白 娟，張金富，張佩熙，何林釗，武蓓琪，祝 瑩，李 潔，肖 香

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

衰老是機(jī)體的一種退化，主要表現(xiàn)為機(jī)體代謝功能與免疫調(diào)節(jié)能力的下降[1]。近年來(lái)，衰老相關(guān)疾病如代謝性和神經(jīng)退行性等年齡相關(guān)退行性疾病，對(duì)中老年人的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重不良影響，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。合理的抗衰老措施可預(yù)防或延緩某些老年病，延長(zhǎng)壽命。目前關(guān)于衰老機(jī)制的研究提出了多種學(xué)說(shuō)，包括自由基氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)、細(xì)胞凋亡學(xué)說(shuō)、端粒學(xué)說(shuō)、線(xiàn)粒體DNA損傷學(xué)說(shuō)等[3]。機(jī)制之間相互作用，特別是在代謝水平[4]，但控制這些相互作用的機(jī)制在很大程度上仍不清楚。眾多研究證據(jù)表明，脂質(zhì)代謝的變化是健康衰老的顯著特征[5]。在延緩衰老延長(zhǎng)壽命的措施中，干預(yù)脂代謝是減緩衰老的關(guān)鍵組成部分。研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)信號(hào)與衰老的相關(guān)性是一個(gè)未被充分探索的領(lǐng)域，具有促進(jìn)健康和延長(zhǎng)壽命的巨大可能性。

秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans）（簡(jiǎn)稱(chēng)線(xiàn)蟲(chóng)），是研究衰老的經(jīng)典模式生物，其具有繁殖快、生命周期短、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、基因組完整、發(fā)育定型和成本低廉等眾多優(yōu)勢(shì)。線(xiàn)蟲(chóng)在進(jìn)化上與哺乳動(dòng)物高度保守，60%～80%以上的基因與人類(lèi)疾病相關(guān)基因同源[6]。近年來(lái)，通過(guò)脂質(zhì)信號(hào)分子干預(yù)線(xiàn)蟲(chóng)壽命，成為研究延緩衰老的熱點(diǎn)。aak-2基因是線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)能量調(diào)控器之一，參與脂肪水解、脂肪酸氧化、多不飽和脂肪酸合成等生理過(guò)程[7]。研究表明，與野生型線(xiàn)蟲(chóng)相比，aak-2基因缺陷的線(xiàn)蟲(chóng)壽命較短[8]。胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin like growth factor，IGF）-1信號(hào)（insulin/IGF-1 signaling，IIS）通路是無(wú)脊椎動(dòng)物到哺乳動(dòng)物體內(nèi)公認(rèn)的調(diào)控壽命與脂代謝的重要途徑。其中，daf-2和age-1分別編碼線(xiàn)蟲(chóng)唯一的胰島素/IGF-1受體和磷脂酰肌醇-3-OH激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K），這是IIS通路的兩個(gè)關(guān)鍵上游因子[9]。daf-2的下游核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子daf-16是哺乳動(dòng)物FOXO的同源基因，可調(diào)控脂肪沉積與衰老：daf-16的過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)脂質(zhì)合成，誘導(dǎo)脂肪積累，引起線(xiàn)蟲(chóng)的高脂表型；而daf-16缺陷型線(xiàn)蟲(chóng)更易衰老，壽命短于野生型[10]。由此可知，線(xiàn)蟲(chóng)脂質(zhì)代謝與壽命之間存在密切關(guān)聯(lián)。

