丁壯 ，黃軒濤 ，但年華 ，2＊

（1.四川大學(xué)皮革化學(xué)與工程教育部重點實驗室，四川 成都 610065; 2.四川大學(xué)制革清潔技術(shù)國家工程實驗室，四川 成都 610065）

前言

1962 年，George D.Winter 通過對幼豬體皮膚的研究，首先發(fā)現(xiàn)并證明創(chuàng)傷口處濕性環(huán)境的優(yōu)勢，并且提出了“濕性愈合理論”[1]。1974 年出現(xiàn)了全球首塊半透性的創(chuàng)口用敷料，進一步挑戰(zhàn)了傳統(tǒng)的干性傷口愈合理念。臨床應(yīng)用表明，濕性愈合不僅可以有效地減少慢性傷口恢復(fù)所需的愈合時間，還大大減少了換藥的頻率，避免換藥痛苦和二次機械性損傷，增加傷者治療滿意度，縮短了創(chuàng)面愈合時間和傷者的住院時間。常見的濕性愈合敷料主要包括薄膜類、水凝膠類、水膠體（清創(chuàng)膠）類等[2-5]，它們由高分子有機物聚合而成，親水保濕性能較好，但存在機械性能差、生物活性低等缺點。pADM 是保留了膠原纖維支架，去除豬皮中的表皮和真皮層細胞成分而得到的材料，具有優(yōu)良的力學(xué)性能和生物相容性，已廣泛用作真皮的替代物。但是 pADM 存在容易干燥、翹邊的缺點，普通物理浸泡或者化學(xué) 改性的方法對 pADM 進行處理，往往會導(dǎo)致親水性降低，或者親水性能提高有限、保濕能力不足，仍然不能很好地滿足濕性愈合環(huán)境的需要[6-9]。

HA 是由 D- 葡糖醛酸（GlcA）和 N- 乙酰氨基葡糖（GlcNAc）以雙糖單位交替連接而成的直鏈高分子酸性黏多糖。因結(jié)構(gòu)中含有大量的羥基和羧基，其螺旋柱形結(jié)構(gòu)中內(nèi)側(cè)的羥基賦予了其優(yōu)良的親水性能，可以吸收自身重量的 1000 倍的水[10]，被公認為自然界中最強的天然保濕物質(zhì)。在水溶液中，HA 鏈彼此纏結(jié)，通過氫鍵的作用將水分子固定于三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中[11-12]，使其較難流失，具有優(yōu)異的“鎖水”保濕功能，因而在化妝品、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[10]。

將 HA 的鎖水保濕功能嫁接到 pADM 中，有望獲得具有優(yōu)良親水保濕功能的 pADM 敷料。若僅用HA 浸漬 pADM，雖然可以提高其親水保濕性能，但由于兩者之間缺少牢固的化學(xué)鍵結(jié)合，經(jīng)過水洗等處理后，會造成 HA 流失，保濕性能仍然不足。盡管采用高碘酸鈉氧化 HA 得到的雙醛透明質(zhì)酸（OHA）也可以與 pADM 形成強烈的共價結(jié)合而將 HA 引入到 pADM 中，但是由于該氧化反應(yīng)會造成糖環(huán)的破壞，甚至導(dǎo)致 HA 分子鏈斷裂降解[13-14]，使其保濕性能大打折扣。因此，如何在不破壞 HA 糖環(huán)基本結(jié)構(gòu)的前提下，將 HA 與 pADM 產(chǎn)生強烈的共價結(jié)合，使 HA 錨定于 pADM，是解決該問題的關(guān)鍵。

由于環(huán)氧基中電荷的極化和環(huán)張力的存在，使得環(huán)氧基具有極高的反應(yīng)活性。它易與含有活潑氫原子的基團（如胺基、酚羥基、羧基、巰基、羥基、酰胺基等）發(fā)生反應(yīng)，是一種常用的接枝改性試劑[15-19]。我們通過在 HA 糖環(huán)上引入環(huán)氧基的方法，賦予 HA 化學(xué)反應(yīng)活性，得到新型交聯(lián)改性劑EHA，然后再與 pADM 交聯(lián)改性，希望能夠達到理想的親水保濕效果，見圖 1。

