章麗娜，李夢潔，商迎輝，劉蕓如，黃漢昌，勞鳳學(xué)

（北京市生物活性物質(zhì)和功能食品重點實驗室，北京聯(lián)合大學(xué)功能因子與腦科學(xué)研究院，北京 100191）

阿爾茨海默癥（Alzheimer disease，AD）又稱原發(fā)性老年癡呆，是最常見的具有復(fù)雜病理生物學(xué)特性的癡呆癥，伴隨著至少大腦兩個區(qū)域的思維和記憶功能損傷[1-2]。AD患者的神經(jīng)心理特征包括記憶力以及其他認知領(lǐng)域（語言）的減退[3]，其特征性病理表現(xiàn)為老年斑、Tau蛋白磷酸化形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFT）以及神經(jīng)元細胞發(fā)生丟失等[4]。AD引起的癡呆與整個疾病過程中進行性疾病發(fā)作有關(guān)，在癥狀發(fā)作的5～12 年內(nèi)通常不可避免地導(dǎo)致死亡的發(fā)生[5]。因此，開發(fā)預(yù)防或減慢疾病進展速度的疾病改良療法變得十分迫切，中晚期臨床試驗的不斷失敗阻礙著AD藥物開發(fā)的進程[6]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是AD早期階段的重要病理表現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白發(fā)生積累會觸發(fā)一種稱為未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）的細胞應(yīng)激反應(yīng)，在AD患者中其激活量會增加[7]。在哺乳動物體內(nèi)，UPR細胞有3種感受器可以感應(yīng)出ERS的激活，分別是抑制物阻抗性酯酶1α（inositol-requiring enzyme-1α，IRE1α）、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）、活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）[8]。

在體外實驗中，衣霉素（tunicamycin，TM）已廣泛應(yīng)用于ERS模型[9]，其可誘導(dǎo)細胞凋亡[10]、細胞周期變化[11]、細胞自噬[12]。從酵母到哺乳動物，細胞自噬是通過促進衰老和細胞毒性成分的降解和循環(huán)來維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要機制，在自噬期間，目標(biāo)物被捕獲至雙膜囊泡，形成自噬小體，并通過溶酶體融合降解[13]。TM可以誘導(dǎo)SH-SY5Y產(chǎn)生細胞毒性，上調(diào)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）、促凋亡蛋白C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）和磷酸化的真核生物起始因子2α（phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2α，p-eIF2α）等ERS標(biāo)記物蛋白水平[14]。ERS誘導(dǎo)劑TM可以誘導(dǎo)黑色素瘤細胞細胞周期發(fā)生G1期阻滯[11]。TM可以誘導(dǎo)自噬，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白質(zhì)的積累是ERS條件下自噬的觸發(fā)因素[12]。此外，TM誘導(dǎo)ERS而引起的自噬能緩解短暫性腦缺血損傷[15]。綜上，細胞自噬、周期、凋亡與ERS之間存在聯(lián)系，且在機體中存在協(xié)調(diào)細胞穩(wěn)態(tài)的作用。

有研究表明，維甲酸和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brainderived neurotrophic factor，BDNF）分化的神經(jīng)母細胞瘤細胞（SH-SY5Y）用以亞致死劑量岡田酸和β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）的可溶性寡聚體聯(lián)合刺激，在不引起細胞活力顯著下降的情況下，可有效提供一種模擬AD作用下膽堿能神經(jīng)元早期病理生理的體外模型[16]。Aβ42處理SH-SY5Y細胞后可導(dǎo)致細胞活力下降、形態(tài)學(xué)改變，從而增加活性氧水平，該研究證明SH-SY5Y細胞可以作為研究阿爾茨海默病病理的模型[17]。因此，本實驗采用SH-SY5Y細胞進行ERS AD模型的構(gòu)建，以期為后期AD病理的研究提供數(shù)據(jù)支撐。