苦瓜（Momordica charantiaL.）是一種公認(rèn)的藥食同源食品，富含活性多糖、多肽、皂苷、類(lèi)黃酮等活性成分，常被用來(lái)減肥降脂和輔助治療糖尿病。皂苷作為苦瓜苦味成分主要來(lái)源，種類(lèi)繁多，主要為三萜化合物（如苦瓜皂苷（bitter melon saponin，BMS）A、C、F1、I、K等）和類(lèi)固醇類(lèi)（如β-谷甾醇-β-D-葡萄糖苷、5,25-豆甾二烯醇-3-葡萄糖苷等）[11]。眾多研究發(fā)現(xiàn)，BMS具有公認(rèn)的類(lèi)似胰島素降血糖的特性[12]，其調(diào)控機(jī)制主要包括激活一磷酸腺苷激活蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）和胰島素受體-1（insulin receptor-1，IRS-1），促進(jìn)下游葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子（glucose transporter 4，GLUT4）的轉(zhuǎn)運(yùn)，升高胞內(nèi)糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular-regulated kinase 1/2，ERK1/2）以及蛋白激酶（protein kinase，PK）Cζ/λ的含量等[12-13]。此外，苦瓜三萜皂苷還可通過(guò)下調(diào)3T3-L1前脂肪細(xì)胞過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated recep-tor，PPARγ）的表達(dá)，從而降低脂肪累積有效抑制前脂肪細(xì)胞分化并降低動(dòng)物體內(nèi)血脂水平，表現(xiàn)出明顯的降脂功效[14]。因此，基于脂代謝與健康衰老緊密相關(guān)的理論基礎(chǔ)，BMS的降脂作用是否對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)自然壽命產(chǎn)生影響，有待進(jìn)一步探索。

綜上，本實(shí)驗(yàn)以線(xiàn)蟲(chóng)為模型，研究BMS對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)能力、脂肪沉積以及壽命的影響，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)脂代謝相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，并利用脂代謝相關(guān)基因缺失的線(xiàn)蟲(chóng)突變株，經(jīng)壽命評(píng)估，建立BMS調(diào)控線(xiàn)蟲(chóng)壽命與脂代謝的相關(guān)性，為脂質(zhì)代謝與壽命之間的飲食調(diào)節(jié)機(jī)制提供理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料與試劑

N2線(xiàn)蟲(chóng)和大腸桿菌OP50 東南大學(xué)王大勇老師課題組饋贈(zèng)；aak-2(ok524)X、daf-16(mu86)、nhr-49(nr2041)、fat-5(tm420)V、fat-6(tm331)IV、fat-7(wa36)V、fat6(tm331)IV、fat-5(tm420)V、fat-7(wa36)、fat5(tm420)V、fat-6(tm331)IV、fat-7(wa36)V、atgl-1(tm3116)/hT2線(xiàn)蟲(chóng)突變體 美國(guó)普渡大學(xué)Keehong Kim實(shí)驗(yàn)室；苦瓜粉（粉體粒度≤105 μm）由江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室和鎮(zhèn)江市愛(ài)邦電子科技有限公司制備。

油紅O染色、甘油三酯（triglyceride，TG）和Bradford蛋白檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所；TaKaRa MiniBEST通用RNA提取試劑盒、Takara PrimeScript RT Master Mix試劑盒、SYBR?Premix ExTaqTM試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；2-脫氧-5-氟尿嘧啶核苷（floxuridine，F(xiàn)UDR） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其余生化試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JSZ6體式顯微鏡 江南永新光學(xué)儀器有限公司；Ci-L正置顯微鏡 日本Nikon公司；LRH-150生化培養(yǎng)箱上海一恒有限公司；FD-8真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康有限公司；TG18G離心機(jī) 金壇市醫(yī)療儀器廠(chǎng)；YM50滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-1D超凈臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；多功能酶標(biāo)儀M200Pro上海天能科技有限公司；THZ-82B搖床 金壇市醫(yī)療儀器廠(chǎng)；HPBM-1行星式球磨機(jī) 長(zhǎng)沙米淇?jī)x器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 苦瓜皂苷的制備和含量測(cè)定

稱(chēng)取苦瓜凍干粉100 g，按料液比1∶2（m/V）加入石油醚浸提12 h脫脂，倒去石油醚后再次按上述條件加入石油醚浸提12 h脫脂，倒去石油醚，待石油醚揮干后，加入1 L體積分?jǐn)?shù)75%乙醇80 ℃回流提取兩次，收集濾液，用等體積的水飽和的正丁醇萃取3次，取正丁醇相50 ℃濃縮至呈褐色黏稠狀時(shí)冷卻，用100 mL無(wú)水甲醇溶解后加入100 mL丙酮充分?jǐn)嚢枋怪a(chǎn)生沉淀，8 000 r/min離心15 min，所得沉淀用100 mL無(wú)水甲醇溶解后加入100 mL丙酮充分?jǐn)嚢枋怪a(chǎn)生沉淀，8 000 r/min離心15 min，冷凍干燥得到BMS粗提物。

