李順福 王慧敏 房麗莎 劉 震

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院 鄭州 450002)

在秋季短日照和低溫誘導(dǎo)下大多數(shù)溫帶多年生木本植物高生長停止，形成休眠芽抵抗冬季的寒冷和干燥，并經(jīng)過低溫解除休眠，在來年春季適時萌發(fā)進(jìn)行又一輪的生長-休眠的季節(jié)生長發(fā)育周期(永田洋等， 1994； Jianetal.， 1997； 劉震， 2000； Horvathetal.， 2003； 簡令成等， 2004； Olsen， 2010)，休眠芽的發(fā)育決定著該樹種的高度(Perry， 1971)。

泡桐屬(Paulowina)樹種作為我國優(yōu)良的速生樹種，橫跨亞熱帶與暖溫帶，既能適應(yīng)溫暖濕潤的亞熱帶氣候又能適應(yīng)冬季較寒冷干燥的暖溫帶氣候，但其頂芽與多數(shù)樹干通直圓滿高大的樹種如楊樹(Populus)(Jianetal., 1997)、山桐子(Idesiapolycarpa)(劉震等， 2000)能夠形成飽滿的休眠芽不同，當(dāng)年秋季死亡，翌年春季對生側(cè)芽萌發(fā)形成假二叉分枝，導(dǎo)致“冠大干低”(劉震等， 2004)。從20世紀(jì)60年代開始，許多學(xué)者開展研究探求泡桐頂芽死亡的原因，提出如下原因： 一是冬季低溫脅迫(竺肇華， 1981)，或者低溫到來時泡桐尚未封頂導(dǎo)致未完全木質(zhì)化(蔣建平， 1990)； 二是水分脅迫導(dǎo)致(侯元凱等， 2001)； 三是冬季低溫脅迫和水分脅迫共同作用的結(jié)果(葉金山等， 2009)； 劉震等(2004)在研究泡桐頂側(cè)芽休眠的溫度特性時發(fā)現(xiàn)，在氣溫尚高的9—10月份就發(fā)生死亡，而且頂芽未發(fā)育成飽滿的越冬休眠芽，更不能經(jīng)歷冬季低溫，提出泡桐頂芽死亡是在長期進(jìn)化過程中獲得的一種生理生態(tài)適應(yīng)的假說(劉震等， 2004)。為驗證該假說，開展了泡桐高生長停止和死亡過程中頂芽環(huán)境因素調(diào)控、內(nèi)外部形態(tài)、內(nèi)源激素、細(xì)胞程序性死亡等方面的研究(王艷梅等， 2009； 2012； 2013； 2016； Wangetal.， 2018； 王國霞等， 2017)，得出18 ℃以上的短日照誘導(dǎo)能使泡桐高生長停止，頂芽不能形成越冬休眠芽而死亡； 頂芽內(nèi)源激素從高生長停止到死亡過程中，ABA、GA、IAA、ZR 4種激素含量均呈下降趨勢，其中ABA的變化明顯不同于一般具有休眠芽的樹種(王艷梅等， 2012)。ABA作為一種抗逆激素，在植物體的積累有助于提高植物的抗性，對多年生植物生長停止和芽的形成與休眠起著重要的調(diào)控作用(Rohdeetal.， 2002)。像泡桐屬一類的樹種為什么不能形成越冬休眠芽，其基因如何調(diào)控頂端分生組織分化而導(dǎo)致頂芽死亡？Wang等(2019)通過短日照誘導(dǎo)毛泡桐20天(Paulowinatomentosa)的轉(zhuǎn)錄組分析，得出晝夜節(jié)律PIF3和PRR5基因上調(diào)表達(dá)和生長素信號上IAA、ARF和SAURs基因下調(diào)表達(dá)導(dǎo)致泡桐高生長的停止，但20天的短日照處理不能反映頂芽的死亡過程，其轉(zhuǎn)錄組結(jié)果也不能反映頂芽死亡發(fā)生過程中基因調(diào)控的變化。鑒于此，本研究通過延長短日照處理事件到42天，在高生長期、高生長停止期、頂芽死亡發(fā)生期3個時期進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，確定泡桐頂芽死亡發(fā)生過程中差異表達(dá)基因，為探究泡桐頂芽死亡分子機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2016年10月取白花泡桐(Paulowniafortunei)的種子于2017年3月播種在容器中(容器規(guī)格30 cm×28 cm)，取生長狀態(tài)近似的50株分2組于8月放入在河南省鄭州市河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)試驗站(113°38′E，34°47′N)的人工氣候室中恒溫25 ℃下8 h光照/16 h黑暗條件處理，每隔7天對泡桐高生長變化進(jìn)行測量，并在處理14天(高生長期SDa)、28天(高生長停止期SDb)、42天(頂芽死亡發(fā)生期SDc)進(jìn)行采樣； 每個時期隨機(jī)采3株距頂端0.5 cm左右的泡桐頂芽，放入液氮中，儲存于-80 ℃冰箱中分別用于轉(zhuǎn)錄組分析。

