董亞茹，聶玉霞，李云芝，趙東曉，耿兵，王照紅

（山東省蠶業(yè)研究所，山東 煙臺(tái) 264002）

土壤鹽漬化是自然界常見的逆境，全世界約有20%的耕地受到鹽漬化威脅，嚴(yán)重影響了植物的生長(zhǎng)、光合作用及生物量積累、產(chǎn)量等［1，2］。植物對(duì)非生物脅迫的反應(yīng)受到多種因素的影響，涉及大量抗性基因的表達(dá)與調(diào)控，因此要提高植物對(duì)逆境的抗性就要從一些關(guān)鍵的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子著手。AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的與脅迫應(yīng)答有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子超家族。該類轉(zhuǎn)錄因子都具有1個(gè)或2個(gè)由60～70個(gè)氨基酸殘基組成的非常保守的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域。Sakuma等［3］依據(jù)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的AP2結(jié)構(gòu)域相似性將其劃分為5大類，即AP2、ERF、DREB、RAV和Soloist。不同植物中AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子及其各亞家族成員的數(shù)量存在差異。桑樹中共鑒定到116個(gè)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員，其中ERF 58個(gè)，AP233個(gè)，DREB 21個(gè)，RAV 3個(gè)，Soloist 1個(gè)［4］。

20世紀(jì)90年代，第一個(gè)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子從擬南芥中分離出來(lái)，研究表明其參與調(diào)控了花的發(fā)育過(guò)程［5］。事實(shí)證明，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子不僅參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育，在響應(yīng)低溫、干旱、高鹽、缺氧、高溫等逆境脅迫方面也起到非常重要的作用［6，7］。擬南芥中AtCBF3基因可以誘導(dǎo)編碼脯氨酸合成關(guān)鍵酶的表達(dá)，增加體內(nèi)游離脯氨酸含量，提高植株的耐寒性［8］。過(guò)表達(dá)AtERF1基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株同時(shí)表現(xiàn)出對(duì)高溫、高鹽及干旱的耐受性，形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)植株通過(guò)減小葉片氣孔孔徑以降低水分流失［9］。覃利萍［10］在對(duì)剛毛檉柳的研究中發(fā)現(xiàn)ThCRF1轉(zhuǎn)錄因子可以促進(jìn)海藻糖和脯氨酸的生物合成以及提高SOD和POD活性，從而提高植物對(duì)鹽脅迫的耐受性。Yao等［11］發(fā)現(xiàn)擬南芥ERF74和ERF75受缺氧脅迫誘導(dǎo)，通過(guò)調(diào)控缺氧響應(yīng)基因的表達(dá)來(lái)提高植株的缺氧耐受能力，同時(shí)敲除ERF74和ERF75的突變體植株表現(xiàn)出對(duì)淹水脅迫較高的敏感性。高溫脅迫下擬南芥AtCBF3顯著表達(dá)，與野生型相比，轉(zhuǎn)AtCBF3基因的馬鈴薯植株ROS積累量減少，光合作用顯著提高，表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐高溫性［12］。此外，AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子也參與乙烯的生物合成及信號(hào)傳導(dǎo)。

本研究將MnERF2基因過(guò)表達(dá)載體（pROKⅡ-MnERF2）、抑制表達(dá)載體（pROKⅡ-MnERF2-SRDX）瞬時(shí)轉(zhuǎn)入桑樹中并通過(guò)NaCl脅迫使其表達(dá)，比較分析了不同轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽生理指標(biāo)，初步鑒定MnERF2的功能，以期為桑樹及木本植物耐鹽分子機(jī)制研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試桑樹品種為雜交種桂桑優(yōu)12，種子購(gòu)于廣西蠶業(yè)技術(shù)推廣總站。試驗(yàn)于2021年3月在山東省蠶業(yè)研究所組培實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。挑選飽滿一致的種子，在超凈臺(tái)中用75%乙醇消毒1 min，然后用5%次氯酸鈉消毒10 min，最后用無(wú)菌水沖洗5次，鋪種到裝有MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。一周后挑選萌發(fā)無(wú)菌的種子移栽到裝有MS培養(yǎng)基的組培瓶中，每瓶4顆種子，以此獲得大量無(wú)菌桑樹植株，用于瞬時(shí)侵染試驗(yàn)。植物過(guò)表達(dá)載體（pROKⅡ-MnERF2）、抑制表達(dá)載體（pROKⅡ-MnERF2-SRDX）由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。MnERF2屬于ERF亞家族，GenBank登錄號(hào)為XM_010106513，由本實(shí)驗(yàn)室從桂桑優(yōu)12中克隆獲得。