BMS中皂苷含量的測(cè)定：精確稱(chēng)取干燥至恒質(zhì)量的人參皂苷Rg1 5 mg，加甲醇定容至5 mL，搖勻，即得1 mg/mL的人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 mL于具塞試管中，60 ℃水浴揮去溶劑，加入新制的50 g/L香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，搖勻，在60 ℃水浴中加熱15 min，流水冷卻后，加入5 mL冰乙酸，搖勻，放置20 min，測(cè)定550 nm波長(zhǎng)處吸光度，以等體積甲醇作為空白對(duì)照。以人參皂苷Rg1質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。將BMS用甲醇溶解成1 mg/mL溶液按同樣方法測(cè)定吸光度，計(jì)算出BMS中皂苷的含量。

提取率測(cè)定：根據(jù)上述計(jì)算出BMS中皂苷的含量，占100 g苦瓜粉的比例，即為BMS的提取率（10.33%）。

1.3.2 線(xiàn)蟲(chóng)培養(yǎng)與BMS處理

M9緩沖液配制：分別稱(chēng)取磷酸二氫鉀3 g、磷酸氫二鈉6 g、氯化鈉5 g，移液槍吸取1 mol/L MgSO4溶液1 mL至燒杯中，加去離子水定容至1 L，高壓滅菌（121 ℃、20 min，后同）后分裝使用。S-basal溶液配制：分別稱(chēng)取氯化鈉5.85 g、磷酸氫二鉀1 g、磷酸二氫鉀6 g，加去離子水溶解，定容至1 L，高壓滅菌冷卻后加入1 mL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的膽固醇溶液（用乙醇溶解）。S-complete溶液配制：分別取1L S-basal溶液、10 mL 1 mol/L檸檬酸鉀（pH 6）、10 mL微量金屬溶液、3 mL 1 mol/L氯化鈣、3 mL 1 mol/L硫酸鎂混勻。線(xiàn)蟲(chóng)培養(yǎng)基的配制：分別稱(chēng)取氯化鈉3 g 、蛋白胨2.5 g、瓊脂17 g，加去離子水定容至1 L，高壓滅菌，冷卻至60 ℃后加入1 mL 1 mol/L氯化鈣、1 mL 1 mol/L硫酸鎂、75 mL 1 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH 6.0），最后加入1 mL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的膽固醇溶液（用乙醇溶解），以上混勻后倒平板。

線(xiàn)蟲(chóng)用涂有大腸桿菌OP50的線(xiàn)蟲(chóng)培養(yǎng)基在20 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

線(xiàn)蟲(chóng)同步化處理：用2 mL M9緩沖液將處于產(chǎn)卵期的線(xiàn)蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至EP管中，離心（4 000 r/min、3 min，后同）棄去上清液，再加入2 mL M9緩沖液按上述方法清洗兩次。洗凈之后的線(xiàn)蟲(chóng)1 mL加入裂解液（0.5 mol/L NaOH溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5% NaClO），漩渦振蕩。線(xiàn)蟲(chóng)裂解充分后，離心棄上清液，用2 mL M9緩沖液清洗，清洗3次后將蟲(chóng)卵轉(zhuǎn)移至20 ℃培養(yǎng)箱中孵育12 h得L1期幼蟲(chóng)，備用。

BMS處理：根據(jù)BMS中皂苷含量，用少量甲醇復(fù)溶BMS凍干物，利用S-complete溶液配制皂苷質(zhì)量濃度為10 mg/mL的母液，與大腸桿菌菌液混勻至終質(zhì)量濃度為0（對(duì)照組）和50、100、200 μg/mL，涂布于L1期幼蟲(chóng)線(xiàn)蟲(chóng)培養(yǎng)基上供線(xiàn)蟲(chóng)食用，在20 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.3.3 油紅O染色

2 mL M9緩沖液收集BMS處理48 h后的線(xiàn)蟲(chóng)（約1 000 條），4 000 r/min離心3 min棄去上清液，再加入2 mL M9緩沖液清洗3次。加入500 μL 體積分?jǐn)?shù)60%異丙醇脫水固定，4 000 r/min 離心3 min，棄上清液；接著加入500 μL油紅O染色液，室溫避光振蕩6～18 h，4 000 r/min離心3 min，然后加入2 mL M9緩沖液清洗3次。最后加入250 μL 0.01%（體積分?jǐn)?shù)）Triton-X100-M9緩沖液，立即在正置顯微鏡下拍照。

