示，轉(zhuǎn)正義AhLOS5基因的煙草植株中AhLOS5基因過(guò)量表達(dá)，轉(zhuǎn)反義AhLOS5基因的煙草植株成功抑制了AhLOS5基因的表達(dá)。

圖1 煙草植株Northern blot檢測(cè)結(jié)果

2.2 轉(zhuǎn)基因煙草植株耐鹽性

正常條件下，WT、LOS5-9與LOS5-R-7煙草幼苗平均根長(zhǎng)分別為4.0、3.8、3.9 cm，差異不顯著。鹽脅迫條件下，WT和轉(zhuǎn)基因煙草幼苗根長(zhǎng)都較正常條件下的短，其中LOS5-9平均根長(zhǎng)為2.9 cm，顯著大于WT的1.7 cm和LOS5-R-7的1.4 cm（圖2）。

圖2 不同處理煙草幼苗根長(zhǎng)

結(jié)果（圖3）顯示，鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因和WT煙草植株葉片均出現(xiàn)不同程度的萎蔫。LOS5-9轉(zhuǎn)基因植株萎蔫癥狀輕微，WT和LOS5-R-7煙草植株均出現(xiàn)明顯的萎蔫癥狀。

圖3 植株葉片萎蔫程度檢測(cè)

2.3 過(guò)表達(dá)AhLOS5轉(zhuǎn)基因植株耐鹽機(jī)制

2.3.1 鹽脅迫下煙草植株的細(xì)胞膜完整性 鹽脅迫下，植物會(huì)受到過(guò)氧化傷害，導(dǎo)致葉綠素生物合成降低、分解加速，表現(xiàn)為MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率上升，葉綠素含量下降。結(jié)果（圖4）表明，正常生長(zhǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因與WT煙草植株MDA含量、相對(duì)電導(dǎo)率和葉綠素含量無(wú)顯著差異。鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因和WT煙草植株的MDA含量、相對(duì)電導(dǎo)率均顯著升高，葉綠素含量顯著降低。LOS5-9轉(zhuǎn)基因植株MDA含量和電導(dǎo)率升幅最小，WT煙草植株次之，LOS5-R-7轉(zhuǎn)基因植株升幅最大。LOS5-9轉(zhuǎn)基因植株葉綠素含量降幅最小，WT煙草植株次之，LOS5-R-7轉(zhuǎn)基因植株降幅最大。表明過(guò)表達(dá)AhLOS5轉(zhuǎn)基因植株細(xì)胞膜受鹽脅迫的傷害較小。

圖4 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草植株電導(dǎo)率、MDA和葉綠素含量變化

2.3.2 鹽脅迫下煙草植株抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量 SOD、POD、APX和CAT是植物體內(nèi)4種重要的抗氧化酶。SOD是活性氧清除系統(tǒng)中第一個(gè)發(fā)揮作用的抗氧化酶，在活性氧大量生成的部位催化超氧離子的歧化反應(yīng)；POD、APX和CAT也是清除植物活性氧的關(guān)鍵酶。GSH和ASA可以清除由鹽脅迫誘導(dǎo)的過(guò)量活性氧；ASA還是維持APX活性的重要物質(zhì)［19］。

結(jié)果（圖5）表明，正常生長(zhǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因與WT煙草植株4種抗氧化酶活性以及兩種抗氧化物質(zhì)含量均無(wú)顯著差異。鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因和WT煙草植株的抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量均顯著升高，其中LOS5-9轉(zhuǎn)基因植株抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量升幅最大，WT煙草植株次之，LOS5-R-7轉(zhuǎn)基因植株升幅最小。

圖5 鹽脅迫下煙草植株抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量變化

2.3.3 鹽脅迫下煙草植株內(nèi)源ABA和脯氨酸含量 ABA是植物內(nèi)源合成的重要激素之一，鹽脅迫下ABA增加可引起氣孔關(guān)閉，減少水分蒸騰，還可通過(guò)促進(jìn)植物根的生長(zhǎng)并抑制莖的生長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)對(duì)鹽脅迫的應(yīng)答。脯氨酸是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以保護(hù)植物在遇到逆境時(shí)免受進(jìn)一步的傷害。由圖6可知，正常生長(zhǎng)條件下，植物體內(nèi)源ABA和脯氨酸的含量均較低，野生與轉(zhuǎn)基因植株間無(wú)顯著差異。鹽脅迫條件下，煙草植株體內(nèi)的ABA及脯氨酸含量急劇增加，LOS5-9轉(zhuǎn)基因植株的升幅最大，WT植株次之，LOS5-R-7轉(zhuǎn)基因植株升幅最小。其中LOS5-9轉(zhuǎn)基因植株的內(nèi)源ABA和脯氨酸含量比WT煙草植株分別高35.26%和40.97%，比LOS5-R-7轉(zhuǎn)基因植株分別高72.87%和1.38倍。

圖6 鹽脅迫下煙草植株內(nèi)源ABA和脯氨酸含量變化

2.4 鹽脅迫相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)分析

為明確過(guò)表達(dá)AhLOS5基因提高轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽性的作用機(jī)理，對(duì)其他抗逆相關(guān)基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)模式進(jìn)行了Northern blot檢測(cè)，包括P5CS、RD22和DREB2B。根據(jù)前人研究，DREB2B編碼一個(gè)與DRE順式作用元件結(jié)合的反式作用因子，通過(guò)調(diào)控DRE基因提高植物抗逆性，是不依賴ABA的抗逆途徑［20］。RD22的啟動(dòng)子中具有脅迫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子MYC和MYB順式結(jié)合位點(diǎn)，是依賴ABA抗逆途徑中的重要基因［21，22］。P5CS是催化脯氨酸生物合成的關(guān)鍵酶，參與依賴ABA的抗逆脅迫途徑［23］。

