姚俊廣 耿 婭 劉依靜 安 軼 黃李超 曾 為 盧孟柱

(浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室 杭州 311300)

我國森林覆蓋率低，木材蓄積量低。作為木制品消費大國，木材供應(yīng)嚴(yán)重不足。隨著經(jīng)濟的發(fā)展，木材需求量日益增多。20世紀(jì)末至21世紀(jì)初，我國營造了超過1 000萬hm2的速生林基地，成為世界上人工林面積最大的國家(主楚杰等， 2015)。楊樹(Populus)作為重要的速生人工林樹種，已成為解決木材供需矛盾的重要途徑。我國大約有50%以上的地區(qū)屬于干旱或半干旱，其中半干旱地區(qū)的人工造林成活率約為 30%，而干旱區(qū)僅為4%(黃榮輝等， 2012)。干旱已經(jīng)成為嚴(yán)重阻礙各地區(qū)林業(yè)發(fā)展以及改善生態(tài)環(huán)境的重要因素之一，了解樹種對干旱脅迫響應(yīng)以及如何提高其抗逆性具有至關(guān)重要的意義。楊樹人工林在干旱、半干旱地區(qū)的發(fā)展，依賴于抗逆品種。

脅迫條件下，植物能夠做出相應(yīng)的防御機制，包括形態(tài)調(diào)節(jié)以及生理生化反應(yīng)(Pandeyetal., 2015)。Todorova等(2015)研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源多胺含量升高是植物響應(yīng)脅迫反應(yīng)之一，對植物的抗逆性具有至關(guān)重要的作用。多胺作為一類帶正電荷的脂肪族類化合物，普遍存在于動植物體內(nèi)(Taboretal., 1984)，可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂(Evansetal., 1989)、果實成熟(Guoetal., 2018)等植物發(fā)育過程，也可響應(yīng)低溫、干旱等脅迫途徑(Liuetal., 2015)。高等植物的多胺主要分為腐胺(Put)、亞精胺(Spd)、精胺(Spm)、以及熱精胺(T-spm)4類(Takanoetal., 2012)。腐胺和亞精胺是最常見的多胺，精胺主要存在于種子植物、多數(shù)動物和一些細(xì)菌中(Peggetal., 2010)，而熱精胺存在于整個植物界中(Eugenioetal., 2008)。多胺的合成途徑受多種相關(guān)酶的催化，其合成過程主要有2種： 以鳥氨酸(ornithine, Orn)為底物，在鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase, ODC)催化下，將鳥氨酸直接轉(zhuǎn)化為腐胺的直接途徑； 以精氨酸(arginine，Arg)為底物，在精氨酸脫羧酶(arginine decarboxylase, ADC)催化以及經(jīng)N-氨甲酰腐胺脫去一分子氨，生成腐胺的間接途徑。而腐胺能夠作為亞精胺、精胺生物合成途徑的主要前體。在亞精胺合成酶(spermidine synthases, SPDS)的催化下生成亞精胺，亞精胺在精胺合成酶(spermine synthases, SPMS)以及熱精胺合成酶(thermospermine synthases, TSPMS)催化下分別生成精胺和熱精胺(Walters, 2003; Tiburcioetal., 2014)。在合成亞精胺和精胺途徑上，S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)在S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase，SAMDC)催化下，生成脫羧后的S-腺苷甲硫氨酸(decarboxylated S-adenosylmethionine, dcSAM)，提供亞精胺和精胺合成所需要的氨丙基，成為多胺合成途徑上重要的限速步驟(Huetal., 2005)。