1.3.4 甘油三酯相對(duì)含量測(cè)定

BMS處理48 h后，用M9緩沖液洗線(xiàn)蟲(chóng)3次，自然沉降，棄上清液。加入一定量M9緩沖液重懸，超聲破碎蟲(chóng)體，5 000 r/min離心10 min，取上清液根據(jù)TG試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定TG含量，蛋白質(zhì)含量根據(jù)Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定。每組3個(gè)平行。各組TG含量與對(duì)照組的比值×100%即為T(mén)G相對(duì)含量。

1.3.5 線(xiàn)蟲(chóng)基礎(chǔ)生理指標(biāo)的測(cè)定

體長(zhǎng)和體寬測(cè)定：BMS處理48 h后，隨機(jī)挑取30 條左右線(xiàn)蟲(chóng)于500 μL M9緩沖液中，加入適量0.5 mol/L疊氮化鈉，待線(xiàn)蟲(chóng)身體僵直后，蓋上蓋玻片。正置顯微鏡拍照，利用ImageJ軟件測(cè)定線(xiàn)蟲(chóng)體長(zhǎng)、體寬。

運(yùn)動(dòng)指標(biāo)的測(cè)定：BMS處理48 h后，隨機(jī)挑取30 條左右線(xiàn)蟲(chóng)于500 μL M9緩沖液中，測(cè)定頭部擺動(dòng)頻率和身體彎曲頻率。頭部擺動(dòng)頻率：記錄1 min內(nèi)線(xiàn)蟲(chóng)頭部擺動(dòng)次數(shù)，挑取30 條左右線(xiàn)蟲(chóng)于500 μL M9緩沖液中，滴于載玻片，于顯微鏡下計(jì)數(shù)（1個(gè)往返為擺動(dòng)一次）；身體彎曲頻率：記錄1 min內(nèi)線(xiàn)蟲(chóng)身體彎曲次數(shù)，假設(shè)以咽泵的方向規(guī)定為y軸，在爬行過(guò)程中，線(xiàn)蟲(chóng)身體沿著x軸方向完成1次正弦運(yùn)動(dòng)即為1次身體彎曲。每組30 條線(xiàn)蟲(chóng)。

1.3.6 壽命評(píng)估

同步化L1幼蟲(chóng)在線(xiàn)蟲(chóng)培養(yǎng)基上經(jīng)BMS處理48 h后，2 mL M9緩沖液洗3 遍，轉(zhuǎn)至S-complete緩沖液在Transwell培養(yǎng)板上中培養(yǎng)。加入終濃度120 μmol/L的FUDR以防線(xiàn)蟲(chóng)產(chǎn)卵。每組約100 條線(xiàn)蟲(chóng)，每隔2 d換新鮮培養(yǎng)液（含一定質(zhì)量濃度BMS和120 μmol/L的FUDR的S-complete緩沖液），每隔1 d記錄線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)量，線(xiàn)蟲(chóng)存活數(shù)量與初始線(xiàn)蟲(chóng)總數(shù)的比值×100%即為線(xiàn)蟲(chóng)存活率。采用OASIS（https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/surv/）在線(xiàn)分析程序?qū)勖€(xiàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到線(xiàn)蟲(chóng)的最長(zhǎng)壽命，P值采用log-rank（Mantel-Cox法）確定。

1.3.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用TaKaRa MiniBEST通用RNA提取試劑盒提取線(xiàn)蟲(chóng)總RNA（每組約2 000 條）。利用Takara PrimeScript RT Master Mix試劑盒反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，根據(jù)SYBR?Premix ExTaqTM試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR操作，按照2－ΔΔCT方法處理數(shù)據(jù)，以act-1基因作為內(nèi)參。引物由上海生工生物工程股份有限公司按標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)并合成，引物序列如表1所示。

表1 線(xiàn)蟲(chóng)脂代謝相關(guān)基因的引物序列Table 1 Primer sequences used for amplification of genes involved in lipid metabolism in C. elegans

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用DPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析進(jìn)行顯著性分析；用t檢驗(yàn)比較組間差異，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 BMS對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)脂肪沉積的抑制作用