玉米黃素（zeaxanthin，Zea）是一種類胡蘿卜素，在自然界中分布廣泛，多存在于玉米種子、萬壽菊和綠色蔬菜等植物組織以及一些藍藻、光致性細菌的光合膜中[18]，其在部分食品中玉米黃素的含量如表1所示。玉米黃素的分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示，其在自然界中絕大多數(shù)以(3R,3’R)-玉米黃素存在，(3R,3’S)-玉米黃素為內(nèi)消旋玉米黃素，(3S,3’S)-玉米黃素型則占少量。玉米黃素在每個β-紫羅蘭酮環(huán)上具有一個羥基。這些羥基之一與Aβ的兩個氨基酸（纈氨酸39和異亮氨酸41）相互作用，另一個β-紫羅蘭酮環(huán)上的羥基與Aβ的甘氨酸25相互作用，而玉米黃素與Aβ的氨基酸作用都不存在于Aβ位點，因而很可能導(dǎo)致β原纖維的崩解[19]。玉米黃素的生物活性成分在大腦疾?。ㄌ貏e是AD領(lǐng)域）中研究較少，但玉米黃素可以通過血腦屏障并且存在抗Aβ聚集的相關(guān)結(jié)構(gòu)，具有干預(yù)腦部疾病的研究價值。

表1 玉米黃素在食品中的含量Table 1 Contents of zeaxanthin in foods

圖1 玉米黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of zeaxanthin

本實驗用TM處理SH-SY5Y細胞，建立ERS模型，用玉米黃素對其進行干預(yù)，測定細胞存活率、細胞周期、自噬和凋亡相關(guān)蛋白表達，以研究玉米黃素對TM引起的細胞自噬、凋亡、周期的調(diào)節(jié)作用，為玉米黃素的功能性作用研究及AD的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SH-SY5Y細胞 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞資源中心。

衣霉素 北京華越洋生物科技有限公司；玉米黃素（純度為85.7%） 上海源葉生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基 美國Gibco公司；雙抗（青霉素-鏈霉素）北京Solarbio公司；胎牛血清、胰蛋白酶 美國Hyclone公司；噻唑藍、Anti-β-actin抗體 美國Sigma公司；Anti-Beclin1抗體、Anti-Beclin1-C 中國臺灣Abnova公司；Anti-GAPDH和Anti-LC3B抗體 美國Cell Signaling Technology公司；Anti-BCL2抗體 英國Abcam公司；辣根過氧化物酶山羊抗鼠免疫球蛋白（immunoglobulins，Ig）G（H+L） 北京中杉金橋公司；BCA蛋白定量測定試劑、辣根過氧化物酶山羊抗兔IgG（H+L）北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；細胞周期檢測試劑盒 北京四正柏生物公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒武漢Servicebio公司。

1.2 儀器與設(shè)備

E191IR型CO2細胞培養(yǎng)箱 美國金西盟公司；CKX41倒置顯微鏡 日本Olympus公司；Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀、ND-1000型紫外-可見分光光度計 美國賽默飛世爾科技公司；凝膠成像分析儀 日本Image Quant RTECL公司；5840R型低溫高速離心機 德國Eppendorf公司；043BR57802轉(zhuǎn)膜裝置、EN027015電泳裝置 美國BIO-RAD公司。

1.3 方法

1.3.1 SH-SY5Y細胞培養(yǎng)

將復(fù)蘇后的SH-SY5Y細胞與10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基混合均勻后，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取處于對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。細胞密度占培養(yǎng)皿皿底70%～80%的時候進行傳代，按細胞的生長狀態(tài)和速度進行培養(yǎng)液的更換。

1.3.2 建立損傷模型

用新鮮培養(yǎng)基重懸處于對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞，混勻后進行細胞計數(shù)，根據(jù)實驗需求及培養(yǎng)皿大小接種SH-SY5Y細胞，在5% CO2、37 ℃條件下過夜培養(yǎng)，覆蓋率達到70%～80%時，使用5 μg/mL TM（TM用二甲基亞砜溶解配制成10 μg/μL的儲存液，－20 ℃保存，使用時用培養(yǎng)基稀釋至所需質(zhì)量濃度）在37 ℃培養(yǎng)箱中靜置36 h誘導(dǎo)ERS模型。

1.3.3 細胞實驗分組

細胞培養(yǎng)過程同1.3.1節(jié)，將細胞分組為空白對照組、玉米黃素組、TM損傷組、損傷加保護組，其中空白對照組不作處理，玉米黃素組僅使用5 μmol/L玉米黃素（玉米黃素用無水乙醇配制成30 mmol/L的原溶液，使用時用新鮮培養(yǎng)液稀釋至所需濃度）處理（6 h預(yù)處理加24、36、48 h處理），TM損傷組僅使用5 μg/mL TM處理（24、36、48 h），TM損傷加保護組為5 μmol/L玉米黃素預(yù)處理6 h后加TM共處理24、36、48 h。

