張 蕊

（南京市浦口區(qū)中醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 南京 211800）

圍絕經(jīng)期綜合征（perimenopausal syndrome）也稱為更年期綜合征。絕經(jīng)的本質(zhì)是卵巢功能的衰竭，而不是月經(jīng)的有無(wú)。圍絕經(jīng)期是從臨床表現(xiàn)、內(nèi)分泌激素及生物學(xué)上出現(xiàn)絕經(jīng)趨勢(shì)到最后一次月經(jīng)后1 年的特殊生理階段[1]。在這一時(shí)期，患者可能出現(xiàn)一系列表現(xiàn)為植物神經(jīng)功能紊亂、伴有神經(jīng)心理等改變的一組癥候群[2]；就診時(shí)常有諸多不適主訴，嚴(yán)重者影響其正常的工作、生活?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療手段主要包括飲食、運(yùn)動(dòng)及心理干預(yù)、激素替代治療及非激素類藥物治療（如安定、谷維素等）。激素替代治療有一定的適應(yīng)證及禁忌證，同時(shí)要注意隨訪管理，評(píng)估心血管、靜脈血栓、認(rèn)知功能、腫瘤等相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)與獲益情況[3]。中醫(yī)藥治療本病效果顯著，且安全性高。近年來相關(guān)中成藥亦開發(fā)頗多，六味地黃丸作為經(jīng)典方劑，臨床應(yīng)用廣泛，基于此，本研究主要通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，探討六味地黃丸通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療圍絕經(jīng)期綜合征的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 六味地黃丸中活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 通過TCMSP 平臺(tái)[4]檢索六味地黃丸中六味中藥（熟地黃、山藥、山茱萸、澤瀉、牡丹皮、茯苓）的化學(xué)成分，以口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，同時(shí)滿足類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 的2 個(gè)ADME 屬性值為篩選條件，獲取六味地黃丸中的活性化合物及相關(guān)靶點(diǎn)信息。

1.2 圍絕經(jīng)期綜合征相關(guān)靶點(diǎn)篩選 在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索“menopausal syndrome”潛在靶點(diǎn)信息，并進(jìn)入DRUGBANK 數(shù)據(jù)庫(kù)尋找治療圍絕經(jīng)期綜合征的西藥作用靶點(diǎn)加以補(bǔ)充。

1.3 六味地黃丸活性成分-圍絕經(jīng)期綜合征靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將六味地黃丸活性成分靶點(diǎn)與圍絕經(jīng)期綜合征靶點(diǎn)取交集并繪制韋恩圖。通過STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org）將所得二者交集靶點(diǎn)信息構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)模型[5]，設(shè)定生物種類為“Homo sapiens”，隱藏沒有連線的節(jié)點(diǎn)，所有設(shè)置均為默認(rèn)值，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)，并通過CytoScape3.7.1軟件進(jìn)行作圖，同時(shí)利用MCODE 插件對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步分析，得到潛在蛋白質(zhì)功能模塊。

1.4 六味地黃丸活性成分-圍絕經(jīng)期綜合征靶點(diǎn)功能于通路的富集分析 將六味地黃丸治療圍絕經(jīng)期綜合征靶點(diǎn)錄入MetaScape（http://metascape.org/gp/index.html）平臺(tái)[6]，設(shè)置P＜0.01，對(duì)其生物學(xué)過程及代謝通路進(jìn)行富集分析，將所得結(jié)果利用在線平臺(tái)微生信（http://www.bioinformatics.com.cn）作圖可視化。

1.5 六味地黃丸活性成分-圍絕經(jīng)期綜合征靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 運(yùn)用軟件CytoScape 3.7.1 構(gòu)建六味地黃丸活性成分-圍絕經(jīng)期綜合征靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，利用CytoScape 3.7.1 分析活性成分及靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，包括節(jié)點(diǎn)連接度（Degree）、介度（Betweenness Centrality）和緊密度（Closeness Centrality）等，結(jié)合上述參數(shù)判斷核心靶點(diǎn)及活性成分。

2 結(jié)果

2.1 六味地黃丸中活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)的獲取 在T CMSP 平臺(tái)經(jīng)ADME 篩選后獲得熟地黃2 種、山藥12種、山茱萸14 種、澤瀉7 種、牡丹皮5 種、茯苓6 種活性成分，合并后刪除重復(fù)值共獲得41 種六味地黃丸的活性成分，主要活性成分見表1。將其活性成分輸入TCMSP 平臺(tái)檢索得到經(jīng)uniprot 規(guī)范后的靶標(biāo)102 個(gè)。