施加外源多胺，可以保護植物免受脅迫損傷。干旱脅迫下，對植株葉片噴施腐胺能夠有效改善植株水分狀況，提高植物的生物量，增強干旱脅迫耐受性 (Guptaetal., 2012; Hussainetal., 2013; Zhuetal., 2019)。內(nèi)源提高多胺相關(guān)酶基因的表達水平，可進一步證明多胺對于非生物脅迫的適應(yīng)性(Pathaketal., 2014; Shietal., 2014; Liuetal., 2015)。在鹽脅迫下，過表達SAMDC可使水稻(Oryzasativa)生物量增加，內(nèi)源Spd、Spm的積累提高了抗脅迫能力(Royetal., 2002)。甜菜(Betavulgaris)M14-SAMDC基因異源轉(zhuǎn)化擬南芥(Arabidopsisthaliana)，擬南芥Spd和Spm含量增加，植株表現(xiàn)出強耐鹽性(Jietal., 2019)； 干旱脅迫下，辣椒(Capsicumannuum)CaSAMDC異源轉(zhuǎn)化擬南芥，其過表達CaSAMDC植株亞精胺、精胺含量顯著升高，植株耐旱性顯著增強(Sooetal.， 2014)。因此，通過改變植物中精胺含量，可以調(diào)控植物的抗逆性。

楊樹作為多年生木本植物，其生長發(fā)育長期受到各種脅迫的制約，研究其抗逆機制具有重要意義。本研究以PagSAMDC4a轉(zhuǎn)基因銀腺楊84K(Populusalba×P.glandulosa‘84K’)作為試驗材料，研究其在干旱條件下生長發(fā)育的變化，進一步分析脅迫條件下植株內(nèi)源多胺水平差異，系統(tǒng)地揭示楊樹內(nèi)源性多胺在干旱脅迫反應(yīng)中的重要作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

銀腺楊84K為筆者試驗室保存，干旱脅迫處理所用過表達PagSAMDC4a株系為試驗室前期研究所獲得，經(jīng)定量PCR檢測后選取過表達PagSAMDC4a轉(zhuǎn)基因銀腺楊3個株系(PagSAMDC4a-OE#3、PagSAMDC4a-OE#15、PagSAMDC4a-OE#17)進行研究。組培苗生長1個月后進行土培，在裝有混合基質(zhì)(泥炭︰蛭石︰珍珠巖體積比為3︰9︰1)的育苗盆培養(yǎng)3個月，培養(yǎng)條件為： 溫度23～25 ℃，相對濕度60%，光周期16 h光照/ 8 h黑暗，光照強度50 μmol · m-2s-1。

1.2 干旱脅迫處理

以生長3個月的未轉(zhuǎn)基因銀腺楊84K及其過表達PagSAMDC4a轉(zhuǎn)基因株系為材料，設(shè)置對照組和干旱脅迫組。對照組保持充分水量，確保育苗盆中混合基質(zhì)的水分含量保持在約70%； 干旱脅迫組模擬自然干旱的模式，處理時間為6天，土壤含水量降至約25%，未轉(zhuǎn)基因84K楊葉片出現(xiàn)嚴(yán)重枯萎現(xiàn)象。觀測植株的生長狀況并取材進行相關(guān)指標(biāo)的測定。

1.3 干旱脅迫下相關(guān)指標(biāo)的測定

在干旱處理第6天，分別取未轉(zhuǎn)基因銀腺楊84K和過表達PagSAMDC4a植株葉片，測定相關(guān)指標(biāo)。

1.3.1 內(nèi)源多胺含量 取未轉(zhuǎn)基因植株、過表達PagSAMDC4a植株由上至下第4和第5片葉片測定多胺含量(林紹艷等， 2016)。具體步驟： 配制腐胺、亞精胺、精胺標(biāo)準(zhǔn)品； 樣品加入5%高氯酸浸提以及后續(xù)樣品、標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化處理； 使用超高效液相色譜儀(UPLC)進行多胺含量測定，選用色譜柱Poroshell 120 EC-C18(150 mm×3.0 mm×2.7 μm)，設(shè)置參數(shù)： 流動相乙腈和水(體積比40︰60),流速為0.5 mL·min-1，檢測波長為230 nm，進樣體積為5 μL； 同時測定標(biāo)準(zhǔn)品腐胺(Put)、亞精胺(Spd)、精胺(Spm)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(表1)。

表1 多胺測定的回歸方程和相關(guān)系數(shù)①

1.3.2 過氧化氫(H2O2)含量 取植株由上至下第1～3片葉片，參考H2O2檢測方法(Leietal., 2013)，選用H2O2檢測試劑盒(A064-1-1)、蛋白定量(TP)測定試劑盒(A045-2)(南京建成生物工程研究所)，測定樣品蛋白濃度(考馬斯亮藍測定法)以及H2O2與鉬酸作用形成的絡(luò)合物在波長405 nm處吸光值，計算H2O2含量： H2O2含量(mmol·g-1prot)=(測定OD值-空白OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(163 mmol·L-1)÷待測樣品蛋白濃度(g prot·L-1)。

