高亞慧 姜明國(guó) 豐景 周桂

（廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院 廣西多糖材料與改性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海洋生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530008）

化肥和農(nóng)藥在我國(guó)農(nóng)業(yè)歷史上發(fā)揮了巨大的增產(chǎn)作用，但長(zhǎng)期使用化肥會(huì)造成土壤板結(jié)，肥力下降，農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)降低，污染環(huán)境等一系列問題［1］。隨著現(xiàn)代生物科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，應(yīng)用微生物代替化肥和農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)方面有廣泛的應(yīng)用前景。微生物肥料因其生產(chǎn)成本低、效果好、不污染環(huán)境以及有助于農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展等特點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。由于微生物肥料的快速穩(wěn)定發(fā)展，對(duì)PGPR的研究與開發(fā)也成為研究熱點(diǎn)［2］。PGPR是一類能夠在植物根際定殖，通過固氮、溶磷、抗病、增加植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收、調(diào)整植物激素濃度以及產(chǎn)生揮發(fā)性有機(jī)物等多種機(jī)制促進(jìn)植物生長(zhǎng)的有益微生物的總稱。微生物產(chǎn)生揮發(fā)性有機(jī)物是促進(jìn)植物生長(zhǎng)的一個(gè)重要促生機(jī)制，已有研究報(bào)道，枯草芽孢桿菌［3-7］，解淀粉芽孢桿菌［3，7］、產(chǎn)堿假單胞菌［8］、放線菌［9］、木霉真菌［10］、枝孢樣枝孢霉［11］等多種微生物產(chǎn)生的VOCs能夠通過調(diào)節(jié)植物激素［12］，誘導(dǎo)系統(tǒng)耐受性［13］及系統(tǒng)抗性［14］等多方面促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)從實(shí)驗(yàn)室已保存的48株菌株中通過二分格平板實(shí)驗(yàn)篩選得到一株所產(chǎn)VOCs對(duì)植物有明顯促生作用的潛在PGPR菌株GX14001，經(jīng)16S rRNA鑒定后進(jìn)行了VOCs盆栽實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步驗(yàn)證其所產(chǎn)VOCs對(duì)植物的促生作用。通過GC-MS對(duì)GX14001所釋放的VOCs進(jìn)行了成分檢測(cè)，之后對(duì)其固氮、溶磷、產(chǎn)IAA活性進(jìn)行了研究。本研究為微生物菌肥資源的開發(fā)與利用提供新的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株為從海洋分離得到的48株可培養(yǎng)的功能菌株，保藏于廣西多糖材料與改性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，菌株信息見表1。

表1 菌株信息Table 1 Strain information

1.1.2 植物材料 本氏煙草（Nicotiana benthamiana），上海青（Brassica chinensis L.）。

1.1.3 培養(yǎng)基 TSA培養(yǎng)基，TSB培養(yǎng)基及MS培養(yǎng)基均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司，蒙金娜有機(jī)培養(yǎng)基［15］，PKO 無(wú)機(jī)培養(yǎng)基［16］，Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基［17］，埃利希氏反應(yīng)顯色試劑。

1.1.4 主要試劑和儀器 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒及所用引物合成：天根生化科技有限公司；PCR擴(kuò)增反應(yīng)相關(guān)試劑及限制酶等：北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司；PCR擴(kuò)增儀：BioRad T100；智能人工氣候箱：浙江托普RTOP-1000B；搖床：上海旻泉MQD-B1R；固相微萃取探針，購(gòu)自青島貞正分析儀器有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：安捷倫5975C-7890A。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌發(fā)酵液的制備 將供試細(xì)菌接入TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：30℃，200 r/min，24 h。之后將菌液用無(wú)菌水稀釋至1×108CFU/mL備用。

1.2.2 細(xì)菌與煙草共培養(yǎng)

1.2.2.1 煙草預(yù)處理 用75%（V/V）醫(yī)用酒精對(duì)煙草種子上下輕緩顛倒消毒2-3 min后，再用1%的次氯酸鈉溶液（V/V）消毒2-3 min，之后用無(wú)菌水將煙草種子沖洗4-5遍，清洗種子表面的消毒劑，防止殘留消毒劑影響種子萌發(fā)。將消毒后的煙草種子點(diǎn)種在MS培養(yǎng)基上，用封口膜將平板封好后，放在25℃智能人工氣候箱培育至發(fā)芽出苗。智能人工氣候箱的條件為白天16 h，黑夜8 h，溫度25℃。

