李彥軍 鄭 楠 王加啟 趙圣國(guó)

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

鷹嘴豆素A(biochanin A)是植物生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，圖1為其化學(xué)結(jié)構(gòu)。鷹嘴豆素A主要存在于紅三葉草和鷹嘴豆等豆科植物，屬于異黃酮類植物雌激素，是大豆異黃酮的主要成分之一，占異黃酮總量的40%，其分子結(jié)構(gòu)和大小類似于雌激素，尤其是雌二醇(17-β-雌二醇)，可以發(fā)揮雌激素作用[1]，與人類的健康密切相關(guān)。隨著人們對(duì)飲食平衡和健康生活追求的不斷提高，對(duì)鷹嘴豆素A生物活性的研究也更加深入。大量體內(nèi)和體外研究結(jié)果表明，鷹嘴豆素A具有抗炎[2-3]、抗氧化[4-5]、抗菌[6-8]和抗癌[9-12]等生物學(xué)功能。除此之外，鷹嘴豆素A還能抗骨質(zhì)疏松[13]、預(yù)防和治療心血管疾病[14]、維持認(rèn)知[15]以及緩解婦女絕經(jīng)后的癥狀[13]，是開發(fā)新型保健品和藥品重要的潛在來源。大豆異黃酮已經(jīng)被多個(gè)國(guó)家列入食物保健品名錄，鷹嘴豆素A也因其廣泛的生物學(xué)功能而聞名。近年來，人們開始關(guān)注鷹嘴豆素A對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵和生產(chǎn)性能的影響，但是已有的文獻(xiàn)報(bào)道基本都是體外發(fā)酵研究，體內(nèi)研究較少，關(guān)于單胃動(dòng)物的研究還未見報(bào)道。

圖1 鷹嘴豆素A的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 鷹嘴豆素A的來源

鷹嘴豆素A是豆科植物中異黃酮類植物雌激素的主要成分之一，最早發(fā)現(xiàn)于紅三葉草的莖和葉[16]。除了紅三葉草，人們從花生[17]、大豆[6]和鷹嘴豆[18]中也都分離得到了鷹嘴豆素A。研究表明，紅三葉草中鷹嘴豆素A的含量最高，其中紅三葉草葉和芽的干物質(zhì)中含量分別為10.30和1.62 mg/g[19-20]；鷹嘴豆的干物質(zhì)中鷹嘴豆素A的含量為1.58 mg/g[18]，而花生的干物質(zhì)中鷹嘴豆素A的含量只有0.76 mg/100 g[17]。除此之外，鷹嘴豆素A的天然來源還包括苜蓿[21]和傳統(tǒng)中藥黃芪[22]等豆科植物，但是鷹嘴豆素A的含量非常低。表1總結(jié)了幾種鷹嘴豆素A的常見來源和含量。

表1 不同來源干物質(zhì)中鷹嘴豆素A的含量

2 鷹嘴豆素A的生物學(xué)功能

2.1 抗炎活性

炎癥通常被認(rèn)為是宿主對(duì)組織損傷的應(yīng)答或機(jī)體對(duì)感染或任何其他刺激的保護(hù)性攻擊，在慢性炎癥的情況下，免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和癌細(xì)胞在微環(huán)境中共存，這些細(xì)胞協(xié)同產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，調(diào)節(jié)炎癥信號(hào)通路，如生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子[14]。

