王曉云解加卓孫中濤史慶華楊越超*

土元殼和卵鞘中甲殼素結(jié)構(gòu)特征與比較分析

王曉云1,2,解加卓2,孫中濤3,史慶華1,楊越超2*

1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院, 山東 泰安 271018 2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院土肥高效利用國家工程研究中心, 山東 泰安 271018 3. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 山東 泰安 271018

本研究采用酸堿法從土元殼和孵化后的卵鞘中分離甲殼素。通過傅里葉變換紅外光譜、x射線衍射、熱重分析和掃描電鏡分析對提取的昆蟲甲殼素的理化性質(zhì)進(jìn)行測定，并進(jìn)行比較不同材料來源的甲殼素物理結(jié)構(gòu)的異同。結(jié)果表明，來源于土元殼的甲殼素與來源于卵鞘的甲殼素物理特性不同。土元殼甲殼素的紅外光譜圖譜顯示酰胺帶Ⅰ在1659和1628cm-1處分裂為兩個峰，卵鞘的在1633cm-1處為單峰；XRD顯示土元殼甲殼素具有較強(qiáng)峰，而卵鞘的峰較弱；熱重分析顯示土元殼甲殼素降解溫度高于卵鞘的，這些特征顯示土元殼甲殼素具有-甲殼素特征，卵鞘的則具有-甲殼素特征。這些結(jié)果將有助于昆蟲甲殼素的進(jìn)一步開發(fā)與應(yīng)用。

土元; 卵鞘; 甲殼素; 結(jié)構(gòu)特征

甲殼素是以單體-(1-4)-N-乙酰-D-葡萄糖胺為單元的生物聚合物，其衍生物殼聚糖是甲殼素部分脫乙酰后得到的一種線性多糖，由N-乙酰氨基葡萄糖單元和D-氨基葡萄糖單元組成。甲殼素及其衍生物是地球上僅次于纖維素的天然長鏈多糖，作為一種天然生物聚合物具有生物相容性、可降解性、非毒性等生物特性，在復(fù)合材料、生物醫(yī)藥、化妝品、食品、農(nóng)業(yè)、和廢水處理等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景，多年來一直是研究人員關(guān)注的焦點[1-4]。甲殼素廣泛分布于節(jié)肢動物、軟體動物、環(huán)節(jié)動物及真菌和酵母中，大量生產(chǎn)甲殼素的原料主要是海洋甲殼綱動物（如蝦、龍蝦和螃蟹等）的殼[5-8]。

近年來，人們對來源于昆蟲中的甲殼素和殼聚糖的研究頗有興趣[3,9,10]。在國外，昆蟲因其高蛋白含量而受到廣泛關(guān)注，如黃粉蟲、蠅蛆等昆蟲作為健康食品/飼料在世界各地被消費，并獲得歐盟委員會批準(zhǔn)作為一種新型食品[11,12]。在中國，昆蟲因其多種的應(yīng)用價值備受關(guān)注，根據(jù)昆蟲用途不同，被分為食用資源昆蟲、醫(yī)藥資源昆蟲、飼料資源昆蟲、工業(yè)原料資源昆蟲、觀賞資源昆蟲、娛樂資源昆蟲、害蟲天敵資源昆蟲、植物傳粉資源昆蟲和其他用途的資源昆蟲[13]。藥用資源昆蟲是中國醫(yī)藥寶庫中特有的一個重要部分，已經(jīng)有3 000多年的歷史，目前記載入藥的昆蟲達(dá)兩百多種[14,15]。由于野生資源的急劇減少，藥用昆蟲數(shù)量需求的增加，地鱉蟲、蜜蜂、斑螯、洋蟲、五倍蚜和紫膠蟲等部分藥用昆蟲已經(jīng)成功實現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)，為人們提供了充足的藥源[15,16]。

土元，學(xué)名中華真地鱉蟲(Walker)，是昆蟲綱中以雌蟲干燥體為中藥的昆蟲，具有活血化瘀的功用，現(xiàn)代生化分子及藥理試驗也證明了土元具有抗凝血、抗腫瘤、抑制血小板聚集、溶解靜脈血栓等藥效[17,18]。隨著科技進(jìn)步和人們對土元的深入研究，土元及其副產(chǎn)品逐步進(jìn)入藥品、保健品、飼料、有機(jī)肥等行業(yè)當(dāng)中，也已經(jīng)實現(xiàn)了規(guī)?；Ⅲw養(yǎng)殖[19,20]。昆蟲表皮的主要成分被普遍認(rèn)為是甲殼素等有機(jī)材料的有效替代來源，特別是含有低水平無機(jī)物的角質(zhì)層[3,21]。研究發(fā)現(xiàn)，土元蟲體、蛻皮、卵鞘等含有大量的甲殼素類物質(zhì)，其全蟲、體壁、蛻和剛蛻皮的雌成蟲甲殼素平均含量分別為11.50%，12.99%，11.02% 和3.15%[22,23]。如果不能資源化利用，不僅造成浪費，還污染環(huán)境，如天津市武清縣某一養(yǎng)殖公司每年卵鞘等部分丟棄量就達(dá)10余t[24]。另外，山東、河南、江蘇等地都有土元養(yǎng)殖合作社，卵鞘和土元殼的量都較大[25]。本研究是利用土元養(yǎng)殖場產(chǎn)生的土元殼和卵鞘，進(jìn)行甲殼素的資源化提取、特征分析，并比較二者提取物質(zhì)的異同，旨在為昆蟲甲殼素類物質(zhì)的應(yīng)用提供理論依據(jù)，同時為土元養(yǎng)殖產(chǎn)生的廢棄物資源化利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