1.3.3 葉片相對含水量 取正常情況以及干旱脅迫處理的未轉(zhuǎn)基因銀腺楊84K、過表達PagSAMDC4a植株的由上至下第7片葉片測定含水量。首先取下新鮮的葉片后立即稱量葉片的鮮質(zhì)量(FW)，而后把葉片浸沒于水中室溫放置24 h后稱量葉片浸水后的質(zhì)量(TW)。再將新鮮葉片放置在80 ℃恒溫干燥箱里干燥72 h后，稱量葉片的干質(zhì)量(DW)。計算葉片相對含水量(Heetal., 2018)： (FW-DW)/(TW-DW)×100%。

1.3.4 葉片失水率 取正常情況下未轉(zhuǎn)基因銀腺楊84K、過表達PagSAMDC4a植株由上至下第8片葉片，分別稱取葉片的鮮質(zhì)量(FW)，每隔0.5 h稱量1次(desiccated weight)，總時間為4.5 h。最后將葉片放置80 ℃烘箱里烘干過夜，稱其干質(zhì)量(DW)。計算葉片失水率(Boetal., 2017)： 葉片失水率(%)=(FW-desiccated weight)/(FW-DW)×100%。

1.3.5 電解質(zhì)滲透率 取正常情況以及干旱脅迫下的未轉(zhuǎn)基因銀腺楊84K、過表達PagSAMDC4a植株由上至下第6片葉片測定電解質(zhì)滲透率。首先用去離子水清洗葉片，經(jīng)濾紙擦干葉片表面后，使用打孔器打出10片小圓片放入裝有2 mL ddH2O的離心管中，完全浸泡并真空抽濾10 min后，向離心管中加入6 mL ddH2O，室溫放置200 r·min-1搖床中振蕩1 h，測其電導(dǎo)率為S1； 將離心管放置90 ℃水浴20 min，待溶液冷卻至室溫后充分搖勻，測定其電導(dǎo)率為S2。計算電解質(zhì)滲透率(%)=(S1/S2)×100%。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗均進行10次生物學(xué)重復(fù)，樣本數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)處理軟件進行獨立樣本t檢驗，在0.01水平上檢驗差異顯著性，并用Excel或GraphPad prism8進行數(shù)據(jù)分析、圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 PagSAMDC4a轉(zhuǎn)基因銀腺楊84K內(nèi)源多胺含量

經(jīng)定量PCR分析，銀腺楊84K轉(zhuǎn)基因株系PagSAMDC4a-OE#3、PagSAMDC4a-OE#15、PagSAMDC4a-OE#17的基因表達量均顯著高于未轉(zhuǎn)基因植株，且基因表達量依次由低到高(圖1A)。測定轉(zhuǎn)基因株系和未轉(zhuǎn)基因植株的內(nèi)源多胺含量(圖1B)，采用UPLC測定多胺標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色譜圖(圖1C、D)，根據(jù)不同的標(biāo)準(zhǔn)品濃度、色譜峰面積計算標(biāo)準(zhǔn)曲線(表1)。在水分正常情況下，3個轉(zhuǎn)基因株系的內(nèi)源亞精胺、精胺含量都顯著高于未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?，其中PagSAMDC4a-OE#17株系的內(nèi)源腐胺、亞精胺、精胺含量分別是未轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?.95、3.43、1.32倍(表2)。

2.2 干旱脅迫下PagSAMDC4a轉(zhuǎn)基因銀腺楊84K葉片相關(guān)生理指標(biāo)

