張澤宇，王 鑫，李麗君，馬健生

中國地質(zhì)調(diào)查局沈陽地質(zhì)調(diào)查中心，遼寧 沈陽 110032

0 序言

中國是抗生素生產(chǎn)及使用大國，無論是在城市醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域還是鄉(xiāng)鎮(zhèn)農(nóng)村的畜牧獸醫(yī)方面抗生素的使用已較為普遍. 中國每年的抗生素消耗量約占到全球消耗量的50%［1］. 抗生素在生產(chǎn)和使用過程中或直接散入環(huán)境載體，如水、土壤中，或隨著人體及動物的代謝物進(jìn)入到環(huán)境載體中. 近些年研究表明，國內(nèi)外環(huán)境樣品，如土壤、地表水、地下水等中均檢出了不同種類的抗生素［2-7］. 目前對抗生素在環(huán)境載體中的檢測主要集中在江河湖泊、城市污水處理廠排污口等地表水系統(tǒng)，而地下水中抗生素的檢測報道相對較少，主要是由于地下水具有一定的自凈功能，抗生素在通過地表水和土壤等環(huán)境載體進(jìn)入到地下水中時其濃度會降低. 然而，長期低濃度抗生素水平的維持也會對地下水中的微生物種群生態(tài)造成失衡，長期飲用含有抗生素的水源對于人體免疫系統(tǒng)會造成嚴(yán)重的損害. 中國是一個淡水資源相對匱乏的國家，城鎮(zhèn)和農(nóng)村約有7成以上的人飲用地下水［8］. 部分地區(qū)由于過度開采使用地下水，形成漏斗區(qū)，造成地下水資源嚴(yán)重緊缺和污染的問題日益嚴(yán)重［9］. 因此對于地下水中的抗生素污染的關(guān)注尤為迫切.

目前對于水中的抗生素的檢測的方法主要有：免疫微生物法、固相萃?。合嗌V法（SPE－HPLC）、固相萃?。合嗌V三重串聯(lián)質(zhì)譜法（SPE－UPLC－MS/MS）［10］.SPE－UPLC－MS/MS 法可以提供較低的檢出限和較為明確的定性分析檢測，是目前普遍應(yīng)用的檢測方法.然而，SPE－UPLC－MS/MS 法在實驗室內(nèi)富集樣品500～1000 mL 水，一般采用的上樣流速為5～6 mL/min，富集一個樣品需要2～4 h，耗時較長且不易同時處理大批量樣品，檢測效率較低，不適用于水質(zhì)抗生素污染的大面積生態(tài)調(diào)查項目［11-13］. 薄膜梯度擴(kuò)散法（diffusive gradients in thin films，DGT）采樣技術(shù)是基于Fick 第一擴(kuò)散定律，即20 世紀(jì)90 年代開始發(fā)展的一項原位被動富集采樣技術(shù)［14-15］. 該采樣技術(shù)初期主要用于水體及土壤中進(jìn)行無機(jī)金屬元素的原位富集分析［16-18］，隨著材料科學(xué)的進(jìn)步，其應(yīng)用到水體及土壤中有機(jī)污染物的采樣分析中. Chen C E 等［19］利用DGT 法富集測定了英國一處污水處理廠中進(jìn)水口及出水口中的40 種抗生素含量，采用主動采樣方式共檢出了14 種抗生素. 采用DGT 采樣方式放置7 d 以內(nèi)檢出了14種抗生素中的10 種，放置超過10 d 后檢出了全部14 種抗生素. 結(jié)果表明：DGT 法在日常監(jiān)測污染水域中的抗生素含量是切實可行的；Chen W 等［20］利用DGT被動采樣技術(shù)在水中原位監(jiān)測了家庭及個人用護(hù)理產(chǎn)品及藥物的含量.

本研究應(yīng)用DGT－UPLC－MS/MS 法測定地下水中抗生素含量，首先在實驗室內(nèi)模擬地下水環(huán)境優(yōu)化放置DGT 的時間T，根據(jù)經(jīng)驗公式計算出低溫度下的擴(kuò)散系數(shù)D 值，并在野外試驗區(qū)進(jìn)行了實際采樣應(yīng)用試驗.

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與材料

美國鉑金埃爾（Perkin Elmer）Qsight220 超高效液相色譜－三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀UPLC－MS/MS；屈臣氏超純水；中國Labtech Multivap－10 氮吹濃縮儀；中國KQ52OOE 超聲波清洗器；英國梯度擴(kuò)散薄膜采樣器XAD LSNC：吸附膜厚度0.5 mm，擴(kuò)散膜厚度0.8 mm，過濾膜采用聚醚砜PES 濾膜，DGT 采樣器截面積3.14 cm2.