1.2.2.2 共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)采用9 cm二分格培養(yǎng)皿進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，一側(cè)培養(yǎng)煙草，另一側(cè)培養(yǎng)細(xì)菌，由于物理界限，細(xì)菌的分泌及代謝物不能和煙草進(jìn)行接觸和交流，但細(xì)菌釋放的揮發(fā)性有機(jī)物可通過培養(yǎng)皿上空與煙草進(jìn)行交流和作用。將培養(yǎng)5 d生長(zhǎng)狀況一致的煙草苗移栽到二分格培養(yǎng)皿的MS培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)皿移栽5棵，保持每棵煙草間距一致，在另一側(cè)TSA培養(yǎng)基接種10 μL 菌液，菌含量約為1×108CFU/mL，每個(gè)菌株做3個(gè)平行，以接種10 μL滅菌水作為對(duì)照。將平板用封口膜封好后，放入智能人工氣候箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與之前一致，培養(yǎng)14 d之后對(duì)煙草的生物量進(jìn)行測(cè)量與統(tǒng)計(jì)。

1.2.3 菌株鑒定 采用細(xì)菌基因組 DNA提取試劑盒提取供試菌株的總 DNA。用細(xì)菌通用引物27-F ：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′，1492-R ：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′ 進(jìn)行 16S rRNA 基因的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：模板1 μL，正反向引物各1 μL，2×Taq PCR StarMIX with Loading Dye 25 μL，用ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 4 min ；95℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 2 min ，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；最后4℃ 10 min。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行測(cè)序，所得序列通過Ezbiocloud進(jìn)行序列同源性比對(duì)分析。

1.2.4 盆栽實(shí)驗(yàn) 將上海青種子進(jìn)行消毒處理后，播種于已高壓濕熱滅菌的土壤中。每個(gè)盆栽3株幼苗，待長(zhǎng)出兩葉一心時(shí)，對(duì)其作處理。將菌株在TSA培養(yǎng)基上活化，挑取單菌落至裝有TSB液體培養(yǎng)基的瓶子中，30℃，200 r/min培養(yǎng)24 h后放置盆栽下方，用封口膜將盆栽裝置接口處封好，防止細(xì)菌產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物滲出，確保其能與植物的根部處于同一密閉空間。培養(yǎng)21 d后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)量與記錄。

1.2.5 頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用法（headspace solid phase microextraction/GC-MS，HS-SPME/ GC-MS） 分析菌株產(chǎn)生的VOCs成分

1.2.5.1 細(xì)菌樣品預(yù)處理 將供試細(xì)菌GX14001在裝有TSB液體培養(yǎng)基的固相微萃取瓶中進(jìn)行活化培養(yǎng)，30℃，200 r/min培養(yǎng)24 h備用。

1.2.5.2 萃取探針的預(yù)處理 本實(shí)驗(yàn)選擇活性炭/聚二甲基硅氧烷/聚二乙烯基苯（ACAR/PDMS/DVB）復(fù)合涂層的固相微萃取探針，適合較寬范圍揮發(fā)性有機(jī)物的萃取。萃取探針使用前進(jìn)行老化，老化條件為260℃，60 min。

1.2.5.3 GC-MS條件 實(shí)驗(yàn)條件：載氣為He；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度為230℃；爐溫起始為40℃，保持3 min，以3℃/min升溫至140℃，保持2 min；再以20℃/min升溫至230℃，保持2 min；離子源為EI源；采用Nist 08譜庫(kù)進(jìn)行檢索。

1.2.6 平板活性及IAA能力測(cè)定 通過點(diǎn)板法將細(xì)菌分別接種在蒙金娜有機(jī)培養(yǎng)基，PKO無(wú)機(jī)培養(yǎng)基，Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件，30℃，5 d。