1.3.4 細胞活性檢測

取生長狀態(tài)良好的SH-SY5Y細胞，用0.25 g/mL胰蛋白酶溶液于室溫條件下消化，搖晃培養(yǎng)皿直到細胞在顯微鏡下快速脫落后，按1×105個/mL細胞密度接種于96 孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，采用1.3.3節(jié)分組處理，每孔加入提前配好的噻唑藍溶液，與培養(yǎng)液混勻，使噻唑藍溶液終質(zhì)量濃度至5 mg/mL，室溫孵育4 h，然后終止培養(yǎng)，1 000 r/min離心10 min使結(jié)晶物沉于96 孔板底部，小心吸棄上清液，每孔中加入150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min充分溶解結(jié)晶物。利用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測定OD值。使用下式計算細胞相對存活率。

1.3.5 細胞周期檢測

將處于對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞按3×104個/mL接種到6 cm培養(yǎng)皿，放入恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)過夜。次日按1.3.3節(jié)分組加藥處理后，繼續(xù)培養(yǎng)36 h。按照細胞周期檢測試劑盒說明書對樣品進行處理，所得樣品24 h內(nèi)利用流式細胞儀檢測細胞周期，收集數(shù)據(jù)于CELL QUEST PRO軟件，細胞周期分析用Modifit LT軟件進行。

1.3.6 Western blot分析

細胞培養(yǎng)與藥物處理同1.3.1節(jié)和1.3.3節(jié)。用1 mL的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌細胞2～3次后，在6 mL培養(yǎng)皿中加入約150 μL含蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液，使用細胞刮收集細胞于培養(yǎng)皿中，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000×g離心10 min后收集上清液，BCA法測定上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。5×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）上樣緩沖液按體積比4∶1加入到蛋白裂解液中，于100 ℃條件下煮沸變性5 min。冷卻后置于－20 ℃保存。樣品中目標(biāo)蛋白采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，再將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，利用5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4 ℃條件下振蕩過夜孵育。次日，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min，二抗37 ℃孵育2 h，用TBST緩沖液洗滌3次。利用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒處理聚偏氟乙烯膜蛋白條帶，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)上曝光膜上條帶。以β-actin和GAPDH為內(nèi)參，使用Image J軟件分析條帶的灰度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

各實驗分組進行3組及以上平行，所有數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用SPSS 19.0軟件中單因素方差分析法進行分析，并通過Bonferroni法進行多重比較，以P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著；利用Origin 2018軟件作直方圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米黃素與TM共處理時間篩選

采用玉米黃素預(yù)處理6 h后再與TM共處理24、36、48 h，檢測各組的細胞洗滌存活率，由圖2可知，玉米黃素預(yù)處理6 h后TM與玉米黃素共處理24、36、48 h，與單獨TM處理相比，共處理不同時間對TM引起的SH-SY5Y細胞損傷均存在一定緩解作用，隨著處理時間的延長，損傷加保護組與TM損傷組之間開始出現(xiàn)顯著性差異。由圖2A～C可知，與空白對照組相比，TM單獨處理時在不同時間下細胞相對存活率均極顯著下降（P＜0.01），共處理時間為24、36、48 h時TM損傷組SH-SY5Y細胞的相對存活率分別為73.38%、59.86%、55.13%（當(dāng)相對存活率約為40%時建模效果較好），損傷加保護組細胞存活率均高于TM損傷組，分別為77.10%、74.60%、67.97%，其中與TM損傷組相比，36 h時SH-SY5Y細胞相對存活率出現(xiàn)極顯著上升（P＜0.01）。綜合各因素考慮，后續(xù)實驗選擇TM與玉米黃素共處理時間為36 h進行實驗。

圖2 玉米黃素與TM共處理時間對SH-SY5Y細胞活性的影響Fig. 2 Effect of co-treatment time of zeaxanthin and TM on cell viability of SH-SY5Y cells