實驗用試劑：甲酸、乙腈、甲醇均為色譜純；氯化鈉、鹽酸均為分析純. 標(biāo)準(zhǔn)試劑：16 種磺胺類混合標(biāo)準(zhǔn)品（甲醇介質(zhì)，濃度為100 mg/L）：磺胺醋酰（SCT）、磺胺氯噠嗪（SCP）、磺胺嘧啶（SDZ）、磺胺間二甲氧嘧啶（SDT）、磺胺鄰二甲氧嘧啶（SDX）、磺胺甲嘧啶（SMR）、磺胺對甲氧嘧啶（SME）、磺胺二甲嘧啶（SDM）、磺胺甲噻二唑（SMT）、磺胺甲基異惡唑（SMZ）、磺胺甲氧噠嗪（SMD）、磺胺間甲氧嘧啶（SMM）、磺胺苯吡唑（SPA）、磺胺吡啶（SPD）、磺胺噻唑（STZ）、磺胺二甲異惡唑（SIZ）；10 種抗生素純品：奧比沙星（OBX）、恩諾沙星（EFX）、環(huán)丙沙星（CFX）、洛美沙星（LFX）、氧氟沙星（OFX）、諾佛沙星（NFX）、林可霉素（LIM）、四環(huán)素（TC）、土霉素（OTC）、強(qiáng)力霉素（DC）.

1.2 樣品采集與富集

采樣地點(diǎn)為哈爾濱主城區(qū)松花江南岸4 處國家級監(jiān)測井，編號：H01、H02、H03、H04. 樣點(diǎn)地下水位范圍在3～20 m 之間，平均水溫7 ℃，屬于潛層水. 由于是采集水質(zhì)樣品，DGT 選用活塞式采樣器. 將DGT 采樣器安裝在塑料固定器上，下端拴上鉛墜，固定器端系上尼龍繩，垂直放入水井中，要確保采樣器浸入水面100 cm 以下，記錄采樣點(diǎn)位相關(guān)參數(shù)信息，包括采樣點(diǎn)位高程、放置時間、地下水溫度、水位埋深. DGT 法吸附測定目標(biāo)物濃度基于Fick 第一擴(kuò)散定律，計算公式見式（1）. 在DGT 采樣器選定不變的情況下，其相關(guān)定量參數(shù)A，Δg 為固定已知值，放置時間t 為起始放置至回收采樣器時間的差值（采集時間），可見對于目標(biāo)物質(zhì)的富集吸附主要與目標(biāo)物擴(kuò)散系數(shù)及t 值相關(guān).

式中，C 為樣品中目標(biāo)物的濃度值；D 為目標(biāo)物的擴(kuò)散系數(shù)；A 為膜采樣器的接觸面積；t 為采集時間；M 為吸附膜上累積的目標(biāo)物質(zhì)的量；Δg 為擴(kuò)散膜和吸附膜的厚度之和.

1.3 抗生素提取

取下DGT 采樣器用超純水沖洗表面污漬后裝入干凈的塑料袋中放入4 ℃保溫箱保存，運(yùn)輸?shù)綄嶒炇掖郎y. 將DGT 采樣器上的吸附膜取出，放入到15 mL玻璃試管中加入5 mL 甲醇，超聲提取20 min，用甲醇沖洗DGT 采樣器重復(fù)上述過程. 將超聲好的溶液用氮吹濃縮儀吹至近干后加入0.1%甲酸定容到1 mL，待上機(jī)檢測.

1.4 分析條件

色譜條件——PE Qsight220 三重串連四級桿液相色譜質(zhì)譜儀，PE Brownlee SPP C18 色譜柱（2.7 μm，2.1 mm×100 mm）. 流動相A：0.1%甲酸水溶液. B：乙腈溶液. 流速：0.3 mL/min. 進(jìn)樣體積：10 μL. 梯度洗脫程序：0～0.5 min，A 90%；0.5～5 min，A 88%；5～7.2 min，A 40%；7.2～9 min，A 10%；9～9.2 min，A 90%；9.2～12 min，A 90%.

質(zhì)譜條件——正離子模式（ESI＋）掃描，反吹氣：100 mL/min，霧化器：180 mL/min，HSID 溫度：300 ℃，離子源溫度：400 ℃，噴霧電壓：5000 V.

