鄧 倩，王 羊，鄧群仙*，張慧芬，夏 惠，梁 東，王 全

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，成都 611130；2.四川省廣安市鄰水縣經(jīng)果技術(shù)推廣所，四川 鄰水 638500；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)果蔬研究所，成都 611130）

棗起源于中國，不僅是中國最古老的果樹之一[1]，也是我國特有的果樹資源和獨(dú)具特色的優(yōu)勢果樹樹種[2]。

有機(jī)酸，產(chǎn)生水果重要的口味感覺“酸”，是果實(shí)品質(zhì)及風(fēng)味物質(zhì)的主要成分之一[3]。果實(shí)的酸味是由有機(jī)酸的種類、含量和比例共同決定的。同一種但不同品種的水果，其有機(jī)酸組成都可能存在差異，蘋果酸或檸檬酸為多數(shù)水果的主要有機(jī)酸[4]。黃果柑中總酸含量的90%以上為檸檬酸[5]。Y.Soyer等[6]研究結(jié)果顯示葡萄中的酒石酸含量最高，約為4.98～7.48 g/L。趙愛玲等[7]研究發(fā)現(xiàn)酸棗的總酸含量是棗種質(zhì)的3～5倍，且酸棗以檸檬酸和蘋果酸為主，棗果實(shí)以蘋果酸和奎寧酸為主。

目前果實(shí)中有機(jī)酸代謝的研究多集中在蘋果、柑橘、葡萄及梨等樹種上，‘冬棗’和‘駿棗’為北方栽培棗品種，其有機(jī)酸代謝研究和全基因組測序已見報(bào)道[8-11]。但南方栽培棗品種的有機(jī)酸積累規(guī)律、相關(guān)基因表達(dá)等研究較少，而且由于南方陰雨天多、光照弱以及積溫不足，導(dǎo)致南方栽培棗果實(shí)中有機(jī)酸的積累量高于北方栽培棗[12]，對南方栽培棗的鮮食風(fēng)味影響較大。因此，本試驗(yàn)以原產(chǎn)四川德陽市羅江區(qū)，果實(shí)長圓柱形，低含酸量的‘羅江調(diào)元棗’為材料，以高含酸量的‘圓形小酸棗’為對照[13]，通過測定各發(fā)育時(shí)期有機(jī)酸含量、組分以及相關(guān)代謝基因的表達(dá)量，進(jìn)而分析‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’的有機(jī)酸代謝差異，為進(jìn)一步調(diào)控南方栽培棗品種中有機(jī)酸代謝及棗果實(shí)品質(zhì)與風(fēng)味的提高提供理論參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于四川省德陽市羅江區(qū)白馬關(guān)鎮(zhèn)萬佛村五組（N 31°26'34''，E 104°46'18''，海拔約660 m），屬于亞熱帶濕潤地區(qū)，四季分明，氣候溫和，年平均氣溫16.5℃，最高氣溫為36.6℃，最低氣溫為-6.7℃；平均年降水量910 mm，無霜期278 d，年平均日照時(shí)數(shù)1 260 h。

1.2 試驗(yàn)材料

以‘羅江調(diào)元棗’（用TYZ表示）和‘圓形小酸棗’（用SZ表示）作為試驗(yàn)材料，皆為露地栽培的根蘗苗，株行距為2 m×3 m。其中‘羅江調(diào)元棗’是低酸鮮食棗品種，‘圓形小酸棗’是高酸砧木酸棗品種。棗樹樹勢健壯，生長及結(jié)果正常，栽培管理基本一致。

掛牌、采樣等采用鄧倩等[14]的方法，共采樣9次。

1.3 有機(jī)酸的測定

有機(jī)酸提取以及測定參照孫延芳的方法[15]，并略有改動(dòng)。取適量樣品放入研缽用液氮將其研磨成粉末，準(zhǔn)確稱取0.5 g充分研磨的樣品放入離心管中，再加入3 mL的0.04 mol/L的KH2PO4提取液，搖勻并配平。超聲20 min后，常溫6 000 r/min離心20 min，取上清液過0.22 μm濾膜過濾待測。色譜柱選用 MZ PerfectSil Target C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為4%甲醇水溶液；流速0.5 mL/min；柱溫25℃；檢測波長210 nm；進(jìn)樣量10 μL。