表1 六味地黃丸部分活性成分表

2.2 圍絕經(jīng)期綜合征相關(guān)靶點(diǎn)的獲取 通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得圍絕經(jīng)期綜合征潛在靶點(diǎn)3325 個(gè)，在OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)檢所獲得潛在靶點(diǎn)623個(gè)，經(jīng)DRUGBANK 數(shù)據(jù)庫(kù)補(bǔ)充39 個(gè)，合并后去重最終獲得3902 個(gè)靶點(diǎn)。

2.3 六味地黃丸活性成分-圍絕經(jīng)期綜合征靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將六味地黃丸活性成分靶點(diǎn)與圍絕經(jīng)期綜合征靶點(diǎn)取交集后獲得交集靶點(diǎn)64 個(gè)。在STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫(kù)輸入二者交集靶點(diǎn)信息，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)模型，隱藏沒有連線的節(jié)點(diǎn)，下載TSV 文件導(dǎo)入CytoScape 3.7.1 作圖，六味地黃丸-圍絕經(jīng)期綜合征靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)見圖1。利用MCODE 插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步分析，獲得主要潛在核心模塊，見圖2。

圖1 六味地黃丸-圍絕經(jīng)期綜合征靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖2 PPI 網(wǎng)絡(luò)核心模塊

2.4 六味地黃丸活性成分-圍絕經(jīng)期綜合征靶點(diǎn)的富集分析 將交集靶點(diǎn)輸入MetaScape 數(shù)據(jù)平臺(tái)進(jìn)行GO 及KEGG 富集分析，所得數(shù)據(jù)輸入微生信網(wǎng)站進(jìn)行可視化，結(jié)果顯示多個(gè)靶點(diǎn)的功能參與圍絕經(jīng)期綜合征的治療。六味地黃丸主要參與的生物學(xué)過程包括細(xì)胞對(duì)有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)（cellular response to organic cyclic compound）、循環(huán)系統(tǒng)過程（circulatory system process）、對(duì)類固醇激素的反應(yīng)（response to steroid hormone）、神經(jīng)遞質(zhì)水平的調(diào)節(jié)（regulation of neurotransmitter levels）；參與KEGG通路主要有雌激素信號(hào)通路（estrogen signaling pathway）、內(nèi)分泌抵抗（endocrine resistance）、膽堿能突觸（cholinergic synapse）、血清素突觸（serotonergic synapse）等；相關(guān)靶點(diǎn)治療圍絕經(jīng)期綜合征的細(xì)胞成分有樹突（dendrite）、突觸后（postsynapse）、受體復(fù)合物（receptor complex）、過氧化物酶體（peroxisome）等；生物功能主要有核受體活性（nuclear receptor activity）、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性（postsynaptic neurotransmitter receptor activity）、兒茶酚胺結(jié)合（catecholamine binding）、激素結(jié)合（hormone binding）等，見圖3。

圖3 六味地黃丸治療圍絕經(jīng)期綜合征靶點(diǎn)富集分析

圖3 六味地黃丸治療圍絕經(jīng)期綜合征靶點(diǎn)富集分析（續(xù)）

2.5 六味地黃丸活性成分-圍絕經(jīng)期綜合征靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將所得成分、靶點(diǎn)、通路信息輸入CytoScape 3.7.1 構(gòu)建六味地黃丸成分-圍絕經(jīng)期綜合征靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，有163 個(gè)節(jié)點(diǎn)，461 條邊；通過CytoScape 3.7.1 內(nèi)置的NetworkAnalyzer 分析預(yù)測(cè)顯示，山奈酚為六味地黃丸治療圍絕經(jīng)期綜合征的主要成分，其次為β-谷甾醇、豆甾醇及四氫石氨酸等，見表2。NCOA2、PTGS2、PRKACA、PGR、PTGS1 為預(yù)測(cè)六味地黃丸治療圍絕經(jīng)期綜合征主要的靶點(diǎn)。根據(jù)連接度截取前10 位靶點(diǎn)信息見表3。

表2 六味地黃丸主要活性成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)參數(shù)