鷹嘴豆素A在核因子-κB受體激活劑配體(receptor-activated nuclear factor-κB ligand,RANKL)誘導(dǎo)的過度激活破骨細(xì)胞中，通過下調(diào)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1α(IL-1α)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的分泌水平抑制炎癥反應(yīng)；鷹嘴豆素A還通過抑制包括p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)與c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)在內(nèi)的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和包括核因子-κB抑制蛋白α(IκBα)與p65絲裂原活化蛋白激酶(p65 mitogen-activated protein kinase,p65)在內(nèi)的核因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路，下調(diào)活化T細(xì)胞1和c-Fos的核因子表達(dá)[23]。在酵母多糖誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎中，鷹嘴豆素A的抗炎作用與17-β雌二醇相似，是通過抑制促炎因子TNF-α和γ-干擾素(IFN-γ)的產(chǎn)生，并增加抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-4(IL-4)和白細(xì)胞介素-10(IL-10)的水平發(fā)揮抗炎作用；鷹嘴豆素A還通過劑量依賴的方式誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的凋亡[24]。鷹嘴豆素A在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的急性肝損傷中以劑量介導(dǎo)的方式增強(qiáng)血紅素氧合酶-1(HO-1)和核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)的表達(dá)；另外，它還通過減少核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)和人硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)之間的相互作用來抑制炎癥小體的活化[25]。在LPS誘導(dǎo)的BV2小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中鷹嘴豆素A通過抑制NF-κB、p65、TNF-α、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、IL-1β、一氧化氮(NO)和前列腺素E2(PGE2)與活性氧(ROS)的釋放，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、環(huán)氧合酶-2(COX-2)、髓樣分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88)和Toll樣受體-4(Toll-like receptor-4,TLR-4)蛋白的表達(dá)，以及蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)與ERK1/2通路的激活發(fā)揮抗炎作用[3]。在另一項(xiàng)研究中鷹嘴豆素A在HUVEC細(xì)胞中通過上調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferators-activated receptor-γ,PPAR-γ)的表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用，從而抑制NF-κB的活化和TNF-α、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、血管細(xì)胞黏附因子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)與細(xì)胞間黏附因子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)的表達(dá)[26]。在THP-1巨噬細(xì)胞衍生的泡沫細(xì)胞中鷹嘴豆素A還可以通過激活PPAR-γ/肝X受體α(LXRα)或PPAR-γ/HO-1途徑增加三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)和三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G1(ATP-binding cassette transporter G1,ABCG1)的表達(dá)，抑制促炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的分泌[14]。鷹嘴豆素A能通過抑制炎癥因子(IL-1β、TNF-α)的釋放和ROS的生成保護(hù)牙周組織免受炎癥破壞[2]。鷹嘴豆素A還能抑制小鼠JB6 P+細(xì)胞和人HaCaT角質(zhì)細(xì)胞中紫外線誘導(dǎo)的COX-2的表達(dá)[27]。鷹嘴豆素A和根皮素通過抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生而減緩過敏性細(xì)胞因子的生成，表明它們?cè)赗BL-2H3細(xì)胞中可能具有較強(qiáng)的抗過敏特性[28]。鷹嘴豆素A抗炎活性的分子機(jī)制見圖2。

IL-1α：白細(xì)胞介素-1α interleukin-1α；IL-1β：白細(xì)胞介素-1β interleukin-1β；TNF-α：腫瘤壞死因子-α tumor necrosis factor-α；RANKL:核因子-κB受體激活劑配體 receptor-activated nuclear factor-κB ligand；RANK：核因子-κB受體激活劑receptor-activated nuclear factor-κB；LPS:脂多糖 lipopolysaccharide; IKK:核因子抑制蛋白激酶 inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase;MAPK:絲裂原活化蛋白激酶 mitogen-activated protein kinase；NF-κB：核因子-κB nuclear factor-kappa B；IκBα：核因子-κB抑制蛋白α inhibitor of nuclear factor kappa B alpha；ERK:細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 extracellular signal-regulated kinase;JNK:c-Jun氨基末端激酶 c-Jun N-terminal kinase;p38: p38絲裂原活化蛋白激酶 p38 mitogen-activated protein kinase;p50:p50絲裂原活化蛋白激酶 p50 mitogen-activated protein kinase;p65:p65絲裂原活化蛋白激酶 p65 mitogen-activated protein kinase;PPAR-γ:過氧化物酶體增殖物激活受體-γ peroxisome proliferators-activated receptor-γ;AP-1：激活蛋白1 activator protein 1；NFATc：活化T細(xì)胞1的核因子 nuclear factor of activated T cells 1；NLRP3:核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3 NOD-like receptor protein 3;iNOS:誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 inducible nitric oxide synthase;COX-2:環(huán)氧合酶-2 cyclooxygenase-2;TXNIP:硫氧還蛋白相互作用蛋白 thioredoxin-interacting protein;NO: 一氧化氮 nitric oxide;PGE2:前列腺素E2 prostaglandin E2;degradation:降解；inflammation：炎癥；active：有活性的；inactive：無活性的。