圖1 EHA 交聯(lián)改性 pADM 的反應(yīng)機制Fig.1 Preparation scheme of EHA-pADM

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

脫細胞豬真皮基質(zhì)，醫(yī)用級，江陰奔 翔 生 物 科技有限公司；透明質(zhì)酸，環(huán)氧氯丙烷，1,4- 二氧六環(huán)，氫氧化鈉，碳酸氫鈉，碳酸鈉，氯化銨，分析級，成都市科隆化工試劑廠；環(huán)氧透明質(zhì)酸鈉，自制。

1.2 實驗儀器

FA1004 精密分析天平，上海精密科學(xué)儀器廠；Freeze 6 真空冷凍干燥機，美國 Labconco；HZS—HA水浴振蕩器，哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；ZKYY 恒溫水浴鍋，上海大研儀器有限公司；DSA-X 接觸角測量儀，廣州貝拓有限公司；204F1 差式掃描量熱儀（DSC），德國 Netzsch 公司；SPM-9600 原子力顯微鏡（AFM），日本島津公司；MAGNA IR560 傅里葉紅外 光 譜 儀 （ATR-FTIR）， 美 國 Nicolet 公 司 ；MSW-YD4 數(shù)字式皮革收縮溫度測定儀，陜西科技大學(xué)陽光電子研究所。

1.3 實驗內(nèi)容和方法

1.3.1 EHA-pADM 的制備

準確稱取 1 g 的 pADM，加入到 pH 為 10.4 的NaHCO3-Na2CO3緩沖液中，分別加入 pADM 質(zhì)量分數(shù) 2%、4%、8%的 EHA，在 37 ℃條件下恒溫水浴振蕩 72 h，水洗 3 次，再加入一定量的 NH4Cl 中和，再水洗 3 次；冷凍干燥，得到 EHA-pADM，按順序分別記為 0%、2%、4%、8%。

1.3.2 EHA-pADM 結(jié)構(gòu)分析

1.3.2.1 EHA-pADM 的 ATR-FTIR 檢測

將樣品進行 ATR-FTIR 的檢測和分析。掃描波數(shù)為 4000～500 cm-1，分辨率為 4 cm-1，掃描重復(fù) 32次。溫度 25 ℃，相對濕度為 65%。

1.3.2.2 EHA-pADM 的 AFM 觀察

用冷凍切片機將樣品平切為 9 μm 厚度的片狀，將制備的片狀樣品平鋪在蓋玻片表面，使用AFM 觀察樣品表面的微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.3 EHA-pADM 熱穩(wěn)定性能檢測

EHA-pADM 的收縮溫度檢測和 DSC 檢測；將材料剪成 1 cm×7 cm 的長方形條狀樣品，固定在收縮溫度測定儀的試樣鉤上，在初始溫度為 25 ℃、加熱速率為 4 ℃/min 的條件下水浴加熱，至數(shù)字顯示屏上出現(xiàn)收縮溫度為止，平行測定四個樣品，結(jié)果取平均值；稱取質(zhì)量為 3～5 mg 的樣品置于 DSC 坩堝中，通過 DSC 對樣 品進行測定，溫度范圍為25～150 ℃，升溫速率為 10 ℃/min，氮氣保護氣流為60 mL/min。

1.3.4 EHA-pADM 親水性能分析

1.3.4.1 EHA-pADM 的接觸角檢測

采用坐滴法，以 20 μL 蒸餾水的液滴，滴在材料表面上，利用接觸角測量儀記錄液滴與材料表面接觸的瞬間圖像，利用軟件檢測其接觸角，平行測定 5 次結(jié)果取其平均值。

1.3.4.2 EHA-pADM 的吸濕率與保水率檢測

將材料制成 4 cm×7 cm 大小，在 20 ℃、RH 為33%條件下調(diào)節(jié) 24 h，使材料回潮率達到平衡。根據(jù)文獻[8]對樣品進行吸濕率與保水率測定。