表3 六味地黃丸主要活性成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

3 討論

《素問·上古天真論》有云“女子七歲，腎氣盛，齒更發(fā)長(zhǎng)，二七天癸至，任脈通，太沖脈盛，月事以時(shí)下，……七七任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通”，此為中醫(yī)古籍中對(duì)于月經(jīng)的認(rèn)識(shí)，而絕經(jīng)前后諸證并無(wú)相對(duì)應(yīng)的病名，多根據(jù)其臨床表現(xiàn)的不同，歸屬于“百合病”“郁病”“臟躁”“汗證”范疇。因此，對(duì)于其病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)有多個(gè)不同角度的闡釋。腎藏先天之精，主生長(zhǎng)發(fā)育、生殖，主一身之陰陽(yáng)，故而從腎論治為基本大法。六味地黃丸系宋代醫(yī)家錢乙從《金貴要略》的腎氣丸加減而成。去溫陽(yáng)之桂、附，用治腎怯諸證。經(jīng)歷代醫(yī)家應(yīng)用，指出六味地黃丸主治肝腎不足，且有三陰并治之效。何若蘋[7]認(rèn)為圍絕經(jīng)期綜合征病機(jī)為腎陰不足，臨癥多選用六味地黃丸加減治療本病，靈活辨證加減運(yùn)用均有良好效果。胡桂梅[8]研究顯示，應(yīng)用六味地黃丸加減結(jié)合健康指導(dǎo)治療及僅應(yīng)用六味地黃丸加減治療的總有效率均大于70%。張改芝[9]研究顯示，經(jīng)六味地黃丸治療組總有效率達(dá)96.42%，明顯優(yōu)于對(duì)谷維素+維生素B1治療的62.50%。伍三妹等[10]研究顯示，六味地黃丸聯(lián)合谷維素治療組總有效率為84.5%，優(yōu)于尼爾雌醇對(duì)照組的75.2%。由此可見，六味地黃丸治療圍絕經(jīng)期綜合征有一定的理論基礎(chǔ)，且臨床療效良好。

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討六味地黃丸治療MPS 的作用機(jī)制，結(jié)果顯示山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、四氫石氨酸、卡舒勒酮、漢西酮C、常春藤素等活性成分為六味地黃丸治療圍絕經(jīng)期綜合征潛在成分。研究證實(shí)[11，12]，異黃酮、黃酮是植物雌激素，山奈酚屬于黃酮類化合物，是一種選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同濃度下的山奈酚可選擇性激動(dòng)雌激素受體。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[13]，山奈酚可抑制卵巢切除引起的骨質(zhì)減少大鼠模型的骨質(zhì)流失，改善骨質(zhì)疏松。β-谷甾醇和豆甾醇均為植物甾醇，屬于植物類固醇，研究發(fā)現(xiàn)[14]，植物甾醇可降低絕經(jīng)后女性心血管疾病及骨質(zhì)疏松風(fēng)險(xiǎn)。植物甾醇酯可改善膽堿能活性，對(duì)飲食誘導(dǎo)的認(rèn)知缺陷大鼠有神經(jīng)保護(hù)作用[15]。豆甾醇可以改善氯胺酮誘導(dǎo)的小鼠行為、生化和組織病理學(xué)改變，具有治療精神病癥狀方面的潛在作用[16]。四氫石氨酸是一種吲哚類生物堿，可選擇性拮抗α-2 腎上腺能受體拮抗劑，阻斷升壓反應(yīng)[17，18]。吲哚生物堿在尼日利亞用于治療精神疾病，與奧氮平有相當(dāng)?shù)目咕癫⌒Ч?，且具有抗焦慮作用[19，20]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示[21，22]，常春藤素具有抗抑郁活性成分，可保護(hù)小鼠免受卵巢切除術(shù)誘導(dǎo)的骨質(zhì)流失，改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松。以上研究結(jié)果表明六味地黃丸主要成分中含有植物雌激素可從病因出發(fā)治療圍絕經(jīng)期綜合征，同時(shí)可兼顧圍絕經(jīng)期女性其他系統(tǒng)疾病，如循環(huán)系統(tǒng)心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)、骨質(zhì)疏松、焦慮抑郁神經(jīng)系統(tǒng)癥狀等，體現(xiàn)了中藥復(fù)方通過多成分干預(yù)疾病的特點(diǎn)。