1.2 RNA提取及文庫構(gòu)建

樣品在液氮中粉碎后提取RNA，用1%的瓊脂糖電泳檢測樣品是否有降解及雜質(zhì)，用K5500分光光度計(凱奧，北京)檢測樣品純度，用安捷倫2100RNA Nano 6000Assay Kit(Agilent Technologies，CA，USA)檢測樣品的完整性和濃度。總RNA樣本檢測合格后，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，向得到的mRNA中加入片段緩沖液使其片斷成為短片段，再以片斷后的mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成cDNA第1鏈，并加入緩沖液、dNTPs、RNaseH和DNA Polymerase I繼續(xù)合成cDNA第2鏈，經(jīng)過QIAQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫，洗脫純化后的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加堿基A、加測序接頭處理，然后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，完成整個文庫制備。構(gòu)建好的文庫用Illumina平臺進(jìn)行測序。

1.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)處理與組裝

測序得到的原始序列raw reads去除接頭污染和低質(zhì)量的序列，去除未知堿基大于5%的序列得到數(shù)據(jù)為clean reads。利用Trinity軟件對clean reads進(jìn)行de novo拼接組裝獲得轉(zhuǎn)錄本序列，取每條基因中最長的轉(zhuǎn)錄本作為Unigene序列。

1.4 差異基因功能注釋分類和代謝通路分析

Unigenes的表達(dá)量計算使用RPKM(reads per kilobase per millon mapped reads)，即每百萬reads 中來自于某基因每千堿基長度的reads數(shù)，利用DEGSeq2軟件對3個樣品間的Unigenes進(jìn)行比較，并選取∣log2FoldChange∣≥1且校正P<0.05的基因作為顯著差異表達(dá)基因，將差異基因與NR、NT、GO、EggNOG、KEGG、UniProt、Pfam數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對和功能注釋，用校正P<0.05對差異基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。

1.5 熒光定量qRT-PCR驗證

為了驗證轉(zhuǎn)錄組信息和差異基因分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，隨機(jī)選擇11個差異表達(dá)基因的Unigenes序列利用Premier 5設(shè)計引物，并以白花泡桐18 S核糖體RNA為內(nèi)參基因(曹喜兵， 2014)。以各時期cDNA為模版進(jìn)行qRT-PCR驗證，引物合成由上海生工生物工程有限公司完成，將提取的RNA用M-MuLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海生工生物工程有限公司)合成cDNA的第1條鏈，稀釋100倍后利用SYBRTM Select master Mix(Thermo Fisher公司)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)(ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀)。qRT-PCR反應(yīng)條件： 95 ℃預(yù)變性3 min； 95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，40個循環(huán)。生物學(xué)重復(fù)3次，技術(shù)重復(fù)3次，用2-△△Ct法計算相對表達(dá)量。結(jié)果用IBM SPSS Statistics 19 軟件分析，OriginPro 9軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 短日照對白花泡桐外部形態(tài)的影響

在25 ℃恒溫的人工氣候室中，用短日照(8 h光照/16 h黑暗)處理14天，株高不斷增加，頂端和幼葉呈現(xiàn)嫩綠色，表面密生白色腺毛，處于高生長期(SDa)； 處理28天，株高不再增加，頂端顏色由嫩綠色變?yōu)樯罹G色并不再萌發(fā)新的幼葉，處于高生長停止期(SDb)； 處理42天，頂端幼葉脫落，頂芽萎縮變小變褐色，頂芽下端出現(xiàn)斷痕，處于頂芽死亡發(fā)生期(SDc)(圖1)。

圖1 短日照處理下白花泡桐株高和頂芽狀態(tài)

