易 萌，王 麗，張竟豐，呂新瑞，趙力超,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東 廣州 510642；2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學與技術廣東省實驗室，廣東 廣州 510642）

嬰幼兒奶粉作為嬰幼兒母乳替代品被廣泛使用，其安全性一直備受關注。嬰幼兒食品在加工過程中很容易受到各種致病菌污染，而嬰幼兒自身免疫功能尚不成熟，相比其他人群更容易感染食源性致病菌。阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii）是嬰幼兒奶粉微生物重點檢測指標，感染后會導致嬰幼兒患病甚至死亡，對嬰幼兒危害性極強。因此我國GB 10765—2010《食品安全國家標準 嬰兒配方食品》中嚴格規(guī)定阪崎克羅諾桿菌在嬰幼兒奶粉中檢出限為0 CFU/100 g，這一標準需要高效、準確的檢測技術來實現(xiàn)。然而目前嬰幼兒奶粉中阪崎克羅諾桿菌污染途徑和污染控制方法仍然存在許多未知，耐受表型的存在增加了清除難度，“活的非可培養(yǎng)狀態(tài)”（viable but nonculturable，VBNC）表型阪崎克羅諾桿菌在嬰幼兒奶粉中的污染情況也沒有引起足夠的重視，常規(guī)檢測方法存在局限性，容易造成VBNC表型細菌漏檢，形成隱性污染，使人類了解和控制阪崎克羅諾桿菌污染處于不利處境。

目前相關檢測方法致力于檢出痕量存在的阪崎克羅諾桿菌，同時防止VBNC表型被漏檢，各種聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術和免疫檢測方法被運用，檢測靈敏度得到提升，VBNC菌的定量研究獲得一定成效，不過這些方法大多需要長時間富集來提高回收率和靈敏度，增加了時間消耗，未來需要在著重提高檢測靈敏度的同時簡化流程、提升效率，開發(fā)出具有針對性的檢測技術，以期保障嬰幼兒奶粉產(chǎn)品安全。本文通過嬰幼兒奶粉生產(chǎn)中阪崎克羅諾桿菌的暴露情況，分析該菌在嬰幼兒奶粉生產(chǎn)環(huán)境脅迫下的耐受表型和VBNC表型存在的潛在污染，歸納針對性的新型檢測方法，以期提高嬰幼兒奶粉安全性，為嬰幼兒奶粉阪崎克羅諾桿菌污染防控提供參考。

1 阪崎克羅諾桿菌的危害性

阪崎克羅諾桿菌是腸桿菌科，克羅諾桿菌屬微生物，原先被稱為阪崎腸桿菌，能引起新生兒、早產(chǎn)兒、低體重兒等免疫力低下人群感染壞死性小腸結(jié)腸炎、敗血癥、腦膜炎和嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥甚至死亡。雖然該菌的嬰幼兒感染概率低，但感染后的致病率和死亡率極高，研究報道阪崎克羅諾桿菌導致新生兒患病后死亡的概率為26.9%～80.0%[1-2]，嚴重威脅嬰幼兒安全。

作為最受關注的嬰幼兒奶粉微生物危害，雖然阪崎克羅諾桿菌感染途徑和方式尚不十分明確，但大部分阪崎克羅諾桿菌感染病例與嬰幼兒奶粉污染的因果關系已被證實[3-6]，該菌被聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO）與世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）列為與嬰幼兒奶粉相關的A類致病菌。一項報道中提到全球絕大多數(shù)病例報告來自美國、英國、法國、比利時和菲律賓5個國家[2]，但需要注意一些非發(fā)達地區(qū)對該菌的認識和研究有限。如表1所示，本文整理了近5 年國內(nèi)外關于阪崎克羅諾桿菌在市售嬰幼兒奶粉中的部分監(jiān)測報道，其中最常用的檢測方法是基于選擇性培養(yǎng)和生化鑒定的歐盟或美國的食品安全標準，該方法的缺點是容易漏檢、靈敏度低，國內(nèi)外關于阪崎克羅諾桿菌的監(jiān)測數(shù)據(jù)和感染率報告仍然不足，可能存在沒有獲得準確的分離數(shù)據(jù)和監(jiān)測研究報道的情況，所以需要警惕該菌在嬰幼兒奶粉中的存在。