檢測模式——多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描模式，優(yōu)化得到26 種抗生素在正離子模式下質(zhì)譜參數(shù)（見表1）.

2 結(jié)果與討論

2.1 擴(kuò)散系數(shù)（D）的確定

Chen C E 等［19］研究了室溫25 ℃下不同抗生素在吸附膜為大孔吸附型樹脂（XAD18）、擴(kuò)散膜為葡聚糖凝膠樹脂、膜厚度為0.8 mm 條件下擴(kuò)散系數(shù)D25值. 根據(jù)Chen W 等［20］的研究，給出了當(dāng)非一般室溫條件下擴(kuò)散系數(shù)（DT）與D25之間的經(jīng)驗關(guān)系公式，見式（2）. 此次采集地下水溫度在5～7 ℃，由此方程式計算出7 ℃水溫條件下中不同抗生素的擴(kuò)散系數(shù)D7值，見表2. 低溫狀態(tài)下分子運(yùn)動能量降低，擴(kuò)散系數(shù)普遍降低.

表2 26 種抗生素在地下水中的擴(kuò)散系數(shù)Table 2 Diffusion coefficients of 26 antibiotics in groundwater

式中，DT是當(dāng)溫度為T 時的擴(kuò)散系數(shù).

2.2 采樣時間（t）的確定

在實驗室內(nèi)模擬地下水環(huán)境進(jìn)行采樣放置最優(yōu)時間t 研究，取體積為10 L 塑料桶8 個分別加滿水，加入氯化鈉使燒杯中NaCl 濃度為0.01%，調(diào)節(jié)pH 在6.8～7.2 之間. 加入26 種抗生素混標(biāo)100 ng，放入DGT 采樣器，將塑料桶放入到冷藏柜中，冷藏柜設(shè)置溫度為7 ℃，另做空白對照. 間隔3、7、10、14、20、25、30、35 d 分別取出DGT 采樣器按照1.3 節(jié)步驟進(jìn)行提取，1.4 節(jié)步驟上機(jī)檢測，計算DGT 膜吸附量以質(zhì)量記. 檢測結(jié)果表明：大部分磺胺類抗生素在20～30 d出現(xiàn)吸附峰值，如SCP、STZ（圖1b，圖1c）；少部分磺胺類抗生素峰值出現(xiàn)在30～35 d 左右，如SCT（圖1a）；喹諾酮類吸附峰值在30～35 d，如CFX 在35 d 達(dá)到吸附峰值（圖1d）；LIM 吸附峰值在30～35 d 左右（如圖1e）；四環(huán)素類OTC（如圖1f）吸附峰值在30～35 d.

圖1 抗生素的DGT 吸附量圖Fig. 1 DGT adsorptive capacity of antibioticsa—磺胺醋酰（SCD）；b—磺胺氯噠嗪（SCP）；c—磺胺噻唑（STZ）；d—環(huán)丙沙星（CFX）；d—林可霉素（LIM）；f—四環(huán)素（OTC）

在野外選擇井位H01 進(jìn)行野外DGT 放置時間驗證試驗，選用XAD 型DGT 采樣器9 組放置于井內(nèi)，間隔3、7、10、14、20、25、30、35、40 d 分別取出DGT 采樣器按照1.3 節(jié)步驟進(jìn)行提取，1.4 節(jié)步驟上機(jī)檢測，計算DGT 膜吸附量以質(zhì)量記. 實際井位試驗結(jié)果表明磺胺二甲嘧啶SDM（圖2a）、磺胺噻唑STZ（圖2b）均在30 d 內(nèi)出現(xiàn)吸收量峰值，超過30 d 后由于凝膠溶脹和微生物降解等原因?qū)е挛叫氏陆?，因此綜合考慮野外原位富集地下水中抗生素DGT 放置時間在25～30 d 之間為宜.

圖2 抗生素的DGT 吸附量圖Fig. 2 DGT adsorptive capacity of antibioticsa—磺胺二甲嘧啶（SDM）；b—磺胺噻唑（STZ）

2.3 液相色譜－質(zhì)譜條件優(yōu)化

DGT 提取選用甲醇超聲提取，樣品定容溶劑選用純水、純甲醇、0.1%甲酸水溶液做比對，結(jié)果表明：選用0.1%甲酸可以有效減少液相色譜溶劑效應(yīng)，分離度較好；流動相選用A 甲酸0.1%、B 乙腈，可以達(dá)到26種抗生素很好的液相色譜分離度；在26 種抗生素的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）總離子流（TIC）圖（圖3）中可以看出：26 種抗生素保留時間在2.0～10 min. 各抗生素保留時間見表1.