1.4 總RNA的提取及cDNA合成

總RNA的提取參照改良CTAB法，并略有改動(dòng)。cDNA的合成根據(jù)TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5 PCR引物設(shè)計(jì)和反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物檢測

有機(jī)酸代謝相關(guān)基因根據(jù)NCBI上棗全基因組測序結(jié)果，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)定量引物，內(nèi)參基因引物序列參考張春梅[10]報(bào)道的，序列見表1。擎科生物技術(shù)（成都）有限公司完成引物的合成。

表1 qRT-PCR引物Table 1 Primers for quantitative real-time PCR

以cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物質(zhì)量及特異性。PCR體系為2×Taq Mix 10 μL，模板1 μL，上下游引物各0.8 μL，dd H2O 7.4 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)。所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 熒光定量PCR分析

利用THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix without ROX試劑盒（TOYOBO）在CFX Connect型實(shí)時(shí)定量PCR儀（Bio-Rad，USA）上進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)總體系10 μL，包含5 μL的THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix without ROX，10 μM 的上下游引物各0.4 μL，1 μL的cDNA模板和3.2 μL的無RNA酶水。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。采用相對表達(dá)量2-ΔΔCT表示基因表達(dá)水平。以上每個(gè)樣品均設(shè)3次重復(fù)，每次試驗(yàn)設(shè)置陰性對照。內(nèi)參基因?yàn)閁BQ。以‘圓形小酸棗’花后20 d的表達(dá)量為對照，其表達(dá)量為1。

1.7 數(shù)據(jù)處理方法

采用Microsoft Excel及SPSS Statistics 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)中有機(jī)酸組分及含量的動(dòng)態(tài)分析

由不同發(fā)育時(shí)期棗和酸棗果實(shí)的有機(jī)酸含量動(dòng)態(tài)變化可知（圖1），‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’的主要有機(jī)酸為檸檬酸和蘋果酸。果實(shí)發(fā)育前期（花后20～55 d），蘋果酸為‘圓形小酸棗’的主要有機(jī)酸組分，占總酸含量的50%～60%，果實(shí)發(fā)育后期（花后76～90 d）則蘋果酸和檸檬酸各占總酸含量的40%左右。‘羅江調(diào)元棗’果實(shí)在整個(gè)發(fā)育時(shí)期占主導(dǎo)地位的都是蘋果酸，蘋果酸含量占總酸含量的50%～90%。

圖1-A、1-B和1-E中，從酸含量整體變化趨勢來看，‘圓形小酸棗’中蘋果酸、檸檬酸和總酸含量呈現(xiàn)上升-下降-上升-下降的變化趨勢，檸檬酸和總酸含量在花后62 d達(dá)到最大值，而蘋果酸含量在花后76 d達(dá)到最大值?！_江調(diào)元棗’中蘋果酸、檸檬酸和總酸含量呈現(xiàn)上升-下降的變化趨勢，蘋果酸和總酸含量在花后62 d達(dá)到最大值，而檸檬酸含量的最大值在花后55 d出現(xiàn)?！畧A形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’果實(shí)中酒石酸含量變化無明顯規(guī)律（圖1-C），而兩個(gè)品種果實(shí)中琥珀酸均從花后69 d開始積累（圖1-D）。

圖1 棗和酸棗果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期有機(jī)酸含量變化Figure 1 Changes of organic acid during development in jujube fruits

2.2 不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)中有機(jī)酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)分析

2.2.1 蘋果酸代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)分析

由圖2-A可知，‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’中MS的表達(dá)量隨著果實(shí)的發(fā)育急劇上調(diào)。圖2-B中‘圓形小酸棗’果實(shí)中FUM的表達(dá)呈上調(diào)趨勢，‘羅江調(diào)元棗’果實(shí)中FUM的表達(dá)則隨果實(shí)的發(fā)育逐漸上調(diào)但在果實(shí)成熟期下調(diào)。圖2-C～D中，‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’果實(shí)中PEPC1主要在果實(shí)發(fā)育前中期表達(dá)，后期則表達(dá)量較低，PEPC4的表達(dá)則隨著果實(shí)的發(fā)育逐漸上調(diào)，于成熟期表達(dá)量最高。圖2-E～H中，‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’果實(shí)中的MDH1、MDH4和MDH11的表達(dá)都隨著果實(shí)的發(fā)育呈上調(diào)趨勢，且在花后76～90 d表達(dá)量迅速上調(diào)。而‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’果實(shí)中MDH6的表達(dá)則隨著果實(shí)的發(fā)育逐漸下調(diào)。圖2-I～K中，‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’果實(shí)中NADP-ME1主要在幼果期有高表達(dá)，NADP-ME3和NADP-ME4的表達(dá)量變化呈“M”型。