分泌IAA能力測(cè)定：取IAA標(biāo)準(zhǔn)品與蒸餾水配置 成 5 μg/mL、10 μg/mL、12 μg/mL、15 μg/mL、18 μg/mL、20 μg/mL、22 μg/mL、24 μg/mL、28 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按體積比1∶1與Salksowskil比色液Ⅱ 混合，室溫避光放置30 min，以蒸餾水與Salksowski比色液Ⅱ等體積混合溶液為對(duì)照，測(cè)各濃度的OD530，以IAA濃度為橫坐標(biāo)，OD530為縱坐標(biāo)繪制IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測(cè)菌株接種于TSB液體培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min，培養(yǎng)48 h。取1 mL發(fā)酵液，12 000 r/min離心10 min，取上清液100 μL與Salksowski比色液Ⅱ等體積混勻，室溫下避光放置30 min，測(cè)定其OD530的值。其中，以未接菌的液體培養(yǎng)基與Salksowski比色液Ⅱ等體積混合液為對(duì)照。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft Excel 2016和IBM SPSS Statistics 21軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；采用單因素方差分析、LSD法進(jìn)行差異性顯著檢驗(yàn)；采用OriginPro 2018 進(jìn)行柱狀圖的繪制。

2 結(jié)果

2.1 菌株產(chǎn)生的VOCs對(duì)煙草的促生作用

對(duì)48株菌株進(jìn)行VOCs二分隔平板實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)14 d后對(duì)煙草的生物量進(jìn)行測(cè)量與統(tǒng)計(jì)。研究發(fā)現(xiàn)，GX13594、GX13747、GX14001、GX14016、GX-14066、GX14070、GX14201這7個(gè)菌株處理組的鮮重，根長(zhǎng)，側(cè)根數(shù)，葉片長(zhǎng)及葉片寬均顯著高于CK對(duì)照組（P＜0.01），結(jié)果表明這7個(gè)菌株所產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)煙草都具有明顯的促生作用（表2）。

表2 部分菌株產(chǎn)生的VOCs對(duì)煙草作用效果Table 2 Effect of VOCs produced by some strains on tobacco

經(jīng)過二分隔平板實(shí)驗(yàn)復(fù)篩，得到一株潛在PGPR優(yōu)良菌株GX14001。如圖1所示，與對(duì)照組相比，GX14001處理組的煙草生長(zhǎng)旺盛，植株健壯，葉片增大，根長(zhǎng)及側(cè)根數(shù)都有明顯的增長(zhǎng)。經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)分析，如圖2所示，GX14001處理組的鮮重，根長(zhǎng)，側(cè)根數(shù)，葉片長(zhǎng)及葉片寬相比對(duì)照組有極顯著差異（P＜0.01），分別增長(zhǎng)了1003.3%、58.7%、196.1%、139.6%、113.0%。

圖1 菌株產(chǎn)生的VOCs對(duì)煙草的促生作用Fig. 1 Growth-promoting effects of VOCs produced by the strains on tobacco

圖2 菌株GX14001產(chǎn)生的VOCs對(duì)煙草的促生結(jié)果分析Fig. 2 Growth-promoting effects of VOCs produced by strain GX14001 on tobacco

2.2 菌株鑒定

將GX14001測(cè)序得到的16S rRNA基因序列，在Ezbiocloud網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)分析，采用MEGA6.5構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。根據(jù)比對(duì)結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)GX14001與橙色微桿菌（Microbacterium aurantiacum）的同源性最高，親緣關(guān)系最近，因此GX14001被鑒定為橙色微桿菌。將GX14001菌株序列上傳到NCBI獲得其GenBank登錄號(hào)。

圖3 根據(jù)16S rRNA基因序列構(gòu)建菌株GX14001系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Constructed phylogenetic tree of strain GX14001 based on 16S rRNA gene sequence

2.3 盆栽實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖4所示，與對(duì)照組相比，GX14001產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)化合物對(duì)上海青有明顯的促生作用，分別在葉片長(zhǎng)，葉片寬，根長(zhǎng)，鮮重，干重方面有明顯的作用。SPSS統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，GX14001處理組在葉片長(zhǎng)，葉片寬，鮮重及干重方面有極顯著差異（P＜0.01），分別增長(zhǎng)了29.9%、29.5%、83.3%、104.8%，而在根長(zhǎng)方面沒有顯著性差異。盆栽結(jié)果再次表明菌株GX14001所產(chǎn)生的VOCs對(duì)植物有明顯的促生作用。

圖4 菌株GX14001產(chǎn)生的VOCs對(duì)上海青的促生作用Fig. 4 Growth promoting effect of VOCs produced by strain GX14001 on rape