為了確證本研究中BMS在線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)抑制脂肪沉積的作用，首先通過(guò)油紅O和TG試劑盒檢測(cè)BMS對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)整體脂肪含量的影響。如圖1所示，與對(duì)照組相比，除50 μg/mL BMS處理外，100、200 μg/mL BMS處理均能明顯降低線(xiàn)蟲(chóng)整體脂肪含量，使TG相對(duì)含量分別顯著降低28.60%和33.02%（P＜0.05）。體內(nèi)外研究已指出，BMS具有明顯的降脂效果，如有效抑制前脂肪細(xì)胞分化、降低動(dòng)物體內(nèi)血脂水平[14-15]。其機(jī)制可能通過(guò)下調(diào)PPARγ的表達(dá)抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化，降低脂肪酸脫飽和酶基因fat-5、fat-6、fat-7表達(dá)水平，抑制線(xiàn)蟲(chóng)脂肪合成[16]。

圖1 不同質(zhì)量濃度BMS對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)TG相對(duì)含量的影響Fig. 1 Effect of BMS at different concentrations on the relative content of TG in C. elegans

2.2 BMS對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)體長(zhǎng)、體寬和運(yùn)動(dòng)能力的影響

在確證100、200 μg/mL BMS對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)脂肪沉積的抑制作用后，需進(jìn)一步評(píng)估該質(zhì)量濃度作用下是否對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)體長(zhǎng)、體寬和運(yùn)動(dòng)能力等基礎(chǔ)生理指標(biāo)有不利影響。由表2可知，BMS對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)頭部擺動(dòng)頻率和身體彎曲頻率無(wú)明顯的改變，表明100、200 μg/mL BMS不影響線(xiàn)蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)能力（P＞0.05）。研究表明，運(yùn)動(dòng)能力一定程度上反映能量消耗[17]。并且，BMS對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的體長(zhǎng)體寬基礎(chǔ)生理指標(biāo)也無(wú)顯著影響（P＞0.05），說(shuō)明BMS對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的生長(zhǎng)無(wú)抑制作用。由此可推斷，BMS緩解線(xiàn)蟲(chóng)的脂肪累積并非通過(guò)抑制線(xiàn)蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)線(xiàn)蟲(chóng)脂肪合成或脂肪酸氧化途徑密切相關(guān)[18]。

表2 BMS提取物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)基礎(chǔ)生理指標(biāo)的影響Table 2 Effect of BMS on basic physiological activities of C. elegans

2.3 BMS對(duì)野生型線(xiàn)蟲(chóng)自然壽命的影響

為測(cè)定BMS對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)自然衰老的作用，本實(shí)驗(yàn)采用液體培養(yǎng)法對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)壽命進(jìn)行評(píng)估。由圖2和表3可知，與對(duì)照組（平均壽命為（21.14±0.35）d）相比，100、200 μg/mL BMS處理后的線(xiàn)蟲(chóng)平均壽命分別為（23.39±0.33）d和（23.16±0.33）d，均能高度顯著延長(zhǎng)野生型線(xiàn)蟲(chóng)的壽命（P＜0.000 1），延緩其衰老。基于100 μg/mL和200 μg/mL BMS均有降脂和延長(zhǎng)壽命的作用，因此，選取100 μg/mL BMS用于后期突變體的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。已有大量研究發(fā)現(xiàn)，食品功能成分如白皮杉醇依賴(lài)IIS通路中核轉(zhuǎn)錄因子daf-16延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)壽命[19]；菊苣酸通過(guò)抗氧化因子skn-1介導(dǎo)的分子途徑延緩線(xiàn)蟲(chóng)的衰老[20]；三七多糖和齊墩果酸均可通過(guò)降低活性氧氧化應(yīng)激延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)平均壽命[21-22]。并且，最新研究報(bào)道表明，BMS可通過(guò)上調(diào)線(xiàn)蟲(chóng)skn-1及其下游抗氧化基因（sod-3、sod-5、clt-1和clt-2）的表達(dá)，提高線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)抗氧化活性，從而延長(zhǎng)氧化應(yīng)激下的壽命[23]。根據(jù)以上研究可知，現(xiàn)有的關(guān)于食品功能因子延壽抗衰老的機(jī)制研究主要集中在線(xiàn)蟲(chóng)經(jīng)典的IIS通路或抗氧化角度。然而，由于脂質(zhì)代謝與壽命密切相關(guān)，BMS是否可通過(guò)抑制脂質(zhì)沉積延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)自然條件下的壽命，仍需進(jìn)一步深入研究。