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝及結(jié)果

用Illumina平臺對SDa、SDb、SDc 3個時期(每個時期3個生物學(xué)重復(fù))共9個樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，共測得57.47 Gb的原始數(shù)據(jù)。過濾后的clean reads的Q30都在92.85%以上，GC含量約為42.25%，每組數(shù)據(jù)情況見表1。

2.3 差異基因分析

對3個時期測序結(jié)果進(jìn)行比較，選取∣log2FoldChange∣ ≥1且校正P< 0.05的基因作為顯著差異表達(dá)基因，共篩選出44 937個差異基因，其中有37 076條(83.51%)基因在7大數(shù)據(jù)庫中被注釋(表2)。SDb和SDa顯著差異的基因為13 378條，其中上調(diào)表達(dá)9 923條，下調(diào)表達(dá)3 455條； SDc和SDb顯著差異的基因為25 341條，其中上調(diào)表達(dá)16 879條，下調(diào)表達(dá)8 462條； SDc和SDa顯著差異的基因33 056條，上調(diào)表達(dá)25 640條，下調(diào)表達(dá)7 416條； 3個時期差異基因共同上調(diào)的基因1 730條，共同下調(diào)的基因441條(圖2)。

表1 短日照誘導(dǎo)白花泡桐頂芽3個時期reads 質(zhì)量統(tǒng)計

表2 差異基因功能注釋結(jié)果統(tǒng)計

圖2 短日照誘導(dǎo)下3個時期差異表達(dá)基因數(shù)(A)及分布情況(B)

2.4 差異基因GO功能富集分析

對3個時期的差異基因進(jìn)行注釋后，將注釋成功的基因按照GO的3大類： 生物學(xué)過程(biological process)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)，進(jìn)行分類。對分類中差異基因的數(shù)目進(jìn)行超幾何檢驗，用校正P<0.05找到差異表達(dá)基因中顯著富集的GO條目(圖3)，發(fā)現(xiàn)3個時期富集到GO上的差異基因趨勢基本一致，其中富集到細(xì)胞組分的差異基因最多的3個亞類是細(xì)胞成分、細(xì)胞器和細(xì)胞器組分； 富集到生物學(xué)過程的差異基因最多的3個亞類為細(xì)胞過程、代謝過程和生物調(diào)控； 富集到分子功能的差異基因最多的3個亞類為結(jié)合活性、催化活性和轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。

圖3 不同時期差異表達(dá)基因GO聚類分析

2.5 差異基因的KEGG富集通路分析

將白花泡桐頂芽3個時期差異基因在KEGG數(shù)據(jù)庫分析，以校正P<0.01為標(biāo)準(zhǔn)對代謝通路進(jìn)行富集分析： 在短日照處理中其中SDb vs SDa涉及的代謝通路為134條，富集到的通路為8條，富集程度最高的3個通路分別為植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，角質(zhì)、木栓質(zhì)和蠟的合成及光合作用天線蛋白通路； SDc vs SDb涉及到的代謝通路為133條，其中富集到的通路為4條，富集程度最高的3個通路分別為植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、氨基酸合成、淀粉和蔗糖代謝通路； SDc vs SDa涉及到的代謝通路為135條，富集到的代謝通路為10條，富集程度最高的3個通路分別為植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和蔗糖代謝及苯丙烷類合成通路(表3)。

2.6 植物激素調(diào)控通路的差異基因分析

通過對白花泡桐頂芽KEGG代謝通路的富集分析，得出植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在3個時期都有顯著富集并且富集程度最高。在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上共篩選出30個差異基因，其中在生長素(IAA)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中生長素響應(yīng)因子ARF、IAA、GH3和SAUR在SDb和SDc均下調(diào)表達(dá)； 細(xì)胞分裂素(CTK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的ARR-B家族因子在SDb上調(diào)表達(dá)，在SDc下調(diào)表達(dá)； 赤霉素(GA)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的DELLA有2個差異基因在SDb和SDc均為下調(diào)表達(dá)； ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的相關(guān)的蛋白磷酸酶2C(PP2C)在SDb和SDc為上調(diào)表達(dá)，蔗糖非酵解型蛋白激酶SnRK2和ABF的3個差異基因在SDb均表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，在SDc均出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)； ETH轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的正調(diào)控因子EIN2和EIN3在SDb出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，在SDc下調(diào)表達(dá)； 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白ERF1的2個差異基因在SDb和SDc均上調(diào)表達(dá)； BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的編碼木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶的TCH4在SDc出現(xiàn)了上調(diào)表達(dá)，細(xì)胞周期蛋白CYCD3在SDb下調(diào)表達(dá)，在SDc上調(diào)表達(dá)(圖4、表4)。