圖2 棗和酸棗蘋果酸代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)分析Figure 2 The relative expression level of malic acid metabolism genes during developmental stages of jujube fruit

2.2.2 檸檬酸代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)分析

由圖3-A～D可知，‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’中CS1、CS3、Aco2-1和Aco4的表達(dá)隨著果實(shí)的發(fā)育逐漸上調(diào)。圖3-E～G中，‘圓形小酸棗’中NAD-IDH1-2的表達(dá)呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢，而NAD-IDH1-1和NAD-IDH5的表達(dá)則隨著果實(shí)的成熟而波動(dòng)上調(diào)。‘羅江調(diào)元棗’中NAD-IDH1-1和NAD-IDH1-2的表達(dá)都隨著果實(shí)的成熟先上調(diào)后下調(diào)，NAD-IDH5的表達(dá)則逐漸上調(diào)。圖3-H～J中，‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’中NADP-IDH1主要在果實(shí)成熟期表達(dá)。圖3-I中，‘圓形小酸棗’中NADP-IDH2隨著果實(shí)的成熟表達(dá)逐漸上調(diào)，‘羅江調(diào)元棗’中NADP-IDH2在花后20～76 d表達(dá)逐漸上調(diào)，76～90 d表達(dá)量下調(diào)。圖3-J中，‘圓形小酸棗’中NADP-IDH3的表達(dá)在花后20～69 d變化不大，花后69 d開始隨著果實(shí)的成熟逐漸上調(diào)；而‘羅江調(diào)元棗’中NADP-IDH3的表達(dá)量在花后69～83 d開始隨著果實(shí)的成熟迅速上調(diào)，花后90 d下調(diào)。

3 討論

3.1 棗和酸棗果實(shí)有機(jī)酸組分與含量

有機(jī)酸代謝是一個(gè)復(fù)雜的過程，自然環(huán)境[16]、栽培措施[17]和種質(zhì)[7]均可影響果實(shí)有機(jī)酸的積累與含量。本試驗(yàn)采用HPLC法檢測了棗和酸棗果實(shí)中的有機(jī)酸組分及含量，發(fā)現(xiàn)‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’果實(shí)的主要有機(jī)酸為蘋果酸和檸檬酸。趙愛玲等[7,18]用HPLC法檢測出酸棗果實(shí)中檸檬酸和蘋果酸含量相當(dāng)，而棗果實(shí)中蘋果酸含量最高，與本試驗(yàn)結(jié)果相似。隨著果實(shí)發(fā)育，‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’果實(shí)中蘋果酸占總酸的比例逐漸下降，檸檬酸占總酸的比例逐漸增大?；ê?0 d，‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’中檸檬酸含量分別是2.92和0.72 mg/g，蘋果酸含量分別是3.26和3.12 mg/g，由此可見‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’之間總酸含量的差異是由檸檬酸含量的差異造成的。

3.2 棗和酸棗果實(shí)酸代謝基因與有機(jī)酸組分含量之間的關(guān)系

果實(shí)生長發(fā)育過程中有機(jī)酸的合成與降解共同決定了果實(shí)中有機(jī)酸的含量[4,16]?；ê?0～69 d，‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’果實(shí)中PEPC4表達(dá)量變化與蘋果酸含量變化趨勢一致?！畧A形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’果實(shí)中FUM、PEPC4、MDH1、MDH4及MDH11在花后76～90 d皆有高表達(dá)，結(jié)合‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’果實(shí)中蘋果酸含量的變化推測，可能是FUM和PEPC4合成蘋果酸，MDH1、MDH4及MDH11降解蘋果酸達(dá)成平衡，從而導(dǎo)致花后76～90 d‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’果實(shí)中的蘋果酸含量變化不大。