圖2 不同質(zhì)量濃度BMS對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)壽命的影響Fig. 2 Effect of BMS at different concentrations on the lifespan of C. elegans

表3 BMS對(duì)野生型和突變型線(xiàn)蟲(chóng)平均壽命的影響Table 3 Influence of BMS on survival rates of wild-type and mutant C. elegans

2.4 BMS延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)自然壽命對(duì)IIS通路的依賴(lài)性

線(xiàn)蟲(chóng)脂質(zhì)代謝涉及的通路主要包括IIS通路和脂肪酸氧化、脂肪酸合成、脂肪分解通路等。本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分別對(duì)上述通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定，篩選出BMS調(diào)控脂代謝的關(guān)鍵基因，為研究BMS延長(zhǎng)壽命的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。IIS通路參與調(diào)控線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)能量穩(wěn)態(tài)，其中daf-2是IIS通路中的上游分子，daf-2的激活誘導(dǎo)age-1的表達(dá)，繼而阻止daf-16的核易位，導(dǎo)致daf-16的磷酸化和失活[24]。如圖3所示，BMS對(duì)daf-2和daf-16基因表達(dá)均無(wú)顯著改變（P＞0.05），表明在轉(zhuǎn)錄水平BMS對(duì)IIS通路中關(guān)鍵因子daf-2和daf-16無(wú)明顯作用。

圖3 BMS對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)脂代謝調(diào)控基因表達(dá)的影響Fig. 3 Effect of BMS on expression levels of genes involved in lipid metabolism in C. elegans

由于分子調(diào)控過(guò)程包括轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后以及翻譯水平的調(diào)控，因此本實(shí)驗(yàn)利用daf-16基因缺陷型線(xiàn)蟲(chóng)突變體，驗(yàn)證BMS延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)自然壽命對(duì)IIS通路的依賴(lài)性。由圖4A和表3可知，在daf-16突變體中，BMS并不能明顯延長(zhǎng)突變體自然壽命，反而縮短了突變體的平均壽命（P＜0.000 1）。結(jié)合daf-2和daf-16基因的mRNA表達(dá)水平結(jié)果可得，BMS延長(zhǎng)野生型線(xiàn)蟲(chóng)的自然壽命不依賴(lài)于daf-16介導(dǎo)的胰島素信號(hào)通路。Peng Ye等也發(fā)現(xiàn)，菊苣酸具有延長(zhǎng)野生型線(xiàn)蟲(chóng)壽命的功能，而在攝食量相關(guān)基因eat-2突變體中卻表現(xiàn)出縮短線(xiàn)蟲(chóng)壽命，表明菊苣酸延長(zhǎng)壽命的作用不通過(guò)調(diào)節(jié)飲食的攝入量[20]。

2.5 BMS延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)自然壽命對(duì)脂肪酸氧化通路的依賴(lài)性

在線(xiàn)蟲(chóng)中，AMPK的亞基由aak-1和aak-2編碼，是細(xì)胞中的能量感受器，維持體內(nèi)能量平衡。研究指出，AMP與ATP比例的增加可激活線(xiàn)蟲(chóng)內(nèi)一磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMP-activated kinase-2，AAK-2），使得脂質(zhì)代謝中關(guān)鍵酶磷酸化，從而促進(jìn)脂肪分解代謝（脂解和脂肪酸氧化）或抑制脂肪酸、TG或膽固醇的合成代謝[25]。aak-2的下游基因主要參與脂肪酸氧化、脂肪合成與分解生理過(guò)程。從脂肪酸氧化角度，BMS略微增加aak-2和降低核轉(zhuǎn)錄因子nhr-49的基因表達(dá)量（圖3，P＞0.05），且對(duì)下游基因肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶cpt1/cpt2、乙酰CoA合成酶acs-2的表達(dá)均無(wú)顯著改變，初步表明BMS可能對(duì)脂肪酸氧化通路無(wú)調(diào)控作用，但其確切的調(diào)控作用仍需在蛋白水平進(jìn)一步明確。并且，在aak-2和nhr-49基因缺陷型突變體中，依然維持延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)壽命的特性（圖4B、C和表3，P＜0.000 1）。結(jié)合兩部分結(jié)果顯示，BMS延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)壽命與脂肪酸氧化通路無(wú)相關(guān)性。