結(jié)果（圖7）顯示，在WT煙草植株中，P5CS、RD22和DREB2B基因在正常條件下都有較低水平的表達(dá)，鹽脅迫可以誘導(dǎo)3個(gè)基因的超表達(dá)，說(shuō)明3個(gè)基因都參與了植物抗鹽反應(yīng)。在LOS5-9轉(zhuǎn)基因植株中，P5CS和RD22兩個(gè)基因受脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的程度明顯高于WT煙草植株，而DREB2B基因的誘導(dǎo)表達(dá)程度則與WT植株無(wú)顯著差異。LOS5-R-7轉(zhuǎn)基因植株中，鹽脅迫僅顯著誘導(dǎo)DREB2B基因的超表達(dá)。說(shuō)明AhLOS5與P5CS和RD22相同，都屬于ABA途徑相關(guān)的抗逆基因。

圖7 鹽脅迫下抗逆相關(guān)基因在煙草中的表達(dá)

3 討論與結(jié)論

植物抵御逆境脅迫的途徑可分為兩類，即依賴內(nèi)源ABA的抗逆途徑和不依賴ABA的抗逆途徑。依賴ABA的抗逆途徑可引起內(nèi)源ABA的積累，且對(duì)外源施加的ABA發(fā)生顯著的生物學(xué)效應(yīng)，這一信號(hào)傳導(dǎo)途徑稱為依賴ABA的信號(hào)傳導(dǎo)途徑［22，24］。逆境脅迫時(shí)，外源噴施ABA可以增強(qiáng)抗氧化酶活性，降低活性氧含量，防止葉綠素降解，增大葉片相對(duì)含水量，減小質(zhì)膜透性及丙二醛含量，增強(qiáng)PSⅡ的修復(fù)功能。在鹽脅迫下，植物體內(nèi)ABA含量迅速增加，可降低葉片伸展率，調(diào)整保衛(wèi)細(xì)胞離子通道；抑制氣孔開(kāi)放、促進(jìn)氣孔關(guān)閉，保持正常生命活動(dòng)［25，26］。

在轉(zhuǎn)ABA生物合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)基因植株中，內(nèi)源ABA積累是一個(gè)共性特征，包括轉(zhuǎn)AtZEP基因的擬南芥，轉(zhuǎn)NCED基因的番茄、擬南芥、煙草［8-10，27］。Xiong等［28］在2002年發(fā)現(xiàn)非生物脅迫下內(nèi)源ABA的生物合成機(jī)制：首先滲透壓的改變誘導(dǎo)了NCED的表達(dá)，啟動(dòng)了逆境脅迫ABA生物合成的第一步；ABA含量的波動(dòng)引起隨后一系列ABA生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，包括AAO、LOS5以及ZEP等基因，更增加了ABA的生物合成；這種多基因互作的協(xié)同效應(yīng)最終使植株內(nèi)源ABA積累量迅速增加。與本試驗(yàn)結(jié)果一致。轉(zhuǎn)基因植株ABA通過(guò)調(diào)控許多受內(nèi)源ABA誘導(dǎo)的脅迫應(yīng)答基因，啟動(dòng)了更多的生物合成，使得植物的抗逆性進(jìn)一步增強(qiáng)。這也可以解釋本試驗(yàn)中正義轉(zhuǎn)基因煙草在鹽脅迫下根長(zhǎng)更長(zhǎng)、脅迫耐受性更強(qiáng)的現(xiàn)象。

活性氧是植物鹽脅迫環(huán)境下產(chǎn)生的有害物質(zhì)，可損壞細(xì)胞膜，造成膜脂過(guò)氧化，同時(shí)引起MDA在細(xì)胞中積累和相對(duì)電導(dǎo)率升高，影響細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成。脅迫產(chǎn)生的ABA信號(hào)同時(shí)會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)多種抗氧化酶活性，包括SOD、POD、CAT和APX，這些過(guò)氧化物酶可以清除細(xì)胞中的活性氧，以保護(hù)細(xì)胞免受過(guò)氧化傷害［7］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株都出現(xiàn)了MDA積累和相對(duì)電導(dǎo)率增加的現(xiàn)象；而正義轉(zhuǎn)基因植株的抗氧化酶活性更高，MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率更低。

為進(jìn)一步證明過(guò)表達(dá)AhLOS5轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽性是由鹽脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)源ABA調(diào)控的，本試驗(yàn)選取了另外3個(gè)脅迫相關(guān)基因，研究其在不同煙草植株中的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，在正義轉(zhuǎn)基因植株中，4個(gè)抗逆基因都受到鹽脅迫的誘導(dǎo)而超表達(dá)；而在反義轉(zhuǎn)基因植株中，鹽脅迫只能誘導(dǎo)不依賴ABA途徑的DREB2B基因的超表達(dá)，卻不能誘導(dǎo)ABA途徑的P5CS和RD22的過(guò)量表達(dá)。證明了LOS5基因的抗逆途徑與DREB2B不同，而與P5CS、RD22相同，都屬ABA途徑的抗逆基因，過(guò)表達(dá)AhLOS5基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株獲得的耐鹽性是由脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)源ABA調(diào)控的。本研究為進(jìn)一步探索AhLOS5基因在花生抗逆育種中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。