1.2 MnERF2基因過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化桑樹

選擇生長(zhǎng)一致的1個(gè)月左右的桑樹無(wú)菌苗，將構(gòu)建好的MnERF2基因過(guò)表達(dá)載體（pROKⅡ-MnERF2，OE）、抑 制 表 達(dá) 載 體（pROKⅡ-MnERF2-SRDX，RNAi）和空載體（pROKⅡ，WT）分別瞬時(shí)侵染桑樹組培苗，侵染方法參照J(rèn)i等［13］的描述。桑樹植株在1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后移至含有100 mmol·L-1NaCl的1/2MS培養(yǎng)基中，在脅迫處理0、6、12、24、48 h取整株桑樹材料，經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃冰箱，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 MnERF2基因瞬時(shí)表達(dá)桑樹的抗逆生理指標(biāo)測(cè)定

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

用植物RNA試劑盒提取桑樹植株總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍，選擇MnRPL15和β-actin作為內(nèi)參基因，引物見表1，由上海生工生物有限公司合成。RT-PCR反應(yīng)體系為：TB Green PremixEx Taq10μL，基因特異性上下游引物各1μL（10μmol·L-1），模板2 μL，補(bǔ)ddH2O至20μL。每個(gè)測(cè)試樣品進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。反應(yīng)程序按照TB Green PremixEx Taq（TaKaRa No.RR820Q）說(shuō)明進(jìn)行，在CFX96 Real-Time PCR Detection System儀器（Bio-Rad Bio.CA.USA）上完成。RT-PCR數(shù)據(jù)利用2-△△Ct法［21］進(jìn)行分析。

表1 RT-PCR引物及其序列

2 結(jié)果與分析

2.1 MnERF2基因瞬時(shí)表達(dá)桑樹植株的獲得

NaCl脅迫48 h后對(duì)MnERF2基因瞬時(shí)表達(dá)量進(jìn)行RT-PCR分析，結(jié)果（圖1）顯示，MnERF2基因在瞬時(shí)過(guò)表達(dá)（OE）株系中的表達(dá)量最高，在抑制表達(dá)（RNAi）株系中最低。表明已成功獲得了瞬時(shí)過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)MnERF2基因的桑樹植株。

圖1 MnERF2基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)化桑樹植株qRT-PCR檢測(cè)

2.2 MnERF2基因瞬時(shí)表達(dá)桑樹植株的抗性生理研究

2.2.1 ROS及MDA含量的變化 NaCl脅迫后，MnERF2基因OE株系中的、H2O2、·OH和MDA含量均低于野生株，而RNAi株系中的含量高于野生株，且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，各株系中的、H2O2、·OH和MDA含量均不斷增加。脅迫48 h時(shí)，OE株系的、H2O2、·OH和MDA含量分別比野生株降低了17.67%、34.42%、30.24%和27.40%，而RNAi株系分別比野生株升高了27.45%、46.17%、21.74%和9.71%（圖2）。

圖2 NaCl脅迫不同時(shí)間轉(zhuǎn)基因和野生桑樹中ROS和MDA含量的變化

2.2.2 抗氧化酶活性 NaCl脅迫后，MnERF2基因OE株系中SOD、POD、CAT、GST活性均強(qiáng)于對(duì)照，RNAi株系中則均弱于對(duì)照，且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)各株系中的四種保護(hù)酶活性均不斷增加。脅迫48 h時(shí)，OE株系的SOD、POD、CAT、GST活性分別比野生株提高了36.05%、23.86%、37.98%、24.46%，RNAi株系的則比野生株降低了28.16%、29.32%、23.74%、22.24%（圖3）。

圖3 NaCl脅迫不同時(shí)間轉(zhuǎn)基因和野生桑樹中SOD、POD、CAT和GST活性的變化

2.2.3 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量 NaCl脅迫后，MnERF2基因OE株系中AsA、GSH、脯氨酸含量均高于對(duì)照，而RNAi株系中均低于對(duì)照，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)均不斷增加。脅迫48 h時(shí)，OE株系的AsA、GSH、脯氨酸含量分別比野生株提高41.73%、22.47%、34.47%，RNAi株系則分別比野生株降低25.18%、18.32%、31.03%（圖4）。

圖4 NaCl脅迫不同時(shí)間轉(zhuǎn)基因桑樹和野生桑樹中AsA、GSH和脯氨酸含量的變化

2.3 抗氧化酶基因表達(dá)分析

由于脅迫48 h的抗氧化酶活性最高，因此對(duì)該時(shí)間SOD、POD、CAT三種酶基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果（圖5）顯示，MnERF2基因的OE株系中三種酶基因的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照，而RNAi株系中三種酶基因的表達(dá)量均顯著低于對(duì)照。

圖5 NaCl脅迫48 h轉(zhuǎn)基因和野生桑樹中抗氧化酶基因的表達(dá)量

3 討論與結(jié)論

轉(zhuǎn)錄因子可以與啟動(dòng)子內(nèi)的順式元件相互作用，調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄，在植物抵抗非生物脅迫中具有重要作用［22］。因此，發(fā)掘抗非生物脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，研究其抗逆分子機(jī)制，能夠?yàn)橹参锟鼓娣肿痈牧继峁┲匾獢?shù)據(jù)和材料。已有研究顯示，不同植物的ERF轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)控脅迫響應(yīng)基因，在高鹽度、干旱和低溫等非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用［23-26］。本研究前期在桑樹鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析中發(fā)現(xiàn)ERF基因響應(yīng)鹽脅迫的誘導(dǎo)，并從中篩選到一個(gè)上調(diào)表達(dá)倍數(shù)較高的ERF基因，命名為MnERF2，推測(cè)其在桑樹耐鹽響應(yīng)中發(fā)揮一定功能。

