龔 亮 徐 琳 單秀芝 瞿 杰 胡婉婧 湯建新 湯 力

湖南工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院 湖南 株洲 412007

1 研究背景

硫化氫（H2S）是一種無色、易燃、有惡臭的有毒氣體，具有溶脂性。人體長時間接觸H2S會造成眼睛和呼吸系統(tǒng)損傷，過量攝入會導(dǎo)致呼吸困難、心臟驟停，嚴重者甚至?xí)劳鯷1-2]。同時，H2S也是一種重要的內(nèi)源性氣體信號分子，可通過體內(nèi)多種生理過程產(chǎn)生。在生理濃度范圍內(nèi)，H2S在心臟保護、神經(jīng)調(diào)節(jié)、血管舒張等許多生理過程中發(fā)揮重要作用，但一旦濃度超出生理水平，會導(dǎo)致多種疾病，如肝硬化、老年癡呆、胃黏膜損傷等[3-4]。因此，快速、便捷、準(zhǔn)確地檢測環(huán)境和生物體內(nèi)H2S的濃度具有重要意義。

傳統(tǒng)檢測H2S的方法主要有分光光度法、電化學(xué)測定法、液相色譜法、氣相色譜法等[5-15]。雖然這些方法能檢測出環(huán)境和血液中的H2S含量，但是測試前需要對樣品進行預(yù)處理，且耗時較長，無法快速、實時檢測。H2S容易代謝分解，繁瑣的測試前處理往往導(dǎo)致檢測結(jié)果誤差較大。熒光分析法具有靈敏度高、響應(yīng)快速、非破壞性，并可對目標(biāo)物進行原位實時檢測等特點，近年來被廣泛用于分析檢測領(lǐng)域[16-21]。利用H2S的還原性和親核性，目前研發(fā)人員開發(fā)了許多檢測H2S的熒光探針，然而，這些熒光探針大多是傳統(tǒng)有機小分子熒光探針，存在斯托克斯位移小等缺點，易導(dǎo)致背景干擾大，熒光自吸收高。

1, 8-萘酰亞胺是一種重要的熒光基團，具有光穩(wěn)定性好、量子產(chǎn)率高、斯托克斯位移大、易于合成及修飾等優(yōu)點，常被用于模塊化合成各類熒光探針[22-25]。本文基于1, 8-萘酰亞胺設(shè)計合成了一種新的熒光探針DHBID，其結(jié)構(gòu)及對H2S的響應(yīng)機理如圖1所示。該探針以1, 8-萘酰亞胺基作為熒光基團，2, 4-二硝基苯基作為猝滅基團，在沒有H2S存在時，1, 8-萘酰亞胺與2, 4-二硝基苯之間發(fā)生了分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（intramolecular charge transfer，ICT），導(dǎo)致1, 8-萘酰亞胺的熒光被2, 4-二硝基苯猝滅，因此該探針自身熒光十分微弱；但與H2S反應(yīng)后，熒光探針分子內(nèi)的醚鍵斷裂，熒光基團與猝滅基團脫離，1,8-萘酰亞胺的熒光恢復(fù)。該熒光探針可選擇性識別H2S，通過熒光從無到有，實現(xiàn)對H2S的“turn-on”定量檢測。

圖1 DHBID熒光探針的結(jié)構(gòu)及對H2S的響應(yīng)機理Fig. 1 Structure of fluorescent probe DHBID and its reaction mechanism with H2S

2 實驗

2.1 實驗試劑與儀器

1）主要試劑

4-溴-1, 8-萘二甲酸酐（4-Bromo-1, 8- naphthalic anhydride，NA，純度為96%）、乙醇胺（純度為99%）、2, 4-二硝基氟苯、無水碳酸鉀（K2CO3，純度為99%）、無水硫化鈉（Na2S，純度為95%）、乙醇、N, N-二甲基甲酰胺（N, N-dimethyl-formamide，DMF）、四氫呋喃（tetrahydrofuran，THF），以上試劑均為分析純，購于阿拉丁試劑有限公司。