表1 近5 年國內(nèi)外市售嬰幼兒奶粉中阪崎克羅諾桿菌分離情況的部分報道Table 1 Selected reports on the isolation of Cronobacter sakazakii in powder infant formula sold at home and abroad in the past five years

我國自2011年將阪崎克羅諾桿菌加入嬰幼兒配方奶粉微生物限量指標后，該菌在奶粉中的污染情況有所好轉(zhuǎn)，檢出率由2004年時的12.64%[7]降低到2020年的0.6%[17]，但嬰幼兒奶粉因阪崎克羅諾桿菌指標不合格而被召回的情況仍有發(fā)生，嬰幼兒奶粉中存在的阪崎克羅諾桿菌污染和危害仍然需要警惕。

2 嬰幼兒奶粉中阪崎克羅諾桿菌污染狀況分析

控制阪崎克羅諾桿菌在嬰幼兒奶粉中的污染刻不容緩，雖然該菌在嬰幼兒奶粉中的檢出量被嚴格限定，但是仍然存在各種因素導致該菌潛伏于嬰幼兒奶粉產(chǎn)品中造成公眾安全威脅。這些因素包括生產(chǎn)線上阪崎克羅諾桿菌的引入、生產(chǎn)工藝對該菌存活的影響，以及生產(chǎn)過程中該菌耐受表型殘留與VBNC表型存在的隱形危害。分析和了解阪崎克羅諾桿菌在工業(yè)生產(chǎn)中被引入的原因、傳播的途徑和方式、以何種狀態(tài)持續(xù)存在，將有助于在生產(chǎn)嬰幼兒奶粉過程中制定更有效的控制策略。

2.1 阪崎克羅諾桿菌在嬰幼兒奶粉生產(chǎn)過程中的暴露特征

阪崎克羅諾桿菌已從美國、德國、中國等地嬰幼兒奶粉工廠中分離出來，是工業(yè)界的普遍問題。國內(nèi)外大量文獻對該菌在嬰幼兒奶粉工廠環(huán)境中空間分布進行了調(diào)查，結(jié)果表明在嬰幼兒奶粉中發(fā)現(xiàn)的阪崎克羅諾菌與生產(chǎn)環(huán)境直接相關[18]，然而該菌在工廠環(huán)境中的傳播途徑和方式尚未完全明確，使得其持續(xù)性發(fā)生[19]。

各種不潔凈的原輔料是造成嬰幼兒奶粉產(chǎn)品中阪崎克羅諾桿菌陽性的主要原因，一項取樣調(diào)查證明了最終產(chǎn)品中阪崎克羅諾桿菌的來源是原料乳清蛋白粉[20]。阪崎克羅諾桿菌引入嬰幼兒奶粉生產(chǎn)線的一個可能途徑是濕法生產(chǎn)工藝中巴氏殺菌后添加的不潔凈熱敏性營養(yǎng)素等添加物[21-22]。干法生產(chǎn)方式中沒有殺菌步驟，脫脂奶粉、淀粉[23]以及米粉、燕麥粉和麥芽糊精[24-25]等原料被認為是阪崎克羅諾桿菌在干法生產(chǎn)中的潛在傳播途徑[26-27]。無論干法還是濕法生產(chǎn)工藝，都可能存在沒有得到充分除菌的原輔料進入嬰幼兒奶粉生產(chǎn)線，且較之濕法生產(chǎn)，干法生產(chǎn)一旦原料管理不嚴格，嬰幼兒奶粉產(chǎn)品污染風險將大大增加，說明嬰幼兒奶粉生產(chǎn)商必須警惕原輔料檢驗和管控，盡量采用濕法生產(chǎn)方式。還需要注意使用被污染的水清洗設備和管道可能造成該菌污染生產(chǎn)線，要警惕清潔與消毒程序殺菌不到位的情況，例如輸送管道清洗不徹底形成生物膜[28]、熱殺菌設備管道結(jié)垢使實際殺菌強度未達標等現(xiàn)象，但水傳播這一途徑?jīng)]有得到更多關注[29]，后續(xù)應當進行相關調(diào)查以進一步確保嬰幼兒奶粉安全。