為了驗(yàn)證MnERF2基因的耐鹽功能，分析桑樹響應(yīng)鹽脅迫的生理生化變化，本研究分別構(gòu)建植物過(guò)表達(dá)載體（pROKⅡ-MnERF2）及抑制表達(dá)載體（pROKⅡ-MnERF2-SRDX），通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效瞬時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化獲得了MnERF2基因瞬時(shí)過(guò)表達(dá)（OE）、抑制表達(dá)（RNAi）桑樹植株，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，MnERF2基因在OE植株中的表達(dá)量顯著高于在RNAi植株中，表明獲得了瞬時(shí)表達(dá)桑樹植株，這與在擬南芥［21］、白樺［27］、檉柳［28］上的研究結(jié)果類似，可用于后續(xù)抗逆功能的研究。

活性氧（ROS）是有氧代謝的副產(chǎn)物［29］。當(dāng)植物遭遇鹽和干旱脅迫時(shí)，ROS會(huì)過(guò)度積累，導(dǎo)致DNA、脂類、蛋白質(zhì)的損傷，最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激［30］。通過(guò)抗氧化系統(tǒng)清除ROS，可將ROS保持在較低的穩(wěn)態(tài)水平［31］。鹽脅迫可以顯著影響植物細(xì)胞質(zhì)膜脂質(zhì)過(guò)氧化，從而改變質(zhì)膜滲透性，調(diào)節(jié)離子的滲透模式，鹽脅迫引起的這種膜損傷也與ROS的增加有關(guān)［32］。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化作用的最終產(chǎn)物，其積累量反映了氧自由基引起的細(xì)胞膜損傷程度［13］。為此，本研究分別對(duì)NaCl脅迫條件下MnERF2基因過(guò)表達(dá)、抑制表達(dá)及野生桑樹植株的ROS和MDA含量進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，過(guò)表達(dá)MnERF2基因可以降低桑樹在鹽脅迫下的O2·-、H2O2、·OH和MDA含量，說(shuō)明MnERF2基因可以降低鹽脅迫下的氧化應(yīng)激，從而保護(hù)細(xì)胞膜、減輕損傷，具有一定的耐鹽性。

為了避免ROS過(guò)度積累造成的氧化損傷，植物自身抗氧化系統(tǒng)會(huì)通過(guò)提高抗氧化酶活性和非酶物質(zhì)來(lái)清除ROS。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）是一種多功能酶，在外源性物質(zhì)的解毒和應(yīng)激代謝中起著至關(guān)重要的作用，是植物在逆境條件下的重要因子，可防止氧化損傷［33］。擬南芥AtGSTU19在鹽度和干旱條件下表達(dá)上調(diào)，檉柳ThGSTZ1基因在干旱和鹽脅迫下表達(dá)上調(diào)［34，35］。本研究中，過(guò)表達(dá)MnERF2基因可以顯著提高桑樹在鹽脅迫下的SOD、POD、CAT、GST活性，具有正向調(diào)控作用，從而增強(qiáng)ROS清除能力，進(jìn)而提高桑樹的耐鹽性。這與前人［28，36］的研究結(jié)果類似。

抗壞血酸（AsA）具有抗氧化作用，能有效清除羥基自由基和過(guò)氧化物［37］。谷胱甘肽（GSH）是一種低分子量的硫醇，廣泛分布在動(dòng)植物中［38，39］，可以直接去除活性氧，是一種重要的抗氧化劑［40］。同時(shí)，GSH作為GST的底物，具有活性氧清除作用［38］。游離脯氨酸（Pro）可以調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的滲透性，在穩(wěn)定膜和蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮作用，起到對(duì)鹽、干旱和污染物脅迫的抗性作用［41］。本研究中，過(guò)表達(dá)MnERF2基因可以使鹽脅迫桑樹中的AsA、GSH、脯氨酸含量顯著高于對(duì)照和抑制表達(dá)植株。由此可見，MnERF2能夠通過(guò)控制鹽脅迫下AsA、GSH、脯氨酸的生物合成來(lái)增加植物的抗氧化物質(zhì)含量，提高滲透勢(shì)，最終提高植物的耐鹽性。

綜上所述，鹽脅迫下過(guò)表達(dá)MnERF2基因可通過(guò)增強(qiáng)抗氧化酶SOD、POD、CAT、GST活性，增加抗氧化物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，增強(qiáng)ROS清除能力，減少細(xì)胞受損或死亡，從而提高桑樹的耐鹽能力。