2）主要儀器

核磁共振波譜儀，Avance 500型，瑞士Bruker公司；紫外光譜儀，UV3600型，日本島津公司；熒光分光光度計，LS45/55型，美國PE公司。

2.2 探針的合成

探針DHBID的合成路線如圖2所示。由圖2可知，反應(yīng)物4-溴-1, 8-萘二甲酸酐（NA），經(jīng)兩步親核-消除過程，得到反應(yīng)中間體1（Br-BN-OH）；之后，在堿性條件下，Br-BN-OH進一步發(fā)生取代反應(yīng)，生成反應(yīng)中間體2（HO-BN-OH）；最后，HO-BN-OH與2, 4-二硝基氟苯發(fā)生取代反應(yīng)，獲得產(chǎn)物熒光探針DHBID，總產(chǎn)率為57.81%。熒光探針DHBID合成過程具體操作如下。

圖2 DHBID熒光探針的合成路線Fig. 2 Synthetic routes of fluorescent probe DHBID

2.2.1 化合物Br-BN-OH的合成

稱取2.070 g 4-溴-1, 8-萘二甲酸酐（7.5 mmol）、0.579 g 乙醇胺（9.0 mmol）溶于120 mL乙醇中，加熱回流4 h。將反應(yīng)后的混合物進行冰水浴，使產(chǎn)物完全析出，抽濾，用乙醇或丙酮洗滌濾餅3次，真空干燥得到化合物Br-BN-OH。測定其產(chǎn)率為84.54%。1H NMR（DMSO-d6, 300 MHz），化學(xué)位移δ（TMS）：8.58～8.69 (q, 2H), 8.42～8.44 (d, 1H),8.04～8.07 (d, 1H), 7.84～7.89 (t, 1H), 4.44～4.47 (t, 2H),3.96～4.01 (d, 2H), 2.25～2.29 (t, 1H)。

2.2.2 化合物HO-BN-OH的合成

稱取1.92 g（6.00 mmol）產(chǎn)物Br-BN-OH充分溶解到120 mL DMF中，加入6.00 g （43.48 mmol）碳酸鉀，在95 ℃下回流6 h。反應(yīng)結(jié)束后，將蒸餾燒瓶冷卻到室溫，加入40 mL冷的去離子水，靜置，析出橘黃色沉淀。待沉淀完全析出后抽濾，用水洗滌3次，將產(chǎn)物于60 ℃下真空干燥，即得到化合物HO-BN-OH。測定其產(chǎn)率為85.35%。1H NMR（DMSO-d6, 300 MHz），δ（TMS）：8.48～8.53 (t,2H), 8.27～8.30 (d, 1H), 8.16～8.18 (d, 1H), 7.93～7.98 (q,1H), 4.78～4.82 (t, 1H), 4.09～4.11 (d, 2H), 3.57～3.64 (q,2H), 2.5 (s, 1H)。

2.2.3 化合物DHBID的合成

稱取1.028 g（4.00 mmol）產(chǎn)物HO-BN-OH充分溶解在20 mL DMF中，加入2.000 g （14.47 mmol）碳酸鉀和0.892 g 2, 4-二硝基氟苯，在90 ℃下避光回流6 h。反應(yīng)結(jié)束后，將蒸餾燒瓶放置在黑暗環(huán)境中自然冷卻到室溫，再加入20 mL去離子水使其沉淀析出，快速抽濾、洗滌。然后將產(chǎn)物置于60 ℃干燥機中避光干燥，即得到目標(biāo)熒光探針DHBID。測定其產(chǎn)率為80.12%。1H NMR（DMSO-d6, 300 MHz），δ（TMS）：8.65～8.66 (d, 1H), 8.54～8.58 (m,2H), 8.45～8.48 (t, 1H), 8.32～8.34 (d, 1H), 8.21～8.23 (d,1H), 8.00～8.02 (d, 1H), 7.63～7.66 (d, 1H), 4.63～4.67 (t,2H), 4.46～4.50 (t, 2H), 2.5 (s, 1H)。

2.3 響應(yīng)性質(zhì)測定

2.3.1 光譜分析

配制濃度為10 μmol/L的探針DHBID母液（溶劑為THF）。測定在終濃度為1 μmol/L的探針DHBID溶液中，加入終濃度為1 μmol/L Na2S前后的紫外吸收、熒光發(fā)射光譜。

2.3.2 濃度響應(yīng)曲線

配制濃度為10 μmol/L的探針DHBID溶液（溶劑為THF），以及一系列不同濃度的Na2S溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。分別將DHBID溶液（終濃度為1 μmol/L）加入不同濃度的Na2S溶液中（終濃度為5, 10, 25, 50,100, 250, 500, 1000 nmol/L）進行反應(yīng)(實驗中采用Na2S作為 H2S供體)，測定反應(yīng)后溶液的熒光光譜。