噴霧干燥設備是所有生產(chǎn)空間內(nèi)最易檢出阪崎克羅諾桿菌存在的地點[30-31]，清潔不當?shù)膰婌F干燥塔內(nèi)部及噴霧干燥塔的紡織過濾器是該菌的宿主[30]，而噴霧干燥處理溫度與時間不足以殺死該菌，該菌被引入之后將殘留并流入后續(xù)生產(chǎn)環(huán)節(jié)造成終產(chǎn)品污染[32-33]。分離到的致病菌大多來自空氣處理區(qū)和人員流量大的地方[19,20,34-37]，說明空氣和人員的流動有助于傳播分散細菌。一項研究中，阪崎克羅諾桿菌在真空吸塵器的檢出率最高，為28.0%[38]，因此建議不要在清潔生產(chǎn)區(qū)域使用真空吸塵器。奶粉生產(chǎn)需要加強生產(chǎn)環(huán)境控制以降低污染風險，包括進行物理分區(qū)，保持低濕度，避免不潔粉塵、人員出入、不潔空氣流通等因素形成生物氣溶膠，保證生產(chǎn)規(guī)范，做好污染途徑阻隔。

暴露特征的調(diào)查和分析警示我們嬰幼兒奶粉生產(chǎn)中需要注意的問題主要是原料管理和生產(chǎn)操作規(guī)范管理，減少阪崎克羅諾桿菌在生產(chǎn)設施中生存和定植機會。但即使做好了這兩點，仍然有難以被發(fā)現(xiàn)的病原菌潛伏，需要對該菌的存在狀態(tài)進行研究。

2.2 阪崎克羅諾桿菌污染與耐受表型

阪崎克羅諾桿菌得以在嬰幼兒奶粉產(chǎn)品及生產(chǎn)過程中存在，大量研究將其總結(jié)于這種細菌對不利環(huán)境的耐受能力強，該菌比其他腸桿菌科細菌更加耐受環(huán)境脅迫，最明顯的是對于溫度和干燥交叉耐受特性。

耐熱表型是影響阪崎克羅諾桿菌存活率的主要因素[22,39]，研究表明，阪崎克羅諾桿菌能在熱處理之后存活[40-41]，發(fā)生熱休克還能增強對消毒劑的抵抗能力[42]，這種耐熱表型的存在警示了嬰幼兒食品生產(chǎn)中應用的標準巴氏殺菌條件對滅活阪崎克羅諾桿菌菌株的效果有待確認。WHO曾建議沖調(diào)奶粉的水溫不低于70 ℃[43]，但實際沖調(diào)時很可能達不到該溫度[44]，且70 ℃時該菌死亡需要2 min[45]，嬰幼兒奶粉生產(chǎn)中無法清除的耐熱菌將持續(xù)存在并被攝入，嬰幼兒安全風險增大。

與腸桿菌科其他菌相比，阪崎克羅諾桿菌更能抵抗干燥脅迫[33]。阪崎克羅諾桿菌耐干燥表型不僅能耐受噴霧干燥過程中的高溫和脫水[46]，在低水分活度的嬰幼兒奶粉產(chǎn)品中還能存活2 年之久[47-48]。細胞內(nèi)甜菜堿[49]和海藻糖[50]的積累可以增強細菌對滲透壓脅迫的耐受力，加上嬰幼兒奶粉基質(zhì)成分能對細菌形成保護作用，阪崎克羅諾桿菌耐干燥表型能表現(xiàn)出極強的干燥存活能力。干燥耐受與熱耐受之間有復雜的聯(lián)系，這種交叉耐受表型為清除阪崎克羅諾桿菌殘留增加了障礙。