2.4 GX14001產(chǎn)生的VOCs成分分析

通過GC-MS分析了該潛在PGPR菌株產(chǎn)生的VOCs，與空白對(duì)照相比，發(fā)現(xiàn)存在7種特異性化合物（圖 5），主要為鄰乙基甲苯，1，2，3-三甲苯、1，2，4-三甲苯、4-甲基-癸烷、十二烷、二十五烷和9-辛基-十七烷（表3）。

表3 菌株GX14001產(chǎn)生的VOCs成分Table 3 VOCs produced by strain GX14001

圖5 空白對(duì)照TSA及菌株GX14001產(chǎn)生的VOCs成分SPME-GC-MS分析總離子流圖Fig. 5 SPME-GC-MS analysis of total ion flow diagram of blank control TSA and VOCs produced by strain GX14001

2.5 菌株其他功能測(cè)定

對(duì)橙色微桿菌GX14001進(jìn)行溶解有機(jī)磷、無(wú)機(jī)磷、固氮及產(chǎn)IAA能力測(cè)定，結(jié)果如表4所示，GX14001具有一定的溶解有機(jī)/無(wú)機(jī)磷及固氮的能力，但其分泌IAA能力一般，所產(chǎn)IAA量為1.737 μg/mL。研究結(jié)果表明GX14001還有具有潛在的其他方面的促生能力。

表4 菌株溶磷固氮及IAA能力測(cè)定匯總Table 4 Summary of determining strain’s IAA and ability of fixing nitrogen and solubilizing phosphorus

3 討論

微生物大致可通過直接和間接兩個(gè)促生機(jī)制來(lái)促進(jìn)植物的生長(zhǎng)［18］。其中直接促生機(jī)制主要是通過調(diào)整植物激素濃度，增加植物對(duì)養(yǎng)分的吸收以及釋放揮發(fā)性有機(jī)化合物（VOCs）來(lái)促進(jìn)植物的生長(zhǎng)；間接促生機(jī)制是通過誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性和抑制病原菌的入侵來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)［19］。與其他促生機(jī)制不同，微生物釋放的VOCs可以在不與植物進(jìn)行物理接觸的情況下，通過提高植物生物量、抗病（蟲）性和非生物脅迫耐性來(lái)發(fā)揮對(duì)植物的促生作用，這是其優(yōu)勢(shì)所在［20］。本文主要研究了從海洋分離得到的橙色微桿菌GX14001的VOCs對(duì)植物生長(zhǎng)的促生作用，對(duì)其產(chǎn)生的VOCs成分及菌株的其他促生特性進(jìn)行了分析檢測(cè)。

迄今為止，關(guān)于PGPR所釋放的VOCs對(duì)植物促生作用的研究大多以假單胞菌屬和芽孢桿菌屬為主，微桿菌屬的報(bào)道較少。Cordovez等［21］研究表明微桿菌菌株EC8-VOCs通過調(diào)節(jié)植物根部硫和氮的代謝從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)，并且發(fā)現(xiàn)其誘導(dǎo)植物生長(zhǎng)促進(jìn)具有組織特異性的。本文研究發(fā)現(xiàn)橙色微桿菌GX14001-VOCs能夠誘導(dǎo)植物葉片和鮮重增加，在模式植物本氏煙草和經(jīng)濟(jì)作物上海青中均有體現(xiàn)。

對(duì)微生物產(chǎn)生的VOCs的收集和成分分析一般采用頂空固相微萃法［22］和氣相色譜-質(zhì)譜法。目前已報(bào)道的PGPR釋放的能促進(jìn)擬南芥生長(zhǎng)的VOCs主要有以下幾種：2，3-丁二醇以及合成2，3-丁二醇的前體乙偶姻（3-羥基-2-丁酮）［3］，低濃度的1-己醇以及高濃度的正十五烷［23］，1-癸烯［10］等。Velázquez-Becerra等［24］研究表明運(yùn)動(dòng)節(jié)桿菌UMCV2產(chǎn)生的二甲基正十六胺能促進(jìn)紫花苜蓿的生長(zhǎng)發(fā)育。Yamagiwa等［25］發(fā)現(xiàn)促進(jìn)植物生長(zhǎng)的真菌Talaromyces sp.產(chǎn)生的β-石竹烯能夠有效促進(jìn)甘藍(lán)型油菜幼苗的生長(zhǎng)。Paul等［11］研究發(fā)現(xiàn)根際促生真菌 Cladosporium cladosporioides CL-1產(chǎn)生的VOCs，α-蒎烯、（-）反式 -石竹烯、2，2，5，5-四甲基四氫呋喃、脫氫香橙烯以及（+）-苜蓿烯對(duì)煙草幼苗具有促進(jìn)能力。