1.3.5 EHA-pADM 的吸濕動力學(xué)分析

將盛有飽和 Na2SO4水溶液（RH=93%）的干燥器置于 20 ℃恒溫環(huán)境中，精確稱取一定量 EHA-pADM 干燥樣品置于干燥器內(nèi)，每隔 2 h 精確稱取各樣品質(zhì)量，由放置前后樣品的質(zhì)量差，求出樣品吸水量 Q。其中以 48 h 的含水量作為平衡含水量 qe，最后進行擬一級和擬二級吸附動力學(xué)進行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 EHA-pADM 結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 EHA-pADM 的 ATR-FTIR 分析

pADM 的主要成分為 I 型膠原，天然的 I 型膠原具有特殊的三股螺旋結(jié)構(gòu)，膠原蛋白分子與其它小分子化合物相互作用前后，膠原蛋白的特征吸收譜帶會發(fā)生相應(yīng)的改變。如圖 2 所示，從紅外光譜的特征酰胺吸收峰可以觀察到，膠原分子的酰胺 A帶的吸收峰位于 3410 cm-1，酰胺 I 帶的吸收峰位于1650 cm-1處，酰胺 II 帶的吸收峰位于 1545 cm-1處，酰胺 III 帶的吸收峰位于 1235 cm-1，其中膠原特殊的三股螺旋結(jié)構(gòu)與酰胺吸收峰相關(guān)[20]。對比不同EHA 用量的 EHA-pADM 的 ATR-FTIR 曲線圖，其典型的吸收峰帶并未產(chǎn)生太大變化。表明 EHA 改性不會對膠原分子結(jié)構(gòu)造成破壞，pADM 在改性后仍保 持 著 膠 原分子的天 然 構(gòu) 象 。EHA-pADM 在1080 cm-1處的吸收峰的峰形變尖且有一定程度的增強，這是由于 EHA 中的糖苷鍵的引入產(chǎn)生的吸收峰增強，說明 EHA 糖單元接枝到了 pADM 中。

圖2 不同用量 EHA-pADM 的 ATR-FTIR 曲線Fig.2 ATR-FTIR spectra of EHA-pADM with different dosages of EHA

2.1.2 EHA-pADM 的 AFM 觀察

pADM 中含有的天然四分之一錯列模型構(gòu)想使其具備較為優(yōu)異的生物學(xué)活性，在 AFM 下觀察不同改性劑用量的 EHA-pADM 樣品的膠原纖維縱向分布。如圖 3 所示，不同改性劑用量的 EHA-pADM樣品的膠原纖維排列緊密，且可以觀察到特有的、周期性的明暗橫紋間距，表明其三股螺旋結(jié)構(gòu)未被破壞，均保持膠原天然的構(gòu)象，該結(jié)果與 ATR-FTIR結(jié)果 一致 ，EHA-pADM 有 望 繼 承 pADM 優(yōu) 良 的 生物學(xué)活性[21-22]。

圖3 不同用量 EHA-pADM 的 AFM 圖Fig.3 AFM images of EHA-pADM with different dosages of EHA

2.2 EHA-pADM 穩(wěn)定性分析

良好的穩(wěn)定性能夠保證生物材料在使用過程中避免由于擠壓、拉伸、降解以及其他問題而造成材料的損壞，其中濕熱收縮溫度、熱變性 溫度和熱分解溫度，可以從側(cè)面反應(yīng)材料的穩(wěn)定性能。加熱會使膠原分子間或分子內(nèi)作用力降低，膠原纖維結(jié)構(gòu)失去穩(wěn)定性，膠原在不斷加熱的水中開始劇烈收縮的溫度為膠原的濕熱收縮溫度（Ts）。如圖 4 所示，交聯(lián)改性后的 pADM 樣品的收縮溫度明顯高于未交聯(lián)的 pADM，其中總體趨勢是隨著改性劑的用量的增加，pADM 樣品的收縮溫度也隨之升高，在 4%用量時 Ts 趨于恒定。其原因可能是膠原分子上的氨基等活性基團數(shù)量是一定的，當改性劑用量增加到一定程 度（4%）后 ，膠原上的活 性 位 點 基本被消耗，此時的交聯(lián)程度最大，收縮溫度趨于恒定。

圖4 不同用量 EHA-pADM 的收縮溫度Fig.4 Shrinkage temperature of EHA-pADM with different dosages of EHA