阪崎克羅諾桿菌能形成生物膜附著于不銹鋼、聚氯乙烯、硅膠等多種材料表面，已在嬰幼兒奶粉生產(chǎn)設備和嬰幼兒腸胃營養(yǎng)管內(nèi)部檢出[51]，生物膜表型保護內(nèi)部的細菌不受消毒劑、抗生素、寡營養(yǎng)等不利環(huán)境干擾，是阪崎克羅諾桿菌持續(xù)存在的重要原因[28]。生物膜表型的阪崎克羅諾桿菌比浮游狀態(tài)時更能抵抗干燥脅迫[52]，使嬰幼兒食品污染問題更加復雜。

耐受表型細菌抵抗環(huán)境脅迫的能力增強，嬰幼兒奶粉殘留和嬰幼兒感染風險增加，對檢測技術的需求隨之增加，耐受機制也有待加強了解，以制定全面的污染防治和檢測控制措施。

2.3 阪崎克羅諾桿菌污染與VBNC表型

研究已經(jīng)證明，一些細菌能以VBNC表型存在，細菌面對不利環(huán)境脅迫時進入VBNC能保持活性，但平板培養(yǎng)時不會形成菌落，造成漏檢情況，VBNC狀態(tài)細菌能復蘇，被攝入后會導致疾病[53-54]，對食品安全和公眾健康存在重大威脅[5,55-56]。食品加工過程中的殺菌、儲存條件為食源性致病菌提供了替代自然環(huán)境的VBNC誘導條件[57-65]，導致食品中致病菌形成大量VBNC細胞[66-67]，食品安全檢測出現(xiàn)假陰性結(jié)果。VBNC表型致病菌使得傳統(tǒng)檢測方法確定微生物活性變得困難，由此帶來的安全風險也不易察覺，這可能是使嬰幼兒奶粉按照生產(chǎn)規(guī)范操作卻仍然無法避免污染發(fā)生的原因。

目前已證實VBNC細菌在嬰幼兒奶粉生產(chǎn)環(huán)境中存在[68]，喪失可培養(yǎng)性的阪崎克羅諾桿菌2.5 年后仍可恢復[69]，表現(xiàn)出復蘇的危害潛力，說明應當警惕嬰幼兒奶粉中阪崎克羅諾桿菌VBNC表型這一未被重視的隱形污染[70]。近年的研究發(fā)現(xiàn)低溫、干燥、熱處理均能使奶粉中部分阪崎克羅諾桿菌形成VBNC細胞[41,64,71-73]，寡營養(yǎng)條件下VBNC表型和生物膜表型的共同存在使得清除阪崎克羅諾桿菌殘留更加困難。一些關于熱處理和巴氏殺菌的研究顯示，食物中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌經(jīng)高溫處理后形成了VBNC細胞[62,74-75]，警示巴氏殺菌這一世界范圍內(nèi)沿用多年的殺菌手段存在一定的局限，應當從新角度全新地評估其殺菌效果，阪崎克羅諾桿菌熱誘導形成VBNC細胞的情況需要引起注意，但目前相關研究存在不同的觀點和許多未知，早期研究認為該菌不足以在巴氏殺菌步驟后存活[76]，但其應用的檢測方法是基于無法檢出VBNC細胞的培養(yǎng)法[77]，需要考慮菌株特異性、培養(yǎng)基回收率、檢測方法的影響，這些因素會使得熱處理研究結(jié)果存在差別[76]，因此還需要進一步深入研究熱處理誘導與VBNC表型形成的聯(lián)系。

近年來細菌VBNC表型的形成、乳及乳制品中常見VBNC致病菌污染逐漸被大家所關注[78]，VBNC表型的阪崎克羅諾桿菌在嬰幼兒奶粉生產(chǎn)過程中的形成情況值得進一步確認，應該進行更多研究和檢測技術開發(fā)去評估VBNC這一微生物隱性安全危害與嬰幼兒奶粉的聯(lián)系。

3 嬰幼兒奶粉中阪崎克羅諾桿菌針對性檢測技術

阪崎克羅諾桿菌對逆境脅迫條件耐受性強，造成微生物殘留風險，同時奶粉中的微生物污染數(shù)量少，分布不均勻[79]，加上對VBNC細胞的檢測盲區(qū)，在抽樣計數(shù)時很容易發(fā)生漏檢，因此檢測嬰幼兒奶粉中痕量、分布不均、VBNC表型的阪崎克羅諾桿菌是保障奶粉產(chǎn)品安全性急需解決的問題。

