陳 群，闞勁松，杜軍華，劉仙明

（1.合肥學(xué)院生物食品與環(huán)境學(xué)院，安徽 合肥 230601；2.青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青海 西寧 810008；3.東至縣葛公菌種場(chǎng)，安徽 池州 247240）

靈芝（Ganoderma lingzhi）隸屬于擔(dān)子菌門(mén)（Ba sidiomycota）靈芝科（Ganodermataceae）靈芝屬（Ganoderma），被《神農(nóng)本草經(jīng)》《本草綱目》等中醫(yī)名著列為上品之物，在中國(guó)傳統(tǒng)文化中被視為吉祥之物，素有瑞草的美譽(yù)[1]。靈芝子實(shí)體、孢子粉、菌絲體均可入藥，含有多種生物活性成分，如多糖類(lèi)、核苷類(lèi)、多肽類(lèi)、三萜類(lèi)等，其中多糖和三萜兩大類(lèi)活性物質(zhì)被認(rèn)為是靈芝的主要藥效成分[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，靈芝可以提高機(jī)體免疫能力、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、提高機(jī)體耐缺氧能力，以及改善睡眠質(zhì)量、安心養(yǎng)神等，具有廣闊的研究開(kāi)發(fā)前景[3]。

40年來(lái)，食（藥）用菌科研工作者緊密?chē)@應(yīng)用最新分子生物學(xué)技術(shù)為育種服務(wù)，解決生產(chǎn)實(shí)踐中科學(xué)問(wèn)題等主題開(kāi)展眾多科學(xué)活動(dòng)[4]，促進(jìn)食用菌種業(yè)的健康發(fā)展，更好地滿(mǎn)足食用菌產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量可持續(xù)發(fā)展的需求[5]?！皽r(nóng)靈芝1號(hào)”是上海市農(nóng)科院食用菌研究所利用遺傳學(xué)和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)培育成功的靈芝品種。其特點(diǎn)為抗病、高產(chǎn)，孢子粉產(chǎn)量高，多糖和三萜含量高。因抗病能力強(qiáng)可較大程度減少農(nóng)藥使用，確保靈芝子實(shí)體和孢子粉質(zhì)量安全[6-7]。

“滬農(nóng)靈芝1號(hào)”在浙江、安徽有較大栽培面積，但均是椴木栽培。椴木栽培消耗木材資源較多，不符合當(dāng)今農(nóng)林產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展理念。因此開(kāi)發(fā)代料栽培模式，減少木材消耗，充分利用木屑、秸稈、甘蔗渣等農(nóng)林廢棄物，可實(shí)現(xiàn)廢棄物資源化利用，取得社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益良性平衡。

通過(guò)對(duì)前期文獻(xiàn)[8-9]及大量實(shí)際生產(chǎn)情況調(diào)研，研究選取雜木屑為碳源，麩皮、尿素為氮源，以尿素添加、鈣鹽添加量、鎂鹽添加量作為試驗(yàn)因素，優(yōu)化“滬農(nóng)靈芝1號(hào)”菌絲代料培養(yǎng)基配方，為“滬農(nóng)靈芝1號(hào)”原種、栽培種、代料栽培的培養(yǎng)基配方提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

“滬農(nóng)靈芝1號(hào)”母種為東至縣葛公菌種場(chǎng)的商品生產(chǎn)種，在東至縣葛公菌種場(chǎng)制作成接種用原種。雜木屑（不含松木）和麩皮由東至縣葛公菌種場(chǎng)采購(gòu)提供，食品級(jí)石膏采購(gòu)自山東昊啟生物科技有限公司，食品級(jí)一水硫酸鎂采購(gòu)自濰坊圣川化工有限公司。

1.1.2 試劑

葡萄糖、蒽酮、硫酸、甲醇、冰醋酸、高氯酸、乙酸乙酯、乙醇均為分析純，西隴科學(xué)股份有限公司產(chǎn)品；香草醛（純度99%）、齊墩果酸（純度98%），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器

AE124分析天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；UV7600紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司產(chǎn)品；JY92-IIN超聲波處理器，寧波新芝生物科技股份有限公司；HH-8恒溫水浴鍋，金壇區(qū)環(huán)宇科學(xué)儀器廠產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化代料栽培配方

在前期預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，用于調(diào)配代料培養(yǎng)料原料物質(zhì)有：木屑（1 000 g）、麩皮（200 g）、玉米粉（20 g）、白砂糖（15 g）、石膏（25 g）、尿素、過(guò)磷酸鈣、硫酸鎂，pH自然，根據(jù)試驗(yàn)處理組尿素、鈣鹽、鎂鹽添加量要求，變動(dòng)尿素、過(guò)磷酸鈣、硫酸鎂添加量以調(diào)整試驗(yàn)組配方。

