楊春華，時潔，唐鳳，王婧，張震

（1.恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院，湖北 恩施 445000；2.河西學(xué)院附屬張掖人民醫(yī)院，甘肅 張掖 734000）

人皮膚鱗狀細(xì)胞癌（Cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC）主要發(fā)生于人體皮膚的鱗狀上皮組織，是我國常見的皮膚惡性腫瘤之一[1]。盡管很少致命，但cSCC通過功能障礙、損害容貌以及由此導(dǎo)致的社會心理問題嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量。且cSCC多發(fā)于60歲及以上的人群中，隨著老年人口的增加cSCC發(fā)病率會迅速增加[2]。因此，cSCC對醫(yī)療保健成本的影響越來越大。cSCC的一般治療選擇包括手術(shù)、放療和化療等。然而，cSCC的預(yù)后，特別是對于那些患有晚期疾病的患者，效果并不令人滿意[3]?；诖?，開發(fā)用于治療cSCC的新穎有效的藥物有重大意義。

中草藥重樓有退熱解毒、消腫止痛、養(yǎng)肝定驚等作用，在中醫(yī)中已用于多種疾病治療[4]?，F(xiàn)代藥理表明重樓的化學(xué)成分包括甾體皂苷、植物蛻皮激素、植物甾醇、類黃酮和脂肪酸酯等[5]。有研究表明，甾體皂苷是重樓發(fā)揮各種藥理作用的主要生物活性成分[6]。目前，已經(jīng)從重樓中分離并鑒定116種甾體皂苷。其中重樓皂苷Ⅶ（Polyphyllin Ⅶ，PP Ⅶ）有抗炎、抗癌活性，已在多種癌癥類型中表現(xiàn)出強(qiáng)大的抑癌作用，如結(jié)腸癌[7]、肺癌[8]和膠質(zhì)瘤等[9]。但其在cSCC中的作用及機(jī)制尚不明確，因此本研究通過構(gòu)建cSCC裸鼠模型，觀察PP Ⅶ對移植瘤的影響并探討其作用機(jī)制，為cSCC新型治療方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料 8～10周齡無特定病原（SPF）級白變種實(shí)驗(yàn)室老鼠（BALB/c）雌性裸鼠購買自中國科學(xué)院上海藥物研究所[SCXK（滬）2019-0001]；cSCC A431細(xì)胞株購買自中國上海中科院細(xì)胞庫；PP Ⅶ購買自美國 Sigma Aldrich；原位末端標(biāo)記技術(shù)（TUNEL）試劑盒購買自上海博耀生物科技有限公司；Ki67、血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）免疫組化試劑盒購買自上海谷研實(shí)業(yè)有限公司；洛斯維·帕克紀(jì)念研究所研發(fā)的培養(yǎng)基（RPMI）1640、胰蛋白酶購買自美國 Gibco；胎牛血清購買自以色列BI；天冬氨酸特異性蛋白酶 3（Caspase-3，66470-2-Ig）、切割后（cleaved）-Caspase-3（66520-1-Ig）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2，60178-1-Ig）、Bcl-2 相關(guān) X 蛋白 （Bax，60267-1-Ig）、Notch1（20687-1-AP）、發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)字-1（Hes-1，10597-1-AP）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，60004-1-Ig）抗體購買自美國Proteintech Group公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取出低溫凍存A431細(xì)胞，置于37℃水浴條件下融化，凍存液部分溶解時取出，在無菌操作臺下吸取凍存液加入適量培養(yǎng)基混勻后離心去上清液，加入適量添加有10% 胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，于37℃、5% 二氧化碳（CO2）濃度條件下恒溫培養(yǎng)。顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶80% ～90% 時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。加入適量0.25% 胰蛋白酶對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行消化處理3～5min，用完全培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)，重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，以RPMI1640培養(yǎng)基稀釋至1×108個/mL備用。