Shi J.等[19]研究‘紅富士’蘋果果肉中PEPC的相對表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其與果實(shí)中蘋果酸含量呈正相關(guān)；但馬倩倩等[11]認(rèn)為在棗果實(shí)發(fā)育過程中ZjPEPC對酸棗中蘋果酸的代謝調(diào)控作用不大。張春梅等[10]推測MDH對于棗和酸棗中蘋果酸含量的增加起到一定的調(diào)節(jié)作用。根據(jù)NCBI上的Blast序列比對可知，MDH1主要定位在線粒體，MDH6主要定位在細(xì)胞質(zhì)中，而MDH4和MDH11主要定位在乙醛酸體中。而有機(jī)酸主要在線粒體中產(chǎn)生[20]，由此可推測，F(xiàn)UM和PEPC4在‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’合成蘋果酸中起關(guān)鍵作用，MDH1在‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’降解蘋果酸中起關(guān)鍵作用。

本研究中，‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’檸檬酸含量的差異是導(dǎo)致總酸含量存在差異的主要因素?；ê?0～69 d，‘圓形小酸棗’果實(shí)中CS1表達(dá)量變化與檸檬酸含量變化相似，而Aco2-1、NADIDH1-1及NAD-IDH1-2表達(dá)量變化與檸檬酸含量變化相反。而在花后76～90 d，‘圓形小酸棗’果實(shí)中檸檬酸含量的變化不大，這可能是由于在此期間CS1合 成檸 檬 酸 ，Aco2-1、NAD-IDH1-1、NADIDH1-2及NAD-IDH5降解檸檬酸達(dá)到了一個(gè)較為平衡的狀態(tài)。Zhang G.等[21]研究發(fā)現(xiàn)椪柑中CitAco1的下調(diào)表達(dá)和CitCS1、CitCS2的上調(diào)表達(dá)可能與檸檬酸積累有關(guān)，這與本文研究結(jié)果相似。‘羅江調(diào)元棗’果實(shí)中檸檬酸含量在花后20～55 d的上升可能是由于CS1在此期間表達(dá)逐漸上調(diào)；花后62～90 d‘羅江調(diào)元棗’果實(shí)中檸檬酸含量逐漸下降可能是由于NAD-IDH1-2在花后55～90 d表達(dá)迅速上調(diào)，且Aco2-1、NAD-IDH1-1及NAD-IDH5在花后76～90 d表達(dá)迅速上調(diào)所致。

G.A.M.Mauricio等[22]在番荔枝中的研究結(jié)果和Gao L.等[23]在西瓜中的研究結(jié)果都顯示CS的表達(dá)量可能決定了果實(shí)中檸檬酸的積累。張春梅[10]認(rèn)為CS3促進(jìn)了棗和酸棗果實(shí)中檸檬酸的積累。M.J.Morgan等[24]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因番茄中Aco的表達(dá)量顯著低于野生型，且轉(zhuǎn)基因植株成熟后果實(shí)中檸檬酸和蘋果酸含量均增加了50%。楊瀅瀅等[25]認(rèn)為臍橙果實(shí)中檸檬酸含量下降可能是由CitAco、CitIDH1和CitIDH3上調(diào)表達(dá)引起的。由此可以推測，CS1在‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’中合成檸檬酸起關(guān)鍵作用，而Aco2-1、NAD-IDH在‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’降解檸檬酸中起關(guān)鍵作用。結(jié)合檸檬酸含量與檸檬酸代謝相關(guān)基因表達(dá)量的變化可以得知栽培棗品種‘羅江調(diào)元棗’降解檸檬酸的能力高于‘圓形小酸棗’。

4 結(jié)論

本研究通過對棗和酸棗果實(shí)中的有機(jī)酸組分與含量進(jìn)行HPLC法測定，發(fā)現(xiàn)‘圓形小酸棗’以積累檸檬酸和蘋果酸為主，‘羅江調(diào)元棗’以積累蘋果酸為主。FUM和PEPC4是‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’合成蘋果酸的關(guān)鍵基因，MDH1是‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’降解蘋果酸的關(guān)鍵基因。CS1是‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’檸檬酸合成的關(guān)鍵基因；Aco2-1、NAD-IDH1-1、NAD-IDH1-2及NAD-IDH5是‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’檸檬酸降解的關(guān)鍵基因。檸檬酸降解基因的差異表達(dá)是導(dǎo)致‘圓形小酸棗’和‘羅江調(diào)元棗’有機(jī)酸含量出現(xiàn)較大差異的原因。