2.7 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗證

為了驗證轉(zhuǎn)錄組信息和差異基因分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，以白花泡桐18 S核糖體RNA為內(nèi)參基因，選取激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和光合作用通路上的11個差異基因進(jìn)行qRT-PCR(表5)，用差異基因在不同樣品間的差異倍數(shù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)這11個差異基因在不同樣品中的結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序的表達(dá)結(jié)果趨勢基本一致(圖5)。

表3 差異表達(dá)基因KEGG富集通路分析

表4 富集到植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)KEGG通路上差異基因及功能描述①

續(xù)表 Continued

圖4 短日照誘導(dǎo)下激素轉(zhuǎn)導(dǎo)KEGG通路及相關(guān)基因表達(dá)熱圖

表5 選取qRT-PCR驗證的基因編號和引物序列

圖5 qRT-PCR和RNA-Seq在3組樣品間差異倍數(shù)的比對

3 討論

通過對短日照誘導(dǎo)白花泡桐14天(SDa： 高生長期)、28天(SDb： 高生長停止期)、42天(SDc： 頂芽死亡發(fā)生期)的轉(zhuǎn)錄組分析，共篩選出44 937個差異基因，其中顯著差異的基因25 341條，SDc vs SDb中涉及到的KEGG代謝通路為133條，富集的通路4條分別為植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、氨基酸合成、淀粉和蔗糖代謝和苯丙氨酸等合成通路，未發(fā)現(xiàn)Wang等(2019)短日照誘導(dǎo)毛泡桐中晝夜節(jié)律通路上差異基因的富集。植物芽休眠本質(zhì)是莖端分生組織分裂活動的相對靜止，植物激素起著重要的調(diào)控作用，不同的激素對休眠的影響不同(Cookeetal.， 2012)，SDc vs SDb的差異基因在KEGG上主要富集在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并從中篩選出30個差異基因進(jìn)行分析。

ABA是植物芽休眠建立和維持的必需激素，在其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，ABA與受體PYL結(jié)合后與蛋白磷酸酶2C(PP2C)形成復(fù)合體抑制PP2C的功能，導(dǎo)致有活性的SnRK2蛋白水平增加，最終激活A(yù)BA響應(yīng)基因的表達(dá)(Hubbarbetal.， 2010)。在短日照誘導(dǎo)楊樹(Ruttinketal.， 2007)、沙梨(Pyruspyrifolia)(Lietal.， 2018)等高生長停止和芽休眠過程中ABA含量升高，其響應(yīng)因子ABF均上調(diào)表達(dá)來建立和維持休眠； 本研究白花泡桐在SDb中SnRK2和ABF為上調(diào)表達(dá)，但在SDc中SnRK2和ABF卻為下調(diào)表達(dá)，SDc中相關(guān)的響應(yīng)因子表達(dá)與楊樹(Ruttinketal.， 2007)和沙梨(Lietal.， 2018)芽休眠過程中不同； 同時對泡桐1年生苗木的激素測定得出ABA的含量從高生長停止到死亡發(fā)生呈現(xiàn)上升后下降趨勢(王艷梅等， 2012)，這與SDc中的響應(yīng)因子ABF表達(dá)趨勢一致。因此白花泡桐在SDc中ABA響應(yīng)因子ABF下調(diào)表達(dá)，可能是導(dǎo)致其高生長停止后無法形成和維持休眠芽而導(dǎo)致頂芽死亡的主要原因。