1.2.2 裸鼠移植瘤模型構(gòu)建 25只裸鼠適應(yīng)性培養(yǎng) 1 周后，將 100 μL A431 細(xì)胞懸液（1×108個/mL）接種于裸鼠右側(cè)腋窩皮下，接種1周后，接種部位明顯瘤狀隆起視為造模成功。接種2周后，將造模成功的裸鼠隨機(jī)分為對照組、PP Ⅶ0.5、1、2 mg/kg組、陽性對照氟尿嘧啶（5-FU）10 mg/kg組，每組各5只。按照組別對應(yīng)分別給予腹腔注射0.5、1、2mg/kg PP Ⅶ或10 mg/kg 5-FU，對照組腹腔注射等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)注射30 d。藥物劑量選擇依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[10]。分別與藥物注射后 5、10、15、20、25、30 d使用游標(biāo)卡尺測量移植瘤最長徑（L，mm）與最短徑（S，mm），根據(jù)公式 V（mm3）=L×S2×π/6計(jì)算體積。30 d后處死裸鼠，取出移植瘤檢測移植瘤質(zhì)量。

1.2.3 TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡 對各組移植瘤進(jìn)行常規(guī)固定包埋，切片，脫蠟后使用二甲苯浸洗2次，5 min/次；使用梯度濃度乙醇（100、95、90、80、70%）依次浸洗3 min；加入適量蛋白酶K室溫孵育30 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2次；按 TUNEL試劑盒說明書混合各試劑，加入50 μL TUNEL混合反應(yīng)液于玻片標(biāo)本上，置于濕盒中37℃反應(yīng)1 h，PBS清洗3次；濾紙吸干水分，加入50 μL converter-POD于玻片標(biāo)本上，置于濕盒中37℃反應(yīng)30 min，PBS清洗3次；濾紙吸干水分，加入50～100 μL二氨基聯(lián)苯胺（DAB），室溫反應(yīng)10 min，PBS清洗3次；加入蘇木素復(fù)染，幾秒后流水充分沖洗，脫水、透明、封片。結(jié)果判定：細(xì)胞核為棕黃色即為凋亡細(xì)胞，每切片隨機(jī)取400倍顯微鏡視野5個，分別對凋亡細(xì)胞及總細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=（凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100% 。

1.2.4 免疫組化檢測Ki67、VEGF 各組移植瘤切片常規(guī)脫蠟水化，細(xì)胞通透液浸潤玻片30 min，PBS清洗3次；將玻片放入0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH6.0）中微波修復(fù)抗原，PBS清洗3次；加入3% 過氧化氫（H2O2）溶液孵育30 min以阻斷內(nèi)源性過氧化酶，PBS清洗3次；加入5% 血清（與二抗來源一致）置于濕盒中室溫封閉20 min；濾紙吸干血清，加入50 μL適當(dāng)比例稀釋Ki67、VEGF一抗，4℃孵育過夜，PBS清洗5次；加入二抗室溫孵育30 min～1 h，PBS清洗5次；滴加過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素（SP）室溫孵育30 min～1 h，PBS清洗5次；濾紙吸干水分，加入50～100 μL DAB，室溫反應(yīng)10 min，PBS清洗3次；加入蘇木素復(fù)染，幾秒后流水充分沖洗，脫水、透明、封片。免疫組化結(jié)果判定：細(xì)胞內(nèi)有棕黃色顆粒即為蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞，每切片隨機(jī)取400倍顯微鏡視野5個，分別對陽性細(xì)胞及總細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞率。陽性細(xì)胞率=（陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100% 。

1.2.5 蛋白免疫印跡（WB）法檢測蛋白表達(dá)水平 提取各組移植瘤蛋白，按照聚氰基丙烯酸正丁酯（BCA）法使用試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度；根據(jù)測量濃度加入相應(yīng)體積的待測樣品于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）中，以25 mA恒定電流電泳1～2 h；將凝膠轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，浸入封閉液中2 h，用Tris緩沖鹽溶液+Tween 20（TBST）清洗膜3次，3 min/次；加入適當(dāng)比例稀釋的Caspase-3、Bax、Bcl-2、Notch1、Hes-1 蛋白一抗，4 ℃孵育過夜，TBST清洗膜3次；加入對應(yīng)濃度二抗，室溫孵育2 h，TBST清洗膜3次；避光加入ECL發(fā)光染色，使用凝膠成像儀進(jìn)行成像分析。采用TotalLab2.0進(jìn)行灰度分析，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料以（±s）表示，2組比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PP Ⅶ抑制cSCC移植瘤生長 藥物注射30 d后，與對照組相比，隨著PP Ⅶ注射劑量的增加，移植瘤逐漸變小并接近5-FU10mg/kg組水平，見圖1A；PP Ⅶ1、2 mg/kg組、5-FU 10 mg/kg組移植瘤質(zhì)量、體積顯著低于對照組（P＜0.05），見圖1B、C。隨著PP Ⅶ注射劑量的增加和注射時間的延長，cSCC移植瘤生長曲線越加平緩；與對照組相比，各PP Ⅶ組移植瘤生長受到不同程度的抑制，且PP Ⅶ2 mg/kg組抑制作用最明顯并接近5-FU 10 mg/kg組水平，見圖1C。