干旱脅迫影響植株的生長發(fā)育，且在葉片表型方面尤其明顯。正常水分條件下，與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，過表達PagSAMDC4a植株的葉片表型(圖2A)、葉片相對含水量(圖2B)、電解質(zhì)滲透率(圖2C)并無顯著差異，但葉片失水較慢，失水率由高到低為未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?、PagSAMDC4a-OE#3、PagSAMDC4a-OE#15、PagSAMDC4a-OE#17(圖2 D)。在干旱脅迫下，未轉(zhuǎn)基因植株表型出現(xiàn)明顯變化，葉片嚴(yán)重萎蔫下垂，表現(xiàn)對干旱脅迫的敏感性； 而過表達PagSAMDC4a植株葉片出現(xiàn)不同程度的響應(yīng)，PagSAMDC4a-OE#3植株葉片輕度萎蔫，PagSAMDC4a-OE#15、PagSAMDC4a-OE#17植株葉片生長狀況正常，表現(xiàn)出了耐旱性(圖2A)。同時測定葉片相對含水量、電解質(zhì)滲透率等相關(guān)指標(biāo)后發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下，未轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏娜~片相對含水量比正常供水條件下降低26.44%(圖2B)，電解質(zhì)滲透率升高27.68%(圖2C)； 而PagSAMDC4a-OE#3、PagSAMDC4a-OE#15、PagSAMDC4a-OE#17植株葉片相對含水量比正常供水條件下分別降低10.9%、3.66%、1.33%(圖2B)，電解質(zhì)滲透率與正常供水條件下無顯著差異(圖2C)。過表達PagSAMDC4a植株電解質(zhì)滲透率較低、變化幅度較小，葉片的相對含水量較高，并與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹町愶@著，表明其抗旱性明顯加強。

2.3 干旱脅迫下PagSAMDC4a轉(zhuǎn)基因銀腺楊84K葉片內(nèi)源H2O2含量

為驗證干旱脅迫下84K楊植株氧化損傷情況，測定正常供水及干旱脅迫下植株葉片的H2O2含量(圖3)。在正常供水條件下，相比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?，轉(zhuǎn)基因植株的H2O2含量顯著降低，H2O2含量由高到低依次為未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?>PagSAMDC4a-OE#3 >PagSAMDC4a-OE#15 >PagSAMDC4a-OE#17。干旱脅迫6天后，未轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏腍2O2含量顯著升高，而過表達PagSAMDC4a植株H2O2含量增加幅度顯著低于對照，含量由高到低為未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?>PagSAMDC4a-OE#3 >PagSAMDC4a-OE#15 >PagSAMDC4a-OE#17。以上結(jié)果表明過表達PagSAMDC4a明顯增強了轉(zhuǎn)基因84K楊的抗旱性。

圖1 PagSAMDC4a轉(zhuǎn)基因84K楊的基因表達及多胺含量

表2 PagSAMDC4a轉(zhuǎn)基因84K楊葉片中3種多胺含量①

圖2 干旱脅迫下過表達PagSAMDC4a植株相關(guān)生理指標(biāo)的變化

圖3 干旱脅迫下PagSAMDC4a轉(zhuǎn)基因84K楊的H2O2含量

3 討論

干旱嚴(yán)重影響植物生長發(fā)育以及生物量積累(Yinetal., 2014)，阻礙干旱、半干旱地區(qū)的植物生長。植物內(nèi)源性多胺影響植物的生長發(fā)育以及脅迫響應(yīng)，在干旱、低溫、高溫以及機械損傷等多種脅迫下，植物能產(chǎn)生大量的多胺物質(zhì)(Alczaretal., 2006; Marcoetal., 2011)。植物外源施加多胺或者異源表達多胺合成酶，都能增強植物抵御脅迫的能力。多胺合成涉及多個酶促反應(yīng)，相關(guān)酶基因的作用及其對多年生木本植物的影響有待研究。

提供氨丙基的S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(SAMDC)在多胺合成途徑上發(fā)揮著關(guān)鍵作用。因此，本研究通過對SAMDC4a過表達銀腺楊84K植株進行干旱脅迫，分析了SAMDC4a基因差異表達導(dǎo)致植物體內(nèi)源多胺含量變化對植株抗逆性的影響。干旱脅迫后，過表達SAMDC4a植株葉片呈現(xiàn)不同的響應(yīng)狀態(tài)，隨著基因表達量的升高，其內(nèi)源亞精胺和精胺含量都隨之增加。這進一步說明過表達SAMDC4a植株基因表達差異影響內(nèi)源多胺含量，SAMDC4a基因表達升高導(dǎo)致植株多胺含量增加，進而增強對干旱脅迫的耐受性。此外，為完全評估SAMDC4a基因在抗逆性中的作用，后期應(yīng)對SAMDC4a進行基因沉默或RNA干擾，進一步研究SAMDC4a基因表達量降低對多胺含量及抗逆性的影響。