GB 4789.18—2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳與乳制品檢驗》[80]中規(guī)定乳制品中阪崎克羅諾桿菌的檢驗依據(jù)GB 4789.40—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗》[81]提供的定性和定量檢測方法，檢驗步驟主要包括增菌培養(yǎng)、顯色培養(yǎng)基分離可疑菌落、可疑菌落的生化鑒定，獲得對每100 g（mL）檢樣中是否檢出的定性結(jié)果或最可能數(shù)的定量結(jié)果。行業(yè)標準SN/T 1632.2—2013《出口奶粉中阪崎腸桿菌（克羅諾桿菌屬）檢驗方法 第2部分：PCR方法》與SN/T 1632.3—2013《出口奶粉中阪崎腸桿菌（克羅諾桿菌屬）檢驗方法 第3部分：熒光PCR方法》中對PCR擴增產(chǎn)物進行電泳檢測或收集熒光信號，篩選為陽性的樣品再做確證實驗。由于依賴相關食品安全標準規(guī)定的傳統(tǒng)檢測計數(shù)方法需要經(jīng)過增菌、選擇性培養(yǎng)、標準生化方法，步驟繁瑣，耗時5～7 d，容易發(fā)生錯檢漏檢，靈敏度低，無法獲得準確定量結(jié)果，也無法檢測到VBNC細胞[82]，已不能滿足目前對嬰幼兒奶粉致病菌的快速檢驗檢測需求。為了克服傳統(tǒng)檢測手段的局限，近年來各種高靈敏度和高特異性的快速檢測手段得到發(fā)展，在食品樣品監(jiān)測中具有省時省力的優(yōu)勢。目前應用最多的是分子生物學方法和免疫檢測方法，表2列舉了阪崎克羅諾桿菌檢測技術。

表2 阪崎克羅諾桿菌檢測方法舉例Table 2 Detection methods for Cronobacter sakazakii

基于核酸擴增原理的分子生物學方法克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法耗時長、靈敏度低的局限，且與其他手段聯(lián)用能有效解決VBNC細菌漏檢的問題，是目前乳制品企業(yè)進行出廠檢測時常用的快速檢測方法。分子生物學手段包括普通PCR、多重PCR、LAMP、熒光定量PCR等多種方法。多重PCR可以用于同一致病菌上多個特異基因的檢測，提高了檢測特異性。LAMP可實現(xiàn)65 ℃恒溫條件下的核酸擴增，應用于現(xiàn)場檢測十分有利[95]，被開發(fā)成多種試劑盒商品，同樣基于體外恒溫基因擴增原理的解旋酶恒溫基因擴增方法檢測嬰幼兒奶粉中阪崎克羅諾桿菌，其檢出限可達10 CFU/g[96]。熒光定量PCR技術對PCR擴增產(chǎn)物進行熒光標記，比普通PCR靈敏度更高，特異性更強，且實現(xiàn)了定性到定量的飛躍，美國食品與藥品監(jiān)督管理局已將此納入官方檢測嬰幼兒奶粉中阪崎克羅諾桿菌的方法[97]，同時最近幾年這項技術結(jié)合核酸染料PMA、疊氮溴化乙錠能有效區(qū)分活細胞和死細胞[98]，本研究團隊已成功將PMA-實時熒光定量PCR技術應用于多種致病菌VBNC表型的檢測，包括副溶血性弧菌[99]、大腸桿菌O157:H7[100]及阪崎克羅諾桿菌[88]，不經(jīng)任何前處理即可檢測到1.85 CFU/g副溶血弧菌VBNC，應用于幾種致病菌均獲得不錯的區(qū)分監(jiān)測效果。