圖1 PP Ⅶ抑制cSCC移植瘤生長

2.2 PP Ⅶ誘導(dǎo)cSCC移植瘤細(xì)胞凋亡 TUNEL染色結(jié)果表明，藥物注射30 d后，對照組棕黃色凋亡細(xì)胞較少，隨著PP Ⅶ注射劑量的增加，棕黃色凋亡細(xì)胞逐漸增多并接近5-FU 10 mg/kg組水平，見圖2A；PP Ⅶ 1、2 mg/kg組、5-FU 10 mg/kg組細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組（P＜0.05），見圖2B。

圖2 PP Ⅶ誘導(dǎo)cSCC移植瘤細(xì)胞凋亡

2.3 蛋白印跡法檢測各組移植瘤Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平 蛋白印跡結(jié)果顯示，隨著PP Ⅶ注射劑量的增加，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)量逐漸增加，Bcl-2蛋白表達(dá)水平逐漸降低并接近5-FU 10 mg/kg組水平，見圖3A；PP Ⅶ 1、2 mg/kg組、5-FU 10 mg/kg組Bax/Bcl-2值和cleaved Caspase-3/Caspase-3值顯著高于對照組（P＜0.05），見圖3B。

圖3 各組移植瘤Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平

2.4 免疫組化檢測各組cSCC移植瘤細(xì)胞Ki67、VEGF蛋白表達(dá)情況 免疫組化結(jié)果顯示，對照組有大量含有棕黃色顆粒細(xì)胞，Ki67、VEGF蛋白陽性表達(dá)率較高，隨著PP Ⅶ注射劑量的增加，Ki67、VEGF蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量逐漸減少并接近5-FU 10 mg/kg組水平，見圖4A、C；PP Ⅶ 1、2 mg/kg組、5-FU 10 mg/kg組Ki67、VEGF蛋白陽性細(xì)胞率顯著低于對照組（P＜0.05），見圖4B、D。

圖4 各組移植瘤細(xì)胞Ki67、VEGF蛋白表達(dá)情況

2.5 WB法檢測各組移植瘤Notch1、Hes-1蛋白表達(dá)水平 蛋白印跡結(jié)果顯示，隨著PP Ⅶ注射劑量的增加，Notch1、Hes-1蛋白表達(dá)量逐漸增加，見圖5A；PP Ⅶ 1、2 mg/kg組、5-FU 10 mg/kg組 Notch1、Hes-1蛋白表達(dá)量顯著高于對照組（P＜0.05），見圖5B。

圖5 各組移植瘤Notch1、Hes-1蛋白表達(dá)水平

3 討論

作為第二大最常見的皮膚癌，cSCC是一種高度流行的惡性腫瘤，在大多數(shù)情況下，可通過手術(shù)切除來治愈。但是，約3% 的患者會發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，顯著降低患者5年生存率[11]，因此探索新的治療藥物有重要意義。近年來，PP Ⅶ的抗癌作用與機(jī)制已在多種癌癥研究中報道。本研究通過構(gòu)建cSCC裸鼠移植瘤模型，對各組移植瘤體積、質(zhì)量、生長情況進(jìn)行觀察比較，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，PP Ⅶ各組移植瘤生長速度、質(zhì)量、體積顯著降低，說明使用PP Ⅶ能在一定程度上抑制cSCC移植瘤的生長，并且這種抑制作用隨PP Ⅶ用藥劑量增加而加強(qiáng)；同時，PP Ⅶ2 mg/kg組與5-FU 10 mg/kg組移植瘤大小、質(zhì)量相近，表明高劑量PP Ⅶ的抑癌作用已與5-FU相當(dāng)。