DSC 能夠?qū)ξ镔|(zhì)的熱穩(wěn)定性進行研究。隨著溫度的上升，pADM 膠原分子中的弱級鍵 （如氫鍵，范德華力等）先斷裂，溫度繼續(xù)上升，膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)將會被破壞，由三股螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)則卷曲，最后變成三條 α 肽鏈，此時的溫度即為 pADM的熱變性溫度[23]。圖 5 為不同用量 EHA EHA-pADM的 DSC 曲線，EHA-pADM 的熱變性溫度 明 顯 高 于pADM，表明 EHA 與 pADM 產(chǎn)生了 交 聯(lián) 效 應(yīng)。當EHA 用量不斷增 加 時 ，EHA-pADM 的熱 變 性 溫 度也隨之增高，說明隨著 EHA 用量不斷增加，EHA 與pADM 交聯(lián)反應(yīng)程度越強，這與之前收縮溫度的結(jié)果基本對應(yīng)。

圖5 不同用量 EHA-pADM 的 DSC 圖Fig.5 DSC curves of EHA-pADM with different dosages of EHA

2.3 EHA-pADM 的親水性能分析

2.3.1 EHA-pADM 的接觸角結(jié)果分析

材料表面接觸角是表征材料表面親水性能的一項重要指標。如圖 6 所示，EHA-pADM 的接觸角隨著 EHA 用量的增大依次降低，說明 EHA 的用量越多，材料表面親水性越好。這是因為，EHA 含有很多親水基團（如羥基、羧基等）接枝到 pADM 上后，使其親水基團數(shù)量大大增加。此外，環(huán)氧基與氨基反應(yīng)還可以產(chǎn)生新的羥基，勢必進一步在 pADM 表面形成強親水層。這些極性親水基團極易與水形成氫鍵等結(jié)合，使 pADM 的表面張力大大降低，表面親水性越強。

圖6 不同用量 EHA-pADM 的表面接觸角Fig.6 Surface contact angles of EHA-pADM with different dosages of EHA

2.3.2 EHA-pADM 的吸濕率和保水率結(jié)果分析

如圖 7 所示，改性后的 EHA-pADM 的吸濕率和保水率基本隨著 EHA 用量的增加而提高。眾所周知，HA 具有優(yōu)異的吸水性和保水性。由圖1的交聯(lián)改性反應(yīng)理可知，EHA 接枝到 pADM 后，仍然保持了完整的 HA 主鏈結(jié)構(gòu)。一方面，將 HA 上的親水基團引入到了 pADM 中，降低了表面張力。另一方面，更重要的是，HA 完整的糖環(huán)和鏈式結(jié)構(gòu)這種高分 子“ 線團 ”結(jié) 構(gòu)能夠任意伸縮 ，分子能夠 自由舒展，可以最大程度地結(jié)合溶液中的水分，形成一個三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成獨特的“鎖水結(jié)構(gòu)”，使單個 HA 分子的鎖水能力可高達 6×103mL/g[10]。當這些 HA 通過化學(xué)反應(yīng)錨定于膠原纖維表面時，就可以結(jié)合盡可能的水分，發(fā)揮其鎖水功效。由于氫鍵的作用以及形成的特殊的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，吸收的水分子被牢牢地“鎖定”在這三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)之中，這些水分子將成為結(jié)合水，在一般外力作用下不易流失[12]，表現(xiàn)為優(yōu)良保濕性能，從而實現(xiàn) pADM 保濕鎖水的功能。此外，當 EHA-pADM 與水接觸后，水充盈于其微觀孔隙結(jié)構(gòu)中，在 HA 分子的加持下，獲得更好的“固定”效果。因此，HA 的引入，使 pADM 的吸濕率和保水性能都有了明顯的提高。根據(jù)濕性愈合理論，敷料親水和保濕性能對細胞的增殖及創(chuàng)口的愈合的能力將有望增強[1]。

圖7 不同用量 EHA-pADM 的吸濕率和保水率Fig.7 Moisture absorption rates and water retention rates of EHA-pADM with different dosages of EHA