2.2 抗氧化活性

ROS生成和抗氧化防御系統(tǒng)之間的不平衡會(huì)引起組織器官的損傷，從而造成各種病癥，如炎癥、過敏和心血管疾病。氧化應(yīng)激也是造成神經(jīng)變性、衰老、癌癥和糖尿病的關(guān)鍵因素[29-32]。因此，清除自由基和激活細(xì)胞保護(hù)防御系統(tǒng)有利于健康[33]。

鷹嘴豆素A具有較低的直接抗氧化活性，能通過激活Nrf2來保護(hù)HepG2細(xì)胞免受叔丁基過氧化氫(t-BHP)誘導(dǎo)的氧化損傷，從而刺激下游細(xì)胞保護(hù)酶[如HO-1和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)]的表達(dá)[4]。鷹嘴豆素A[20 mg/(kg BW·d)]通過上調(diào)大鼠肝臟中的谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的表達(dá)來減輕砷誘導(dǎo)的大鼠肝毒性，表現(xiàn)出其抗氧化的潛力[5]。在糖尿病大鼠中，鷹嘴豆素A主要是通過降低丙二醛(MDA)的水平，增加內(nèi)源性抗氧化酶(CAT、SOD)的活性來降低氧化應(yīng)激，從而改變總抗氧化狀態(tài)[34]。此外，鷹嘴豆素A還展現(xiàn)出了1,1-聯(lián)苯基-2-苦基肼基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除活性[半抑制濃度(IC50)=(129.11±2.60)μg/mL]、NO自由基清除活性[IC50=(60.76±5.30)μg/mL]、金屬螯合活性[IC50=(112.62±6.12)μg/mL]和脂質(zhì)過氧化抑制作用[IC50=(58.66±3.40)μg/mL][35]。

2.3 抑菌活性

鷹嘴豆素A能抑制H5N1病毒的復(fù)制，阻斷H5N1誘導(dǎo)的ERK1/2、Akt和NF-κB的活化以及病毒誘導(dǎo)的IL-6、IL-8、IL-10的產(chǎn)生[36]。已有報(bào)道表明，鷹嘴豆素A具有抗利什曼原蟲前鞭毛體的抗利什曼原蟲活性[半最大效應(yīng)濃度(EC50)=18.96 μg/mL][37]和抗肺鏈球菌的抗菌活性(IC50=12 μmol/L)[38]。據(jù)報(bào)道，鷹嘴豆素A的協(xié)同抗菌活性可以增強(qiáng)喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星或氧氟沙星對(duì)解脲脲原體的抑菌活性，兩者聯(lián)合使用時(shí)對(duì)解脲脲原體具有最大的抑菌活性[7]。鷹嘴豆素A和環(huán)丙沙星聯(lián)合作用還可以增強(qiáng)環(huán)丙沙星對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抑菌活性，鷹嘴豆素A的濃度為40 μg/mL時(shí)，環(huán)丙沙星的最小抑菌濃度由64 μg/mL降至8 μg/mL，這主要?dú)w因于鷹嘴豆素A的外排泵抑制作用[8]。除此之外，鷹嘴豆素A還能通過下調(diào)包括dnaA、dnaC和dnaN在內(nèi)的幾個(gè)DNA合成相關(guān)基因的表達(dá)，對(duì)大豆斑疹病菌(Xanthomonasaxonopodispv.glycines)發(fā)揮抑菌活性(最小抑菌濃度<100 μg/mL)[6]。此外，鷹嘴豆素A對(duì)8個(gè)梭狀芽孢桿菌也表現(xiàn)出了抑菌潛力[39]。