ETH對植物器官的成熟和衰老有重要的調(diào)節(jié)作用，是葉片脫落的重要物質(zhì)(Johnsonetal.， 1998)。在ETH激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，ETH與受體ETR結(jié)合后與負(fù)調(diào)控因子CTR1相互作用，抑制EIN2轉(zhuǎn)錄元件激活后調(diào)控下游EIN3轉(zhuǎn)錄因子，從而結(jié)合ETH響應(yīng)因子ERF啟動子介導(dǎo)下游基因的表達(dá)(Lietal.， 2015)。ETH的響應(yīng)因子在植物休眠中也起一定的調(diào)節(jié)作用，在短日照誘導(dǎo)垂枝樺(Betulapendula)(Ruonalaetal.， 2006)和楊樹(Ruttinketal.， 2007)高生長停止和休眠芽形成階段ETH響應(yīng)因子都出現(xiàn)短暫的上調(diào)表達(dá)，在白花泡桐SDb中EIN2、EIN3和ERF1也出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，此時高生長停止； 在楊樹(Ruttinketal.， 2007)芽休眠期ERF1為下調(diào)表達(dá)，而在白花泡桐SDc中ERF1出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，此時頂端分生組織分化的葉原基展開的幼葉先于成熟葉片脫落，無法形成芽鱗包裹葉原基的休眠芽，ERF1的上調(diào)表達(dá)可能導(dǎo)致白花泡桐無法形成具有保護(hù)組織的越冬休眠芽。

BR激素在細(xì)胞伸長和分裂中起著重要的調(diào)節(jié)作用(Wangetal., 2014)。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中BR激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的TCH4基因編碼木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶，影響細(xì)胞壁的形成和擴(kuò)展從而導(dǎo)致細(xì)胞伸長(Xuetal.， 1995)； 但TCH4在白花泡桐SDc中出現(xiàn)了上調(diào)表達(dá)，其他時期不表達(dá)。CYCD3是調(diào)控細(xì)胞周期完成細(xì)胞分裂的重要元件，調(diào)控細(xì)胞分裂的G1-S期和G2-M期(Gutierrezetal.， 2002; den Boeretal.， 2000)，在楊樹休眠芽中細(xì)胞分裂停止在G1期(Rohdeetal.， 1997)，其頂端分生組織細(xì)胞分裂活動相對停滯，相應(yīng)細(xì)胞周期也進(jìn)入不活躍狀態(tài)，CYCD3下調(diào)表達(dá)(Ruttinketal.， 2007)； 白花泡桐在高生長停止的SDb中CYCD3出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，但在SDc中卻為上調(diào)表達(dá)，這表明白花泡桐頂端分生組織細(xì)胞在頂芽死亡發(fā)生期分裂活動仍在繼續(xù)進(jìn)行。TCH4和CYCD3上調(diào)表達(dá)導(dǎo)致白花泡桐頂端分生組織細(xì)胞的活躍從而不能形成正常的休眠芽。

IAA是植物生長必需激素，在植物芽休眠過程中含量急劇下降，白花泡桐在SDb和SDc中IAA響應(yīng)因子ARF、IAA、GH3和SAUR均下調(diào)表達(dá)，這與Wang等(2019)在短日照誘導(dǎo)毛泡桐高生長停止期和Ruttink等(2007)誘導(dǎo)楊樹休眠期的表達(dá)趨勢一致； GA與芽休眠的解除有關(guān)，在芽休眠過程中含量下降，其中DELLA蛋白是GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)傳遞的關(guān)鍵元件，白花泡桐在SDc中DELLA下調(diào)表達(dá)，這與沙梨在休眠期的DELLA表達(dá)趨勢(劉杭等， 2016)一致。因此，得出白花泡桐在頂芽死亡發(fā)生期(SDc)IAA和GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上相關(guān)的響應(yīng)因子的表達(dá)與楊樹等木本植物休眠期的表達(dá)趨勢一致，而ABA、ETH和BR上相關(guān)響應(yīng)因子的表達(dá)趨勢不同。

4 結(jié)論

短日照誘導(dǎo)白花泡桐高生長停止初期，ABA和ETH的響應(yīng)因子出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，IAA、GA和BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上相關(guān)基因下調(diào)表達(dá)，促使高生長停止，但隨著短日照誘導(dǎo)時期的延長，ABA的響應(yīng)因子ABF卻出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的TCH4和CYCD3上調(diào)表達(dá)，導(dǎo)致頂端分生組織細(xì)胞的分裂活動仍繼續(xù)進(jìn)行，同時ETH響應(yīng)因子ERF1出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，可能導(dǎo)致分生組織分化的葉原基展開的幼葉脫落而無法形成芽鱗包裹，使白花泡桐頂芽不能向形成越冬休眠芽方向發(fā)展而死亡。