本研究篩選得到NCOA2、PTGS2、PRKACA、PGR、PTGS1、HSP90AA1、NR3C2、ADRB2、CHRM3、TP53 等為六味地黃丸治療圍絕經(jīng)期綜合征的核心靶點(diǎn)。NCOA2，也稱SRC-2，為核激素受體（包括類固醇、甲狀腺、類視黃醇和維生素D 受體）的轉(zhuǎn)錄共激活劑。核受體共激活劑家族包括3 個(gè)不同但功能和結(jié)構(gòu)相關(guān)的成員，即SRC-1/NcoA1、SRC-2/NCOA2/TIF2 和SRC-3/RAC3/。在SRC-2 基因缺失小鼠子宮的微陣列研究表明[23]，SRC-2 參與雌激素、Wnt 和骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）生長(zhǎng)因子信號(hào)通路的調(diào)節(jié)以及孕激素抑制的特定基因的表達(dá)。PTGS2，也稱COX2，PTGS1 為PTGS2 的旁系同源物，二者均為前列腺素合成的關(guān)鍵酶。前列腺素在調(diào)節(jié)分娩中起重要作用，研究發(fā)現(xiàn)[24，25]，COX 在排卵、受精、著床和蛻膜等生殖功能中具有重要作用，COX2 缺陷小鼠會(huì)出現(xiàn)不育、排卵及受精缺陷。雌激素的動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)作用是通過前列腺素Ⅰ2（PGⅠ2）的產(chǎn)生和COX2 的激活引起的，COX2 與雌激素的關(guān)系可解釋心臟病的性別差異及圍絕經(jīng)期女性心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)增加[26]。PRKACA 是cAMP 依賴性蛋白激酶催化亞基α，基因編碼蛋白激酶A 的催化亞基之一，大量的激素、神經(jīng)遞質(zhì)和其他信號(hào)物質(zhì)利用腺苷3',5'環(huán)磷酸腺苷（cAMP）作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，cAMP 參與許多不同的生理反應(yīng)，包括細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、神經(jīng)遞質(zhì)的突觸釋放和離子通道傳導(dǎo)等[27，28]。PGR 為孕激素受體，該基因編碼的蛋白質(zhì)介導(dǎo)孕酮的生理作用，在排卵前卵泡的顆粒細(xì)胞中被誘導(dǎo)以響應(yīng)LH 激增，并且已被證明對(duì)排卵至關(guān)重要[29]。NR3C2，也稱鹽皮質(zhì)激素受體MR，是PGR 的旁系同源物，二者及雄激素、糖皮質(zhì)激素受體均為NR3C 類的核激素受體，MR 主要介導(dǎo)醛固酮對(duì)鹽和水平衡的作用，與圍絕經(jīng)期高血壓及水腫癥狀有相關(guān)性。HSP90AA1為熱休克蛋白90Alpha Family A 類成員，該基因編碼的蛋白質(zhì)是一種可誘導(dǎo)的分子伴侶，參與諸多信號(hào)通路，維持著幾種核激素受體，如雌激素受體[30]。ADRB2、CHRM3 均為G 蛋白偶聯(lián)受體超家族的成員。在性腺切除的ADRB2 缺陷小鼠中，骨吸收無(wú)法增加，可見交感神經(jīng)信號(hào)的完整性對(duì)于性腺衰竭引起的骨吸收增加是必要的[31]。CHRM3 存在于全身的平滑肌、心肌、外分泌腺以及中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元中，研究發(fā)現(xiàn)[32]，CHRM3 對(duì)快速眼動(dòng)睡眠至關(guān)重要。

KEGG 富集分析結(jié)果顯示，六味地黃丸主要通過雌激素信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗、膽堿能突觸、血清素突觸等信號(hào)通路治療圍絕經(jīng)期綜合征。雌激素可調(diào)節(jié)月經(jīng)周期和生殖、骨密度、腦功能、膽固醇動(dòng)員、乳房組織和性器官的發(fā)育以及控制炎癥。雌激素信號(hào)通路主要負(fù)責(zé)控制女性生殖系統(tǒng)的功能，以及在青春期和性成熟期間出現(xiàn)的第二性征的發(fā)育[33]。乙酰膽堿作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)、神經(jīng)節(jié)和神經(jīng)肌肉接頭的膽堿能突觸的遞質(zhì)，膽堿能突觸對(duì)記憶功能、成癮、焦慮和情緒調(diào)節(jié)至關(guān)重要[34]。血清素（5-HT）介導(dǎo)的調(diào)節(jié)活動(dòng)會(huì)影響大腦的各種功能，包括工具性和認(rèn)知性，其與精神疾病的病理生理學(xué)有關(guān)，例如精神分裂癥、抑郁癥、廣泛性焦慮癥、恐慌癥和強(qiáng)迫癥等[35，36]。上述報(bào)道側(cè)面說明了本研究預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性。

綜上所述，本研究篩選出的多個(gè)靶點(diǎn)及其生物學(xué)進(jìn)程、信號(hào)通路均與圍絕經(jīng)期綜合征生理病理變化密切相關(guān)。六味地黃丸中的多個(gè)活性成分，作用于多個(gè)靶點(diǎn)，通過多種信號(hào)通路干預(yù)圍絕經(jīng)期綜合征。本研究初步探討了六味地黃丸治療圍絕經(jīng)期綜合征的作用機(jī)制，因中藥復(fù)方成分復(fù)雜，同一靶點(diǎn)富集于多個(gè)通路，具有多種生物功能，是否存在競(jìng)爭(zhēng)或協(xié)同機(jī)制尚不明確，仍有待進(jìn)一步研究。