圖3 26 種抗生素TIC 圖Fig. 3 TIC of 26 antibiotics

2.4 線性范圍、檢出限、精密度和準(zhǔn)確度

標(biāo)準(zhǔn)溶液配置：吸取1 mL 的16 種磺胺類抗生素標(biāo)準(zhǔn)原液到100 mL 容量瓶中，之后再分別加入0.1 mg的奧比沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、洛美沙星、氧氟沙星、諾佛沙星、林可霉素、四環(huán)素、土霉素、強(qiáng)力霉素. 用甲醇定容到100 mL 容量瓶中，配制成濃度為1.0 mg/L的26 種抗生素混標(biāo)一級儲備液，用0.1%的甲酸溶液逐級稀釋1.0 mg/L 抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)母液，分別配制成濃度為0.1、0.5、1.0、5.0、10、20、50、100 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作液. 26 種抗生素以峰面積值x，對應(yīng)的濃度值y，建立線性方程. 線性關(guān)系良好，R2＞0.995. 線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表3.

表3 26 種抗生素的線性方程及相關(guān)系數(shù)Table 3 Linear equations and correlation coefficients of 26 antibiotics

檢出限：當(dāng)進(jìn)樣濃度為10 ng/L，進(jìn)樣體積為10 μL時，根據(jù)串聯(lián)質(zhì)譜信噪比S/N 確定26 種抗生素的儀器檢出限為3 倍的信噪比（3 S/N），其范圍為0.002～0.074 ng/L，儀器定量限10 倍信噪比（10 S/N）的范圍為0.007～0.248 ng/L.

精密度：取1000 mL 純水加入到棕色玻璃瓶中，按照2.2 節(jié)加入NaCl，調(diào)節(jié)鹽度和pH 值后放入DGT采樣器，加入26 種抗生素標(biāo)準(zhǔn)10 ng，采集30 d 后上機(jī)檢測，同時做7 組平行樣品和空白對照，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），26 種抗生素的RSD 范圍為4.45%～10.84%.

準(zhǔn)確度：在純水中添加三種濃度分別為10、50、100 ng 的26 種抗生素，每個濃度級別做6 組，計算各添加量的加標(biāo)回收率. 26 種抗生素平均回收率范圍在47.7%～94.6%之間. 檢出限、精密度及準(zhǔn)確度見表4.

表4 26 種抗生素檢出限、精密度及準(zhǔn)確度Table 4 Detection limit，precision and accuracy of 26 antibiotics

2.5 實際樣品測試

實驗選用的樣品采自哈爾濱市北部松花江沿岸地區(qū)的4 口國家級地下水監(jiān)測井. 樣品經(jīng)過原位富集采樣放置30 d 后，經(jīng)DGT－UPLC－MS/MS 測定后，共檢出了8 種抗生素，結(jié)果見表5. 磺胺類、喹諾酮類、林可酰胺類抗生素均有不同程度檢出，表明原位富集采樣及液質(zhì)檢出方法在地下水中抗生素檢測分析實際應(yīng)用中可行.

表5 哈爾濱地區(qū)地下水中抗生素檢出結(jié)果表Table 5 Detected antibiotics in groundwater of Harbin area

3 結(jié)論

本研究利用薄膜梯度擴(kuò)散（DGT）這種原位被動采樣技術(shù)實現(xiàn)了對地下水樣品中多種抗生素的原位富集采樣，相較于傳統(tǒng)使用的固相萃取（SPE）提取技術(shù)，DGT 法具有耗時短，提取操作流程簡便等優(yōu)點(diǎn)，適用于區(qū)域性大面積地下水抗生素污染調(diào)查等樣品量較多的項目采樣及分析測試工作. 同時利用三重串聯(lián)四級桿液相色譜質(zhì)譜儀（UPLC－MS/MS）建立了測定水質(zhì)中26 種抗生素的快速檢測方法，可以實現(xiàn)水質(zhì)中多種抗生素，包括磺胺類、喹諾酮類、林可酰胺類等的快速準(zhǔn)確的定性定量分析. 利用本研究建立的采樣及分析方法（DGT－UPLC－MS/MS）對哈爾濱地區(qū)進(jìn)行實際采樣分析試驗，結(jié)果表明：在選取的4 個點(diǎn)位中均不同程度檢出了抗生素. 此方法對于哈爾濱地區(qū)及松嫩平原地下水中抗生素污染的調(diào)查及生態(tài)風(fēng)險評價可提供技術(shù)支撐.