本實(shí)驗(yàn)篩選得到的GX14001所產(chǎn)生的VOCs經(jīng)GC-MS分析表明，與對(duì)照相比有7種特異性化合物，可分為苯基類和烷類化合物。其中烷類化合物有4-甲基-癸烷、十二烷、二十五烷和9-辛基-十七烷四類。烷類化合物是目前已報(bào)道的具有活性的揮發(fā)性物質(zhì)，該GC-MS分析得到的十二烷和二十五烷曾在2017年被Jishma等［26］報(bào)道是能促進(jìn)植物生長(zhǎng)的VOCs成分。苯基類化合物有鄰乙基甲苯，1，2，3-三甲苯和1，2，4-三甲苯。苯基類化合物大都能在細(xì)菌/真菌的揮發(fā)性物質(zhì)中被檢測(cè)到，乙苯曾在生物測(cè)定實(shí)驗(yàn)中被發(fā)現(xiàn)具有殺蟲作用［27］，最終結(jié)果表明十二烷，1，2，3-三甲苯，鄰乙基甲苯及二十五烷的含量相對(duì)較高，結(jié)合前人研究推測(cè)GX14001釋放的VOCs起主要促生作用的成分可能為十二烷及二十五烷，關(guān)于其他成分的具體作用還需進(jìn)一步分析研究。

平板活性結(jié)果表明，橙色微桿菌GX14001還具有一定溶磷及固氮的能力，在之前的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)微桿菌屬是一類重要的溶磷細(xì)菌［28-30］。微桿菌屬在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用也可追溯到2007年，Karlidag等［31］研究發(fā)現(xiàn)微桿菌FS01和芽孢桿菌M3和/或OSU-142組合具有提高蘋果樹產(chǎn)量、生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)的潛力。Sheng等［32］從重金屬污染土壤中的油菜根分離得到微桿菌G16，研究發(fā)現(xiàn)接種G16可提高油菜生物量和總鉛吸收量，同時(shí)G16表現(xiàn)出不同的多重重金屬和抗生素抗性特征，增加了溶液和土壤中的水溶性鉛。因此微桿菌屬在農(nóng)業(yè)方面有一定的前景應(yīng)用。

本研究發(fā)現(xiàn)橙色微桿菌所釋放的VOCs具有植物促生的作用，并對(duì)其進(jìn)行了初步研究，但未對(duì)促生機(jī)理進(jìn)行探究，因此還有待于深入研究菌株所釋放的 VOCs 對(duì)植物中相關(guān)通路及基因的影響，以期能夠?yàn)槲⑸镔Y源的開發(fā)與利用提供理論支撐。此外，能否在土壤中定殖是評(píng)判PGPR的重要指標(biāo)，在實(shí)際應(yīng)用中PGPR的定殖也是其發(fā)揮作用的重要因素，之后需要對(duì)該潛在PGPR橙色微桿菌的定殖能力進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過二分隔平板實(shí)驗(yàn)及VOCs盆栽實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GX14001釋放的VOCs對(duì)煙草和上海青的根部及葉片的生長(zhǎng)都有顯著的促進(jìn)作用，該菌株經(jīng)16S rRNA分子生物學(xué)鑒定為橙色微桿菌。GC-MS結(jié)果顯示GX14001釋放的VOCs成分中起主要促生作用的成分為烷類。平板活性檢測(cè)結(jié)果顯示，GX14001菌株具有一定的溶磷和固氮作用，而產(chǎn)IAA能力較低。研究結(jié)果表明，該菌株促進(jìn)植物生長(zhǎng)主要是通過產(chǎn)生揮發(fā)性有機(jī)化合物（VOCs）來(lái)實(shí)現(xiàn)的，通過對(duì)菌株其他活性的檢測(cè)表明橙色微桿菌是促進(jìn)植物生長(zhǎng)的多功能有效菌株。