2.4 抗癌活性

鷹嘴豆素A具有在各種癌細(xì)胞的G1、G2/M和G0/G1期阻斷細(xì)胞周期的潛力，鷹嘴豆素A的抗癌活性與通過介導(dǎo)B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)家族蛋白(Bad、Bid、Bax 等)、促炎性細(xì)胞因子[9-10,12,40]和MAPK信號(hào)網(wǎng)絡(luò)(p38 MAPK、c-Jun、ERK)[9,41]、NF-κB[10]、細(xì)胞色素c[9]的釋放以及激活包括半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-3、Caspase-8、Caspase-9在內(nèi)的Caspase家族成員[12]來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。鷹嘴豆素A和索拉非尼聯(lián)合處理可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞G0/G1期的終止，下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D和Ki-67基因的表達(dá)及存活率[12]。此外，鷹嘴豆素A還能通過上調(diào)p53及其下游靶點(diǎn)p21的表達(dá)，同時(shí)降低細(xì)胞周期蛋白A和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinases 2,CDK2)的表達(dá)，調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480在G2/M期、A549細(xì)胞在S期和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87在G1期的細(xì)胞周期終止[11,42]。據(jù)報(bào)道，鷹嘴豆素A通過抑制NF-κB的激活而抑制頭頸癌的增殖，它還通過下調(diào)由p38、MAPK和Akt通路介導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2/-9(matrix metalloproteinase-2/-9,MMP-2/-9)的表達(dá)來抑制FaDu細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移[10]。另外，用鷹嘴豆素A和替莫唑胺聯(lián)合處理降低了神經(jīng)膠質(zhì)瘤(T98、U87)細(xì)胞中表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase,p-ERK)、磷酸化蛋白激酶(phosphorylated protein kinase B,p-Akt)和c-Myc的水平[42]。

2.5 其他生物學(xué)功能

3 鷹嘴豆素A的生物利用率

生物利用率是指在系統(tǒng)循環(huán)中藥物在作用部位的吸收率。一些研究報(bào)道了異黃酮在給藥后在人體中的生物利用率大部分都小于1%[51]。與其他異黃酮相似，鷹嘴豆素A的口服生物利用率低。據(jù)報(bào)道，大鼠口服劑量為5 mg/kg BW時(shí)鷹嘴豆素A的生物利用率為2.6%，而口服劑量為50 mg/kg BW時(shí)為1.2%；大鼠血漿中鷹嘴豆素A的含量為1.5%，鷹嘴豆素A由于其高滲透性使其吸收迅速，而膽汁的清除和機(jī)體的新陳代謝可能是其生物利用率較低的主要原因[52]。在給大鼠同時(shí)飼喂5種黃酮類化合物時(shí)，鷹嘴豆素A的生物利用率為21.3%，說明黃酮類化合物的組合可能能夠提高鷹嘴豆素A的生物利用率[53]。

4 鷹嘴豆素A的構(gòu)效關(guān)系

與二氫異黃酮相比，異黃酮由于其結(jié)構(gòu)上的修飾而表現(xiàn)出生物學(xué)活性，C環(huán)上存在的2，3-雙鍵對(duì)異黃酮的活性起著至關(guān)重要的作用，鷹嘴豆素A的2，3-雙鍵和A環(huán)上的7-OH能增強(qiáng)活性，由于A環(huán)7-OH和B環(huán)上的4-OCH3的存在，極大地增強(qiáng)了鷹嘴豆素A的抗氧化活性[54]。對(duì)鷹嘴豆素A不同衍生物的研究表明，A環(huán)中的7號(hào)位、B環(huán)中的4號(hào)位和C環(huán)中的2,3-雙鍵在反應(yīng)過程中非常重要，7號(hào)位的游離羥基增強(qiáng)了抗癌活性，而5號(hào)位的游離羥基由于阻止活性自由基的產(chǎn)生而降低了抗氧化活性[32]。例如，A環(huán)中7號(hào)位的脂化作用增強(qiáng)了對(duì)MCF-7細(xì)胞的抗增殖活性[55]。鷹嘴豆素A的抗菌活性可能與染料木素相似(抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶)，因?yàn)樗鼈儍烧咴?號(hào)位上的甲氧基和羥基在結(jié)構(gòu)上是同源的[56]。