2.4 EHA-pADM 吸濕動力學(xué)分析

如圖 8a 所示，不同用量改性的 EHA-pADM 材料的含水量隨著時間的增長而增加，前期（＜4 h）增加速率很快，然后隨時間的延長而逐漸變慢，到 16 h 時基本趨于平衡。改性后的 pADM 的 吸水 量 明顯高于未改性的 pADM，其中改性劑 EHA 用量為8%的 pADM 的平衡吸水量最大，EHA 用量為 0%的pADM 的平衡吸水量最小。

先采用一級吸附動力學(xué)方程擬合整個吸濕實驗過程。Lagen gren 的一級吸附動力學(xué)方程表達式如下：

其中：qe和 q 分別為吸附平衡和時間 t 時刻的吸附量（mg/g），K1 是一次速率常數(shù)（min-1）[24]。如圖8b 所示，以 log(qe-q)對 t 做線性關(guān)系，圖中一級方程式擬合曲線求出各參數(shù)的值列于表 2 中，其線性 關(guān)系不佳（R2＜0.9）。因此轉(zhuǎn)而使用二級吸附動力學(xué)方程擬合整個吸濕實驗過程。二級吸附動力學(xué)方程表達式如下：

其中 K2是一次速率常數(shù)（g/mg·min-1）[24]。如圖8c 所示，以 t /q 對 t 做線性關(guān)系，其具有良好的線性關(guān)系（R2＞0.99）。圖中二級方程式擬合曲線求出各參數(shù)的值列于表2中，從表2中，可以發(fā)現(xiàn)計算的qe/cal 值 與 實 際 值 qe/exp 比 較 接 近 。 可 見 ，EHA-pADM 吸濕過程符合二級吸附過程，表明其吸濕過程不是單層分子層吸附，而是有多個水分子在同一個活性基團發(fā)生多層吸附。我們認為，由于 EHA-pADM 中含有大量的極性基團，在吸附初期，這些極性基團與水之間在氫鍵作用下，吸附到極性基團上，此后，形成的吸附層進一步將多個水分子鎖住，從而形成多層吸附。當 EHA-pADM 與水（或體液）接觸后，可能發(fā)生類似的過程。同時，由于前述的“鎖水作用”，當將其用作傷口敷料時，可以長時間維持傷口處于濕潤狀態(tài)，避免干性結(jié)痂。根據(jù)Winter 的濕性愈合理論，細胞在 這 種濕潤的環(huán)境中能夠快速的繁殖、生長，這將有利于促進傷口愈合。

圖8 吸濕動力學(xué)分析a. EHA-pADM 的含水量與吸附時間的關(guān)系 b. 一級吸附方程擬合的吸濕過程 c. 二級吸附方程擬合的吸濕過程（RH=93%）Fig.8 Hygroscopic dynamics analysisa.Relationship between water content of EHA-pADM and adsorption time b.First-order moisture-adsorption kinetic curves of EHA-pADMc.Second-order moisture-adsorption kinetic curves of EHA-pADM（RH=93%）

表1 一級吸附方程擬合曲線參數(shù)（RH=93%）Tab.1 First-order adsorption equation fitting curve parameters of EHA-pADM（RH=93%）

表2 二級吸附方程擬合曲線參數(shù)（RH=93%）Tab. 2 Second-order adsorption equation fitting curve parameters of EHA-pADM（RH=93%）

3 結(jié)論

采用新型改性劑環(huán)氧化透明質(zhì)酸（EHA）改性pADM，得到的 EHA-pADM，結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，并保持了 pADM 的基本微觀結(jié)構(gòu)。由于完整 HA 鏈的引入，增加的羧基、羥基等極性基團，有利于形成氫鍵引導(dǎo)的多層吸附，形成親水結(jié)構(gòu)，使材料的接觸角明顯下降；同時由于 HA 高分子“線團”吸水后形成的特殊網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，能夠產(chǎn)生強烈的“鎖水”作用，進而 使 EHA-pADM 的 保 濕 性 能 明 顯 增 強 。 EHA-pADM 用作敷料覆蓋傷口時，有助于形成局部的濕潤環(huán)境，符合濕性愈合理論的要求，它有望成為一種新型的親水保濕生物醫(yī)用敷料。