菌種培養(yǎng)料裝袋量為500 g，設(shè)計(jì)25 mL接種杯固定接種量，接種于菌種袋一端中心位置。20℃～28℃恒溫?zé)o光培養(yǎng)，空氣濕度控制在75%左右，每天上午8:00、下午5:00固定開(kāi)門(mén)窗通風(fēng)30 min。所有裝袋與接種均在一輪試驗(yàn)批次完成。根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，應(yīng)用Design-Expert軟件中Box-Behnken模塊（Box-Behnken Design，BBD） 設(shè)計(jì)3因素3水平因素水平表，共產(chǎn)生17次BBD試驗(yàn)處理組，其中含5次中心點(diǎn)（基準(zhǔn)水平）重復(fù)試驗(yàn)，每處理組設(shè)置10袋重復(fù)，具體配方見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Tab.1 The factor and levels of response surface experiments

記錄接種后菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)種瓶天數(shù)，取（100-實(shí)際天數(shù)）為響應(yīng)值R。應(yīng)用軟件進(jìn)行多元回歸擬合處理，獲取二次多項(xiàng)式回歸方程，利用方差分析對(duì)該模型的顯著性進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)，利用軟件優(yōu)化功能獲取最佳參數(shù)的預(yù)測(cè)值。

1.3.2 田間代料栽培試驗(yàn)

在葛公菌種場(chǎng)山地搭建高2.8 m～3.0 m的棚架，棚架四周用遮陽(yáng)網(wǎng)圍住。棚架內(nèi)再搭建高約2.5 m的拱形栽培大棚，拱棚上覆蓋無(wú)滴膜，拱棚四周挖排水溝。拱棚下做畦，畦上進(jìn)行靈芝代料栽培。

栽培前對(duì)場(chǎng)地進(jìn)行清洗消毒，根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際情況和原料成本綜合考慮，并參考響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果制定栽培料配方。菌棒裝袋量為1 500 g，設(shè)計(jì)50 mL接種杯固定接種量，接種于菌種袋一端中心位置，11月底至次年2月制棒接種，4月～6月排場(chǎng)栽培，6月～7月出芝，7月～8月收粉。

在靈芝菌芽開(kāi)傘前，整畦鋪上接粉地膜。當(dāng)靈芝生長(zhǎng)成熟且菌蓋邊緣完全變成紅褐色時(shí)，在每畦插上小拱架，架上覆蓋無(wú)紡布，將整個(gè)畦罩住以便進(jìn)行孢子粉收集。靈芝產(chǎn)粉之前采收部分靈芝子實(shí)體。子實(shí)體與孢子粉烘干、稱(chēng)重，按2015版《中華人民共和國(guó)藥典》方法[10]對(duì)孢子粉多糖和三萜含量進(jìn)行測(cè)定。

田間試驗(yàn)于2019年和2020年共進(jìn)行2次，同時(shí)每次制備少量椴木埋土栽培菌棒作為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化栽培料配方

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)結(jié)果Tab.2 The optimized results of response surface experiments

對(duì)建立的二次方程模型和試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，檢驗(yàn)該模型的有效程度，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 BBD試驗(yàn)方差分析表Tab.3 The variance analysis of BBD experiments

由表3可知，該模型的F值較大，為64.7，P＜0.000 1，說(shuō)明相關(guān)系數(shù)的顯著性，擬合程度較好；失擬F值為3.4，其P＞0.05，說(shuō)明失擬項(xiàng)不顯著，因此模型在被研究的區(qū)域內(nèi)擬合度比較高，因此該模型可以用于后期的優(yōu)化處理。在一次項(xiàng)中，尿素比例與鈣鹽比例均達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01），鎂鹽比例對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）；在二因素交互項(xiàng)中，尿素比例與鈣鹽比例、尿素比例與鎂鹽比例間均存在交互作用（P＜0.01）。從以上分析數(shù)據(jù)還可以得出，單因素對(duì)菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)接種瓶天數(shù)影響順序由大到小為：尿素比例（A） >鈣鹽比例（B） >鎂鹽比例（C），交互作用對(duì)天數(shù)影響順序由大到小為：AC>AB>BC。

經(jīng)過(guò)Design-Expert 8.0軟件進(jìn)一步對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，擬合出了關(guān)于A、B、C的二次多項(xiàng)回歸方程：

R=33.60+4.63A+1.75B+0.12C-2.25AB-2.50AC-0.25BC-11.05A2-5.3B2-2.55C2

方程中的正負(fù)符號(hào)及系數(shù)反映了不同因素對(duì)于R的影響方向及程度。通過(guò)SPSS最優(yōu)化處理，得出當(dāng)尿素比例（A） 為0.9%、鈣鹽比例 (B)為2.55%、鎂鹽比例 (C)為0.08%時(shí)，菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)接種瓶的時(shí)間為66.4 d。