5 鷹嘴豆素A在反芻動(dòng)物上的研究

體外發(fā)酵結(jié)果表明，鷹嘴豆素A具有選擇性抗菌活性和協(xié)同抗菌活性，可以改變瘤胃菌群結(jié)構(gòu)，抑制高產(chǎn)氨菌、淀粉分解菌和乳酸菌的活性，減少氨基酸發(fā)酵脫氨和淀粉分解，導(dǎo)致氨和乳酸的生成受到抑制；鷹嘴豆素A還可以促進(jìn)纖維素分解菌和乳酸利用菌的活性，增強(qiáng)纖維素的分解和乳酸的代謝[56-58]。此外，Liu等[59]研究顯示，鷹嘴豆素A可以通過抑制蛋白質(zhì)分解菌和尿素分解菌的活性抑制蛋白質(zhì)和尿素的分解，提高瘤胃微生物蛋白的合成效率。飼養(yǎng)試驗(yàn)也得到了相同的結(jié)果，鷹嘴豆素A不僅可以抑制牛高產(chǎn)氨菌發(fā)酵干酒糟(dried-distillers’ grains，DDG)和瘤胃中氨基酸的降解，使更多的氨基酸在后消化道吸收，提高DDG中粗蛋白質(zhì)的消化率和肉牛的增重性能，還可以增加細(xì)菌素等瘤胃微生物產(chǎn)生的抗菌化合物，代替莫能菌素改善瘤胃pH，防止瘤胃酸中毒[60-62]。

鷹嘴豆素A進(jìn)入瘤胃以后首先在瘤胃微生物的作用下脫去B環(huán)4號(hào)位上的甲基生成染料木素，染料木素在瘤胃液中進(jìn)一步開環(huán)產(chǎn)生沒有雌激素活性的對(duì)乙基苯酚和有機(jī)酸(4-羥基苯基-2-丙酸)[63]。除此之外，染料木素還可以被瘤胃微生物直接轉(zhuǎn)化成二氫染料木素[64]。研究表明，人腸道內(nèi)的細(xì)枝真桿菌也可以進(jìn)一步將染料木素降解為二氫染料木素，然后將裂解C環(huán)生成乙基苯酚和6-羥基去氧甲基安哥拉紫檀素(6-methoxyl-O-desmethylangolensin，6-OH-O-DMA)，6-OH-O-DMA隨后生成4-羥基苯基-2-丙酸[65]。鷹嘴豆素A在瘤胃中的代謝程度隨著飼喂時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸提高，6～10 d后鷹嘴豆素A幾乎被完全代謝成對(duì)乙基苯酚和有機(jī)酸，然后主要通過尿液被排出體外，山羊奶中也有對(duì)乙基苯酚被檢出[66-67]。

6 小結(jié)與展望

目前，大量的研究表明鷹嘴豆素A具有多種生物學(xué)功能，在抗炎、抗氧化和抗癌等方面都具有良好的作用，但是其作用機(jī)制仍有待于深入解析，而且鷹嘴豆素A在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中的研究也鮮有報(bào)道。鷹嘴豆素A的植物提取率低，難以獲取高純度鷹嘴豆素A，而且生物利用率也低。因此，應(yīng)該加強(qiáng)鷹嘴豆素A的提取工藝方面的研究，提高鷹嘴豆素A的純度，以減少研究過程中其他異黃酮的影響；同時(shí)，還應(yīng)繼續(xù)對(duì)其生物活性進(jìn)行更深入的研究，繪制出清晰完整的作用機(jī)制圖，并且加強(qiáng)其在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中的研究，找出鷹嘴豆素A在瘤胃內(nèi)完整的代謝途徑，為新型藥物和保健品以及飼料添加劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。