2.2 玉米黃素對TM引起的細胞周期的影響

采用流式細胞術(shù)檢測TM與玉米黃素處理引起的細胞周期改變。由圖3A～D和表2可知，與空白對照組相比，TM損傷組G0/G1期細胞量均出現(xiàn)極顯著上升（P＜0.01），同時G2/M期細胞量極顯著減少（P＜0.01）。玉米黃素預(yù)處理6 h后再與用TM共處理的細胞，相較于TM損傷組，G0/G1期的細胞數(shù)量發(fā)生減少。由圖2E可知，TM損傷組、損傷加保護組的G2/M和S期樣品數(shù)據(jù)偏小、顏色偏藍，G0/G1期樣品數(shù)據(jù)偏大、顏色偏紅；空白對照組、玉米黃素組G2/M和S期的樣品數(shù)據(jù)偏大、顏色偏紅，而G0/G1期的樣品數(shù)據(jù)偏小、顏色偏藍，結(jié)果同表2結(jié)果一致。說明玉米黃素可以延緩TM引起的G1期阻滯。

圖3 玉米黃素處理對TM引起的SH-SY5Y細胞周期的影響Fig. 3 Effect of zeaxanthin treatment on cell cycle of SH-SY5Y cells damaged by TM

表2 定量分析玉米黃素對TM誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞周期的影響Table 2 Effect of zeaxanthin on cell cycle of SH-SY5Y cells damaged by TM

2.3 玉米黃素對TM處理引起的細胞自噬和凋亡相關(guān)蛋白的影響

2.3.1 玉米黃素對TM處理引起的細胞自噬蛋白的影響

2.3.1.1 玉米黃素對TM處理引起B(yǎng)eclin1蛋白表達量的影響

在穩(wěn)態(tài)的平衡中，自噬可能起到雙重作用，一種是保護細胞免于凋亡，另一種則是其過度激活會促進ERS誘導(dǎo)細胞死亡。而Beclin1基因被證實是第一個在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的自噬基因，其有助于自噬體的形成[20]。如圖4和表3所示，與空白對照組相比，TM損傷組Beclin1蛋白的表達水平顯著增加（P＜0.05），而損傷加保護組可以使TM引起的Beclin1表達增加得到緩解。說明玉米黃素通過緩解TM引起的Beclin1表達增加來實現(xiàn)對細胞自噬的減輕作用。

圖4 玉米黃素聯(lián)合TM對SH-SY5Y細胞自噬蛋白Beclin1的影響（n＝ 3）Fig. 4 Effect of zeaxanthin combined with TM on the expression of Beclin1 in SH-SY5Y cells (n = 3)

表3 玉米黃素對TM誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞自噬和凋亡蛋白的影響Table 3 Effect of zeaxanthin on the expression of protein associated with autophagy and apoptosis in SH-SY5Y cells induced by TM

2.3.1.2 玉米黃素對TM處理引起B(yǎng)eclin1-C和LC3B蛋白表達量的影響

自噬蛋白Beclin-1裂解產(chǎn)生N和C末端。C末端片段在細胞中對凋亡信號敏感，N末端則無活性。因此，Beclin1-C蛋白表達增加可以誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生，是細胞自噬轉(zhuǎn)向凋亡的關(guān)鍵蛋白。LC3B是研究最多的自噬家族蛋白，它與自噬體的發(fā)育和成熟有關(guān)，可用于監(jiān)測自噬活性[13]。如圖5和表3所示，對Beclin1-C蛋白而言，TM損傷組與空白對照組相比Beclin1-C表達量顯著上升（P＜0.05）。與TM損傷組相比，損傷加保護組Beclin1-C表達量出現(xiàn)下降但差異不顯著。而對LC3B蛋白而言，與空白對照組相比，TM損傷組LC3B表達量出現(xiàn)極顯著上升（P＜0.01）。與TM損傷組相比，損傷加保護組能夠下調(diào)TM引起的LC3B表達量上調(diào)，但效果不顯著。

圖5 玉米黃素聯(lián)合TM對SH-SY5Y細胞自噬蛋白Beclin1-C和LC3B的影響（n＝ 3）Fig. 5 Effect of zeaxanthin combined with TM on the expression of Beclin1-C and LC3B in SH-SY5Y cells (n = 3)