分子生物學檢測方法所涉及的操作復雜、設備成本高、氣溶膠污染產(chǎn)生假陽性等問題成為檢測障礙，基于抗原抗體反應的免疫分析方法由于特異性強、不需要復雜步驟引起了微生物檢測領域的極大興趣。ELISA和膠體金免疫層析被開發(fā)成各種檢測試劑盒，是阪崎克羅諾桿菌免疫檢測中運用最多的兩種。制備阪崎克羅諾桿菌抗體并建立ELISA檢測方法已被研究報道過多次[90,101-103]，經(jīng)過短時間富集后表現(xiàn)出較高的靈敏度。膠體金免疫層析技術成本低，適于現(xiàn)場檢測，但靈敏度偏低，目前許多研究致力于將其與信號增強策略相結(jié)合，從而改善檢測靈敏度，因此膠體金免疫層析技術具有巨大開發(fā)潛力[91,93]。針對該菌在奶粉中痕量殘留、基質(zhì)干擾造成的不易回收問題，免疫磁性微球分離技術能有效簡化前處理過程，結(jié)合下游檢測技術后可獲得較好的效果[93-94,104]。同時，免疫分析手段結(jié)合分子生物學技術的檢測方法結(jié)合了兩者優(yōu)勢，逐漸發(fā)展起來，利用膠體金探針對PCR反應產(chǎn)物進行分析，在不經(jīng)預富集的人工污染嬰幼兒奶粉中可檢測到1×103CFU/g的阪崎克羅諾桿菌，結(jié)合免疫磁分離技術時經(jīng)過3 h預富集可檢出低至4.5 CFU/g的阪崎克羅諾桿菌，提高了檢測靈敏度[105]。一種使用重組酶等溫擴增結(jié)合膠體金免疫層析技術定量檢測阪崎克羅諾桿菌的方法中，重組酶等溫擴增與擴增產(chǎn)物免疫層析檢測步驟僅需20 min，靈敏度較高、特異性較好[106]。免疫分析方法檢測時間短、操作簡便、成本低，發(fā)展空間將會越來越大。但靈敏度偏低是免疫檢測方法的最大劣勢所在，且在區(qū)分死活菌、檢測VBNC病原菌方面存在局限，應注重提高檢測靈敏度，同時注意突破死活菌、VBNC菌區(qū)分這一局限。

由于各種檢測方法缺乏通用的評價體系、評價標準和統(tǒng)一的樣品前處理技術，有各自優(yōu)勢和缺點，無法統(tǒng)一評價，應用時應根據(jù)需要有針對性地選擇。在現(xiàn)有檢測技術上不斷優(yōu)化和創(chuàng)新，縮短富集過程的時間、減少人力消耗、增強靈敏度和區(qū)分VBNC菌仍然是研究的目標。

4 結(jié) 語

阪崎克羅諾桿菌對于嬰幼兒奶粉安全具有重要影響，為了減少嬰幼兒奶粉中阪崎克羅諾桿菌污染的發(fā)生，杜絕奶粉市場上阪崎克羅諾桿菌指標不合格現(xiàn)象，需要加強對嬰幼兒奶粉生產(chǎn)過程中的管控，嚴格管理生產(chǎn)環(huán)境潔凈狀況，同時進一步研究耐受表型和VBNC表型在生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的存在造成的持續(xù)污染，從生產(chǎn)源頭進行控制，保障嬰幼兒奶粉生產(chǎn)安全。

各種分子生物學方法和免疫檢測方法快速檢測阪崎克羅諾桿菌在提高靈敏度和區(qū)分VBNC菌方面已取得初步進展，在實際檢測應用中仍然需要提升檢測性能，檢測技術研發(fā)人員需著重開發(fā)能提高微生物回收率、檢測靈敏性的新技術，以期解決目前嬰幼兒奶粉中阪崎克羅諾桿菌數(shù)量少、不易回收、VBNC表型難檢出的難題，從檢測技術性能方面提高對阪崎克羅諾桿菌的污染防控力度。對于阪崎克羅諾桿菌耐受表型和VBNC表型在嬰幼兒奶粉中的污染，在研究相關機制的同時，注重對VBNC狀態(tài)菌的區(qū)分研究力度，防止漏檢。加快研究奶粉中阪崎克羅諾桿菌更靈敏準確、高效全面的檢測技術和方法，是增強嬰幼兒奶粉生產(chǎn)過程中微生物安全控制需要致力解決的方向。