BMS具有公認(rèn)的類(lèi)似胰島素降血糖的特性。Han等發(fā)現(xiàn)BMS組分可降低糖尿病小鼠血糖，其機(jī)制可能與BMS組分中三萜類(lèi)化合物激活脂肪細(xì)胞AMPK通路，從而促進(jìn)葡萄糖吸收有關(guān)[12]。且其他相關(guān)研究也指出，BMS是潛在的AMPK激動(dòng)劑[26]。然而，本研究結(jié)果顯示，BMS對(duì)aak-2/AMPK的mRNA表達(dá)無(wú)影響?？紤]到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用，BMS可能對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)AAK-2蛋白的表達(dá)有影響，而本實(shí)驗(yàn)未涉及到BMS降脂機(jī)制的深入研究。且圍繞本實(shí)驗(yàn)的主題，aak-2基因的缺失確實(shí)不改變BMS延長(zhǎng)壽命的功效，由此確證aak-2在BMS延壽過(guò)程中無(wú)調(diào)控作用。與Lin Chunxiu等的研究結(jié)果類(lèi)似，BMS也對(duì)nhr-49下游乙酰CoA合成酶acs-2的表達(dá)無(wú)顯著改變，顯示BMS可能不通過(guò)脂肪酸氧化途徑調(diào)節(jié)脂代謝[16]。

2.6 BMS延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)自然壽命對(duì)脂肪酸合成通路的依賴(lài)性

線(xiàn)蟲(chóng)主要從其食物——大腸桿菌中外源性獲取脂肪酸，或者通過(guò)乙酰CoA內(nèi)源性從頭合成脂肪酸，即乙酰CoA在各級(jí)脂肪酸合成酶催化下逐步轉(zhuǎn)化為磷脂酸、二酰基甘油，最終轉(zhuǎn)化為T(mén)G[27]。線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)脂肪合成的關(guān)鍵步驟是單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acids，MUFAs）的合成，其中Δ9脂肪酸脫飽和酶（fatty acid desaturase，F(xiàn)AT）中的FAT-5、FAT-6和FAT-7發(fā)揮極為重要的作用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示（圖3），BMS顯著下調(diào)脂肪酸合成途徑中fat-5、fat-6和fat-7，以及調(diào)控Δ9脂肪酸脫飽和酶的核轉(zhuǎn)錄因子nhr-80的基因表達(dá)水平，提示BMS降脂的機(jī)制與抑制脂肪合成途徑密切相關(guān)。同樣，sbp-1與mdt-15也是fat-5、fat-6和fat-7的上游調(diào)控因子，但BMS對(duì)sbp-1與mdt-15的表達(dá)無(wú)顯著影響?；诖?，本實(shí)驗(yàn)著重采用編碼Δ9脂肪酸去飽和酶的基因缺陷型線(xiàn)蟲(chóng)，包括單突變體與多突變體，探究BMS延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)自然壽命是否依賴(lài)性于Δ9脂肪酸去飽和酶介導(dǎo)的脂肪酸合成途徑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在單基因缺陷型fat-5、fat-6和fat-7突變體，以及其雙突變體中，除fat5/fat6和fat5/fat7雙突變體外，BMS不能顯著延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)自然壽命（圖4D～I(xiàn)和表3，P＞0.05），表明編碼Δ9脂肪酸去飽和酶的基因是BMS延壽作用中的必要基因。