2.3.3 溫度與時間響應(yīng)

分別配制濃度為10 μmol/L的探針DHBID溶液a/b/c（溶劑為DMF），和25 nmol/L的Na2S溶液，兩者按照體積比1:9混合（總體積為1 mL），將混合溶液分別置于25, 37, 60 ℃的恒溫水浴環(huán)境中進行反應(yīng)，連續(xù)測定反應(yīng)一定時間后溶液的熒光光譜，探究溫度、時間分別對DHBID熒光探針檢測Na2S的響應(yīng)情況。

2.3.4 選擇性試驗

3 結(jié)果與討論

3.1 熒光探針的光學(xué)性質(zhì)

探針分子DHBID以1, 8-萘酰亞胺基作為熒光基團，共軛結(jié)構(gòu)的存在使其表現(xiàn)出較強的紫外吸收，2, 4-二硝基苯基作為猝滅基團。在沒有H2S存在時，1,8-萘酰亞胺與2, 4-二硝基苯之間發(fā)生分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移，致使該探針自身熒光十分微弱；當(dāng)有H2S存在時，熒光基團與猝滅基團脫離，1, 8-萘酰亞胺的熒光恢復(fù)。熒光探針DHBID在加入Na2S前后的UV-Vis吸收光譜及熒光發(fā)射光譜如圖3所示。

圖3 加入Na2S前后DHBID的光學(xué)性質(zhì)Fig. 3 Optical properties of DHBID before and after adding Na2S

由圖3a可知，DHBID在加入Na2S前后的紫外吸收光譜都在275, 339 nm處呈現(xiàn)吸收帶，且在與Na2S反應(yīng)后，275 nm處吸收有所增強。由圖3b可知，DHBID探針分子在加入Na2S之前，體系幾乎沒有熒光；當(dāng)加入Na2S后，在480 nm處熒光顯著增強。這是因為熒光探針分子內(nèi)的醚鍵斷裂，熒光基團與猝滅基團脫離，1, 8-萘酰亞胺的熒光恢復(fù)，呈“turn on”信號響應(yīng)變化。

3.2 反應(yīng)溫度與響應(yīng)時間對熒光探針的影響

溫度對化學(xué)反應(yīng)的影響非常明顯，且熒光探針DHBID是被用于檢測人體內(nèi)的內(nèi)源性小分子H2S，因此，本研究首先探討了溫度對熒光探針的活性影響。圖4是熒光探針在相同Na2S濃度下，不同溫度下（25, 37, 60 ℃）的熒光強度隨反應(yīng)時間的變化曲線。

圖4 不同溫度和時間下DHBID對H2S響應(yīng)的熒光變化曲線Fig. 4 Fluorescence curve of DHBID response to H2S at different temperature and time

由圖4可以看出，在反應(yīng)初始階段，不同溫度下DHBID的熒光強度均隨時間的增加迅速增強，但增強幅度有所不同。當(dāng)溫度為60 ℃時，反應(yīng)初期探針的熒光強度增加最快，但反應(yīng)30 min后，體系的熒光強度增幅較弱，逐漸形成一個比較穩(wěn)定的平臺，這意味著熒光探針與H2S的反應(yīng)基本完成。當(dāng)溫度為37 ℃時，在60 min內(nèi)，體系的熒光強度隨著時間的增加而增強，之后達到了相對穩(wěn)定的平臺，且熒光強度最大值與60 ℃的最大值幾乎吻合。當(dāng)溫度為25 ℃時，在90 min的反應(yīng)時間內(nèi)，體系的熒光強度一直隨時間的增加而增強，并沒有出現(xiàn)穩(wěn)定的平臺，且熒光強度最大值小于37, 60 ℃的最大熒光強度。由此說明，溫度對熒光探針的活性影響較大，在較低的溫度環(huán)境中，熒光探針與Na2S的反應(yīng)速度較慢。故本研究選取反應(yīng)溫度37 ℃，反應(yīng)時間60 min作為測試條件。

3.3 熒光探針對Na2S的響應(yīng)