2.3.2 玉米黃素對TM處理引起凋亡蛋白BCL2表達量的影響

BCL2是一種抗凋亡蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中BCL2與Beclin-1密切相關(guān)且相互結(jié)合，抑制Beclin-1免受切割，從而起到促進自噬的功能。由圖6和表3可知，與空白對照組相比，TM處理可以極顯著降低BCL2的表達水平（P＜0.01），起到促進凋亡的作用，而損傷加保護組能顯著緩解該蛋白表達量的下降（P＜0.05）。說明玉米黃素可以緩解TM引起的抗凋亡蛋白BCL2表達量的下降。

圖6 玉米黃素聯(lián)合TM對SH-SY5Y細胞凋亡蛋白BCL2的影響（n＝ 4）Fig. 6 Effect of zeaxanthin combined with TM on the expression of BCL2 protein in SH-SY5Y cells (n = 4)

本研究結(jié)果表明，玉米黃素（5 μmol/L）可有效拮抗TM（5 μg/mL）誘導(dǎo)的細胞自噬和凋亡。與空白對照組相比，TM損傷顯著增加Beclin1（P＜0.05）、LC3B（P＜0.01）和Beclin1-C（P＜0.05）的表達量，降低BCL2表達量（P＜0.01），而玉米黃素對TM引起的自噬蛋白表達量的上升和抗凋亡蛋白表達量的下降均具有拮抗作用，其中BCL2表達改變差異顯著（P＜0.05）。由此可知，玉米黃素可以緩解TM誘導(dǎo)的細胞自噬和凋亡。

3 討 論

2021年，65歲及以上AD患者所支付的醫(yī)療、長期護理和臨終關(guān)懷服務(wù)的總金額估計為3 550億 美元[21]。因此，對AD的干預(yù)研究刻不容緩。目前為止，細胞內(nèi)Tau蛋白磷酸化所形成NFT仍然同細胞外的Aβ沉積所形成軸突斑塊一起作為AD的主要病理學(xué)特征[22-23]。然而AD的發(fā)病機制一直未明，缺乏有效的診斷與治療方法[24]。

ERS是AD的早期事件，其被激活時間在AD病理征狀出現(xiàn)之前。主要是由于AD神經(jīng)元中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)錯誤折疊蛋白質(zhì)的增多引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的失衡[25]。ERS被激活后會引發(fā)自噬，自噬是哺乳動物細胞清除異常蛋白的重要過程，是維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)重要防御系統(tǒng)，但過度的自噬會引起細胞的死亡[26]。此外，自噬在細胞凋亡過程中扮演雙重角色，分別表現(xiàn)出抗凋亡和促凋亡的特性[27-28]。研究表明，ERS可調(diào)控自噬、凋亡、周期過程[29]。因此，尋找有效的生物活性物質(zhì)在AD早期階段抑制ERS過程具有重要意義。

玉米黃素作為類胡蘿卜素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在羥基，對抗淀粉樣蛋白生成活性至關(guān)重要[30]。在一項針對AD患者的臨床試驗中，與對照組患者相比，AD患者血清中玉米黃素濃度降低，視力下降，年齡相關(guān)性黃斑變性發(fā)生率增高[31]。此外，類胡蘿卜素的多烯主鏈通過疏水性相互作用抑制Aβ原纖維的形成[32-33]。綜上，玉米黃素具有抗AD的潛力。

本實驗通過ERS誘導(dǎo)劑TM建立SH-SY5Y ERS損傷模型，研究玉米黃素干預(yù)對ERS損傷引起的細胞周期、自噬、凋亡的影響，進而探究其在AD細胞模型中的作用。結(jié)果表明，在共處理時間（24、36、48 h）篩選中，玉米黃素與TM共處理36 h可合理地對SH-SY5Y細胞進行損傷保護。對SH-SY5Y細胞分組進行細胞周期檢測與分析，發(fā)現(xiàn)TM明顯具有阻滯G1期細胞向S期轉(zhuǎn)變的作用，而玉米黃素處理可以減輕TM誘導(dǎo)的G1期細胞阻滯。Western blot結(jié)果表明，TM可以誘導(dǎo)細胞自噬蛋白Beclin1、Beclin1-C、LC3B的表達，下調(diào)抗凋亡蛋白BCL2的表達，而玉米黃素均起到逆轉(zhuǎn)作用。

綜上所述，玉米黃素對TM誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞損傷具有保護作用，其可能是通過玉米黃素減輕細胞在G1期發(fā)生的阻滯、緩解自噬以及抗凋亡來實現(xiàn)。