FAT-5去飽和酶特異性作用于棕櫚酸（C16:0），而FAT-6和FAT-7主要使得飽和硬脂酸（C18:0）脫飽和，從而合成MUFAs。fat-5、fat-6或fat-7基因表達(dá)水平與TG水平呈正相關(guān)[28]。研究表明，參與脂肪酸去飽和過(guò)程的基因包括一些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子上調(diào)，如sbp-1（哺乳動(dòng)物中SREBP-1的同源基因）、daf-16（IIS通路中daf-2的下游轉(zhuǎn)錄因子）、nhr-49和nhr-80（核激素受體基因）以及與nhr-49或sbp-1相結(jié)合的亞基mdt-15[29-30]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在這些轉(zhuǎn)錄因子中，BMS僅對(duì)核激素受體nhr-80顯著下調(diào)，提示nhr-80在BMS調(diào)控脂肪酸合成中起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，nhr-80基因缺陷型突變體會(huì)顯著降低fat-5和fat-7的表達(dá)，并伴隨脂肪酸組成的變化，如18∶0與18∶1Δ9的比例。近期有研究報(bào)道稱(chēng)，線(xiàn)蟲(chóng)可通過(guò)fat-7提高不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acids，UFAs）與飽和脂肪酸（saturated fatty acids，SFAs）的比例，增強(qiáng)線(xiàn)蟲(chóng)在寒冷刺激下的耐受力，延長(zhǎng)壽命。由此表明，Δ9脂肪酸脫飽和酶在維持線(xiàn)蟲(chóng)UFAs與SFAs的平衡中發(fā)揮重要作用，并對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)壽命具有調(diào)控作用。因此在本研究中，BMS很大程度依賴(lài)Δ9脂肪酸去飽和酶介導(dǎo)的脂肪酸合成途徑，延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)的自然壽命。其中，結(jié)合雙突變體壽命的驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，僅fat-6/fat-7雙突變體在BMS的處理下壽命未延長(zhǎng)，表明相比于fat-5，fat-6和fat-7在BMS延壽功效中的作用更加明顯，但其確切的作用機(jī)制可進(jìn)一步通過(guò)脂質(zhì)組學(xué)分析各類(lèi)不飽和脂肪酸水平來(lái)驗(yàn)證。

2.7 BMS延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)壽命對(duì)脂肪分解通路的依賴(lài)性

脂質(zhì)代謝過(guò)程主要包括脂肪的合成與分解。脂肪水解在提供能量方面起重要作用，涉及到復(fù)雜的信號(hào)級(jí)聯(lián)和連續(xù)酶激活反應(yīng)。線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)，脂肪甘油三酯脂肪酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）-1是脂肪水解過(guò)程中的關(guān)鍵脂肪酶。此外，激素敏感脂肪酶（hormonesensitive lipase homolog，HOSL）-1是多功能脂肪酶，能夠水解多種?；ィ═G、二?；视秃蛦熙；视蚚31]。線(xiàn)蟲(chóng)的脂肪水解過(guò)程中，ATGL-1和HOSL-1可水解90%以上的TG，且以ATGL-1為主。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，BMS對(duì)兩種脂肪酶的mRNA水平均無(wú)明顯的改變。并且，在atgl-1突變體內(nèi)，BMS的延壽作用依然存在，表明ATGL-1的缺失對(duì)BMS延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)壽命作用無(wú)影響。間接說(shuō)明BMS延壽作用很大程度不依賴(lài)于ATGL-1介導(dǎo)的脂肪水解過(guò)程。

研究顯示，ATGL-1也被鑒定為應(yīng)對(duì)禁食的關(guān)鍵脂肪酶。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，酯酰輔酶A∶膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1（acetyl-CoA acetyltransferase 1，ACAT1）抑制劑Avasimibe，可通過(guò)ATGL-1促進(jìn)線(xiàn)蟲(chóng)在禁食條件下的脂肪水解提供能量，從而延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)在禁食刺激下的壽命[6]。本研究表明，BMS延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)自然壽命的作用與脂肪水解過(guò)程無(wú)相關(guān)性，可能缺失間歇或長(zhǎng)期禁食的刺激。

3 結(jié) 論

本研究表明BMS在不影響線(xiàn)蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育前提下，具有緩解線(xiàn)蟲(chóng)脂肪沉積，并延長(zhǎng)自然壽命的功效?；谥|(zhì)代謝與壽命間的緊密聯(lián)系，本研究發(fā)現(xiàn)BMS的延壽作用很大程度上依賴(lài)于Δ9脂肪酸去飽和酶介導(dǎo)的脂肪酸合成途徑，繼而從脂代謝角度闡明了BMS延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)自然壽命的分子機(jī)制。本研究結(jié)果可為BMS功能因子的研究和開(kāi)發(fā)提供可靠的理論依據(jù)，但壽命調(diào)控機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，仍有待繼續(xù)深入探究。