圖5是熒光探針DHBID對不同濃度Na2S的熒光響應(yīng)光譜圖（圖5a）及濃度響應(yīng)曲線（圖5b），其中圖b的內(nèi)嵌圖為DHBID對低濃度Na2S的線性相關(guān)曲線。

圖5 DHBID對Na2S濃度的熒光響應(yīng)光譜及響應(yīng)曲線Fig. 5 The fluorescence curve of DHBID probe in response to different concentrations of Na2S

如圖5可知，在終濃度為10 μmol/L的DHBID探針溶液中，隨著Na2S的濃度由0增加到250 nmol/L，溶液中熒光強度顯著增強，并在5～100 nmol/L的范圍內(nèi)，探針的熒光強度與Na2S濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，擬合回歸方程為：Y= 19.258X+319.460，R2= 0.9758。在250～1000 nmol/L范圍內(nèi)，熒光強度增長緩慢，并趨于平衡，表明DHBID與Na2S已基本反應(yīng)完全，此時信背比達15倍。

同時，根據(jù)3σ/k規(guī)則，計算出DHBID探針對Na2S濃度的檢測下限為2 nmol/L。其中：σ為空白熒光強度標(biāo)準(zhǔn)偏差，k為線性方程斜率。

圖6為在365 nm紫外燈（圖6a）及白光燈（圖6b）照射下，加入不同濃度的Na2S后，溶液體系的熒光及顏色變化。

圖6 在紫外燈和白光燈下DHBID對不同濃度Na2S的響應(yīng)Fig. 6 Visualized detection of Na2S images by DHBID under UV and white light

彩圖

由圖6可知，隨著Na2S濃度的增加，紫外燈下溶液體系的熒光顏色逐漸增強，白光燈下溶液的顏色逐漸由淡黃色變?yōu)槊导t色；在Na2S濃度達到250 nmol/L后，兩種燈光下溶液顏色不再隨Na2S濃度的增加而發(fā)生明顯變化。因此，當(dāng)Na2S濃度在5～250 nmol/L范圍內(nèi)，DHBID熒光探針可通過顏色變化，對環(huán)境中Na2S的濃度實現(xiàn)半定量檢測。該檢測方法更加直觀、方便，無需其它檢測儀器與手段輔助。

3.4 探針選擇性

探針的選擇性是決定探針能否準(zhǔn)確檢測樣品的重要性能。為此，本研究測試了DHBID熒光探針對15種自然界或人體內(nèi)常見陰離子的選擇性，包括（依次編號為1～15），得到15種干擾離子的熒光響應(yīng)強度及肉眼、紫外燈下熒光響應(yīng)情況如圖7所示。

圖7 DHBID對不同潛在干擾離子的響應(yīng)情況Fig. 7 The response of DHBID probe to different potentially interfering ions

彩圖

如圖7a所示，向熒光探針體系中加入等濃度的各種干擾陰離子溶液及Na2S溶液，只有加入Na2S溶液后的樣品才呈現(xiàn)明顯的熒光響應(yīng)信號，其他陰離子基本上無熒光信號。圖7b中在365 nm的紫外燈照射下，只有加入Na2S溶液后的樣品呈藍綠色，其它樣品沒有熒光響應(yīng)。同時，通過肉眼可以觀察到，只有在加入Na2S溶液后的樣品呈玫紅色，其它樣品依舊無顏色變化。綜上所述，該探針對硫化氫具有高度的響應(yīng)性及選擇性，且該探針對硫化氫的檢測可實現(xiàn)“裸眼”檢測。

4 結(jié)論

本研究基于1, 8-萘酰亞胺合成了一種新型熒光探針DHBID，并將其用于H2S檢測。該探針合成、提純步驟簡單，并對H2S響應(yīng)度高。與不同濃度的硫化鈉反應(yīng)后，在5～250 nmol/L范圍內(nèi)，DHBID具有明顯的“turn-on”型熒光響應(yīng)信號，且在5～100 nmol/L的范圍內(nèi)探針熒光強度與Na2S濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢測下限可達2 nmol/L。選擇性測試表明，DHBID探針對復(fù)雜環(huán)境中常見的陰離子無響應(yīng)信號，因此能對H2S表現(xiàn)出高選擇性。此外，在加入不同濃度的硫化鈉后，體系的顏色會逐漸由淡黃色變?yōu)槊导t色，實現(xiàn)對硫化氫濃度的可視化檢測。