植物在受到脅迫時，電解質(zhì)滲透率是分析植物發(fā)生損傷的重要標(biāo)準(zhǔn)，同時電解質(zhì)滲透率的測定結(jié)果可用來評估逆境脅迫后的細(xì)胞活力(Busaidietal., 2015)。據(jù)報道在低溫脅迫下，對黃瓜(Cucumissativus)幼苗施加外源腐胺和亞精胺，能有效降低黃瓜葉片的電解質(zhì)滲透率，對低溫產(chǎn)生相應(yīng)的抗逆性(Zhangetal., 2009)。本試驗在干旱脅迫后，未轉(zhuǎn)基因銀腺楊84K的電解質(zhì)滲透率顯著升高，而過表達SAMDC4a植株的滲透率變化幅度較小，且維持在較低水平，這表明通過改變植株內(nèi)源多胺含量，可以對植株電解質(zhì)的滲透有重要影響，穩(wěn)定了細(xì)胞透性，減少了對細(xì)胞的傷害。葉片相對含水量是衡量植株響應(yīng)干旱脅迫的重要生理指標(biāo)，可用來評估植物抗旱能力。在正常供水情況下，過表達SAMDC4a轉(zhuǎn)基因銀腺楊84K植株與未轉(zhuǎn)基因植株的葉片相對含水量無顯著差異； 但在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株葉片相對含水量顯著高于未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?。與之相反，過表達SAMDC4a轉(zhuǎn)基因植株在正常供水情況下的葉片失水率顯著低于未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?。這些結(jié)果表明，多胺通過增強葉片持水能力，減少葉片水分丟失，進而有效緩解植株葉片所受水分脅迫，從而改善葉肉細(xì)胞中水分狀況，在有限的水分供應(yīng)下保證植株正常生長(Farooqetal., 2009)。

本研究表明，多胺合成關(guān)鍵酶基因SAMDC4a過量表達加速了多胺(尤其是亞精胺、精胺)的合成，促進了多胺的積累，并間接引起多胺相關(guān)的生理、生化變化。H2O2作為多胺代謝相關(guān)產(chǎn)物之一(Groppaetal., 2008; Alczaretal., 2010)，在植物應(yīng)對逆境脅迫中具有重要影響。在多種脅迫條件下，多胺能夠緩解活性氧(ROS)帶來的損傷、激活抗氧化機制，對各種脅迫產(chǎn)生抗逆性(Seoetal., 2019)。H2O2作為活性氧主要類型之一，在植株干旱脅迫下的積累是造成植株自身損傷的一個重要途徑。對植株施加外源多胺時，會導(dǎo)致植株H2O2含量下降、抗氧化機制的激活、ROS水平顯著降低等，可以緩解干旱脅迫的影響(Satishetal., 2018; Hassanetal., 2018; 2020)。本研究表明，過表達SAMDC4a銀腺楊84K，在干旱脅迫下的H2O2含量變化幅度較小，且顯著低于未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?，進一步表明多胺可以減少活性氧積累，減輕干旱脅迫引起的氧化損傷程度。說明過表達SAMDC4a基因能增強楊樹抗旱能力，增強對環(huán)境脅迫的抗逆性。

4 結(jié)論

S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因(SAMDC4a)過表達的銀腺楊84K可通過提高植株內(nèi)源多胺含量，從而增強葉片的持水能力，減輕ROS積累，維持正常的細(xì)胞滲透能力，在干旱脅迫下增強對干旱脅迫的抗性，說明內(nèi)源多胺在木本植物響應(yīng)干旱脅迫過程中有重要作用。這為揭示楊樹多胺在抗逆性方面的作用提供了重要依據(jù)，對選育抗逆新品種具有潛在的應(yīng)用價值。