惡性腫瘤較強(qiáng)的抗凋亡能力和促增殖能力是其發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。Zhang等[12]證明PP Ⅶ能通過觸發(fā)線粒體介導(dǎo)的ROS生成以及激活MAPK和PTEN/p53途徑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。Lin等[13]報道PP Ⅶ通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯并觸發(fā)凋亡，對肺癌細(xì)胞生長表現(xiàn)出強(qiáng)抑制作用。本研究通過TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示隨著PP Ⅶ注射劑量的增加，細(xì)胞凋亡率增加，PP Ⅶ1、2 mg/kg組、5-FU 10 mg/kg組細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組，且PP Ⅶ2 mg/kg組與5-FU 10 mg/kg組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Bax、Bcl-2是調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，但二者生理功能相反，Bax促凋亡，Bcl-2抗凋亡。Bax、Bcl-2蛋白水平比例能反應(yīng)細(xì)胞凋亡狀況，Bax/Bcl-2值越高，細(xì)胞凋亡發(fā)生率越高[14]。Caspase-3是內(nèi)源性和外源性凋亡途徑必須的關(guān)鍵蛋白，其可在上游信號分子作用下裂解生成有活性的cleaved Caspase-3，進(jìn)而降解多種蛋白并在細(xì)胞凋亡過程中形態(tài)改變和DNA斷裂中起到作用[15]。在本研究中WB結(jié)果顯示，隨著PP Ⅶ注射劑量的增加，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)量逐漸增加，Bcl-2蛋白表達(dá)水平逐漸降低，PP Ⅶ 1、2 mg/kg組、5-FU 10 mg/kg組Bax/Bcl-2值和cleaved Caspase-3/Caspase-3值顯著高于對照組，且PP Ⅶ2 mg/kg組與5-FU 10 mg/kg組Bax/Bcl-2值和cleaved Caspase-3/Caspase-3值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ki67是一種核蛋白，可指示細(xì)胞增殖的程度。cSCC的預(yù)后與高水平的Ki67表達(dá)活性之間存在顯著關(guān)聯(lián)[16]。另一方面，腫瘤血管形成在腫瘤形成過程中起著重要作用，對于腫瘤的進(jìn)展和實(shí)體瘤的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散至關(guān)重要。VEGF被認(rèn)為是腫瘤血管生成過程中最重要的血管生成調(diào)節(jié)因子之一[17]。本研究中，免疫組化結(jié)果顯示，隨著PP Ⅶ注射劑量的增加，Ki67、VEGF蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，PP Ⅶ 1、2 mg/kg組、5-FU 10 mg/kg 組Ki67、VEGF蛋白陽性細(xì)胞率顯著低于對照組，且PP Ⅶ 2 mg/kg組與 5-FU 10 mg/kg組 Ki67、VEGF蛋白陽性細(xì)胞率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果表明PP Ⅶ有促進(jìn)cSCC細(xì)胞凋亡和抑制cSCCA細(xì)胞增殖的能力，并且作用效果隨劑量增加而加強(qiáng)，高劑量條件下促凋亡和抗增殖效果與5-FU相當(dāng)。

Notch信號傳導(dǎo)是細(xì)胞內(nèi)通訊的一種重要形式，在細(xì)胞分化、生存、增殖中起著關(guān)鍵作用[18]。在角質(zhì)形成細(xì)胞中，其誘導(dǎo)分化并抑制腫瘤的發(fā)展，其在角質(zhì)形成細(xì)胞中的缺失會增強(qiáng)對皮膚癌形成的敏感性[19]。而Notch通路激活能促進(jìn)cSCC細(xì)胞凋亡和抑制cSCC細(xì)胞增殖[20]。Notch受體被配體激活后，γ-分泌酶會對Notch的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行切割，細(xì)胞內(nèi)裂解的Notch易位至細(xì)胞核，與DNA結(jié)合蛋白RBP-J形成復(fù)合物，并激活許多靶基因的轉(zhuǎn)錄，包括Hes轉(zhuǎn)錄因子家族[21]。Hes-1在Notch1信號調(diào)控下，與相應(yīng)的靶基因結(jié)合，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)而發(fā)揮生理功能。在本研究中，隨著PP Ⅶ注射劑量的增加，Notch1、Hes-1蛋白表達(dá)量逐漸增加，表明PP Ⅶ能激活Notch1/Hes-1通路，促進(jìn)cSCC細(xì)胞凋亡。

綜上所述，PP Ⅶ能促進(jìn)cSCC細(xì)胞凋亡，抑制cSCC細(xì)胞增殖，這可能與其能激活Notch1/Hes-1信號通路有關(guān)，突出表明PP Ⅶ用于cSCC治療的潛在價值。