以本響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化出的參數(shù)，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，結(jié)合菌絲形態(tài)學(xué)特征，設(shè)計(jì)原種、栽培種培養(yǎng)基配方。

2.2 田間代料栽培試驗(yàn)

根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際情況和原料成本綜合考慮，并參考響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果制定2019年田間代料栽培培養(yǎng)料配方（木屑15 000 kg、豆粕100 kg、麥麩1 000 kg、石膏150 kg、石灰200 kg、硫酸鎂10 kg），裝袋量為1.5 kg，尿素比例1.4%，鈣鹽比例2.1%，鎂鹽比例0.6%。其代料栽培與椴木栽培的子實(shí)體與孢子粉的多糖和三萜含量見(jiàn)表4。

表4 2019年田間代料栽培配方子實(shí)體與孢子粉多糖、三萜含量測(cè)定結(jié)果（n=10）Tab.4 The determination results of polysaccharides and triterpenes in fruit body and spore powder of culture media for field substitute cultivation in 2019(n=10)

由表4可知，2019年代料栽培子實(shí)體與孢子粉三萜含量均低于椴木栽培，差異顯著，2種栽培模式下，多糖、三萜含量均遠(yuǎn)高于藥典標(biāo)準(zhǔn)水平。另外還可發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是代料栽培還是椴木栽培，孢子粉三萜含量均高于子實(shí)體，而多糖含量則均低于子實(shí)體。因此2020年調(diào)整栽培料配方，降低尿素添加至0.84%，鈣鹽、鎂鹽添加比例不變，適當(dāng)添加葡萄糖與磷肥，其配方調(diào)整為木屑15 000 kg、豆粕300 kg、麥麩1 500 kg、石膏150 kg、石灰200 kg、硫酸鎂10 kg、葡萄糖100 kg、磷肥50 kg，其代料栽培與椴木栽培的子實(shí)體與孢子粉的多糖和三萜含量見(jiàn)表5。

表5 2020年田間代料栽培配方子實(shí)體與孢子粉多糖、三萜含量測(cè)定結(jié)果（n=10）Tab.5 The determination results of polysaccharides and triterpenes in fruit body and spore powder of culture media for field substitute cultivation in 2020(n=10)

由表5可知，通過(guò)上述配方調(diào)整，三萜含量有所提高，達(dá)到椴木栽培的三萜含量水平。2019年、2020年2年田間試驗(yàn)產(chǎn)量結(jié)果表明，2種栽培模式下，代料子實(shí)體與孢子粉產(chǎn)量均高于椴木栽培，代料栽培孢子粉平均棒產(chǎn)35.6 g，產(chǎn)粉后子實(shí)體35.2 g，產(chǎn)粉率101%。代料子實(shí)體與孢子粉產(chǎn)量均較高，發(fā)展代料靈芝栽培，不僅生產(chǎn)寶貴中藥材，還是回收利用碎木屑、蔗渣、秸稈等農(nóng)林廢棄物的有效途徑，生態(tài)環(huán)境效益顯著。

3 結(jié)論

隨著社會(huì)進(jìn)步和生活水平提高，人們養(yǎng)生健體、治未病的理念越來(lái)越強(qiáng)，消費(fèi)需求也越來(lái)越多。靈芝產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，可滿(mǎn)足人們高水平生活的需要，社會(huì)意義重大。開(kāi)發(fā)“滬農(nóng)靈芝1號(hào)”代料規(guī)范化標(biāo)準(zhǔn)栽培模式，完善配套靈芝產(chǎn)業(yè)鏈和產(chǎn)業(yè)技術(shù)服務(wù)體系，引導(dǎo)合作社與農(nóng)戶(hù)組織代料栽培。充分利用農(nóng)林廢棄物資源，實(shí)現(xiàn)廢棄物資源化利用，減少木材消耗，引領(lǐng)靈芝產(chǎn)業(yè)的升級(jí)轉(zhuǎn)型和可持續(xù)發(fā)展。有助于靈芝產(chǎn)業(yè)實(shí)現(xiàn)專(zhuān)業(yè)化分工、集約化布局、產(chǎn)業(yè)化經(jīng)營(yíng)的新格局。此舉不僅保護(hù)環(huán)境，還可帶動(dòng)合作社、菇農(nóng)增產(chǎn)增收、農(nóng)村勞動(dòng)力就業(yè)，實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益雙豐收，進(jìn)而促進(jìn)政府鄉(xiāng)村振興工作，助力美麗鄉(xiāng)村建設(shè)。