土元殼（簡寫為T）和卵鞘（簡寫為L），均購自山東曹縣土元養(yǎng)殖合作社。將土元殼（T）和卵鞘（L）分別用水清洗，然后在60℃烘箱干燥48h后備用。甲殼素提取的化學(xué)物質(zhì)為鹽酸、氫氧化鈉和過氧化氫，所用試劑均為分析級，購自天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠。

1.2 甲殼素的提取

甲殼素處理方法參考唐慶峰等[22]方法：將干燥的土元殼（T）和卵鞘（L），先用5% HCl脫鈣2h，自來水沖洗至中性，然后用5% NaOH脫蛋白2h，過濾后用10% NaOH處理1h，清洗至中性后烘干，得到甲殼素粗品（T1、L1），再采用10% H2O2脫色，在60℃條件處理1h，在室溫下放置24h后，進(jìn)行過濾，濾渣為白色的甲殼素（T3、L3）。

1.3 甲殼素的表征

1.3.1 紅外光譜（FT-IR）通過酸堿法得到的甲殼素粗產(chǎn)品和脫色后的甲殼素產(chǎn)品采用FT- IR（Nicolet IS10尼高力紅外光譜儀，USA）進(jìn)行表征。FT- IR光譜掃描范圍400～4000 cm-1，光譜分辨率為4cm-1。每個樣本共進(jìn)行64次掃描。

1.3.2 X射線分析對產(chǎn)品進(jìn)行X射線衍射（X射線衍射儀D8 ADVANCE，BRUKER，GErM）表征。樣品均勻干燥，粒度小于70μm（過200目）。管電流：10～60mA，管電壓：20～60kV(1kV/1step)；角度范圍（2θ）：5～40°；溫度范圍：室溫～600℃；測角儀半徑≥200mm。

1.3.3 熱重分析采用熱重分析儀（MEITTLER TGA/DSC 1 SF/1382，USA），對提取的甲殼素產(chǎn)品的熱降解性能測試。從每個樣品取10.00 mg，試驗在氮氣環(huán)境下以10℃·min-1的升溫速率進(jìn)行。

1.3.4 掃描電鏡分析采用掃描電鏡（SU8010SEM，JAP）觀察所有樣品的微觀結(jié)構(gòu)和形貌。同時通過對樣品微區(qū)、亞微區(qū)成分進(jìn)行分析定性、定量分析，可確定樣品的組成。分辨率：1.0 nm(15kV)；1.4nm (1kV，WD=1.5 mm，減速模式)；2.0 nm(1kV，WD=1.5 mm，普通模式）。為了獲得清晰準(zhǔn)確的圖像，對樣品進(jìn)行了噴金處理。

2 結(jié)果分析

2.1 甲殼素提取物及紅外光譜分析

通過酸堿法從土元殼（T）和卵鞘（L）得到的脫色前的粗提取物（T1和L1）和脫色后的產(chǎn)品（T3和L3），粗提物脫色后的甲殼素為不溶于水的白色片狀物質(zhì)如圖1。來源不同的粗體物和甲殼素產(chǎn)品，從顏色看甲殼素都是白色，但土元殼的甲殼素質(zhì)地較軟，而卵鞘甲殼素較脆。

圖1 土元殼和卵鞘粗提物和甲殼素

T1：從土元殼提取的粗提物；T3：土元殼甲殼素；L1：從卵鞘提取的粗提物；L3：卵鞘甲殼素。下同。

T1:Crude extract extracted from Slough; T3: Chitin from Slough; L1:Crude extract from Ootheca; L3: Chitin from Ootheca. Same as follow.

由圖2知，土元殼的提取物中，在1 628～1 659 cm-1，1 557 cm-1和1 260～1 320 cm-1處具有甲殼素典型的酰胺Ⅰ譜帶、酰胺Ⅱ譜帶、酰胺Ⅲ譜帶出現(xiàn)的位置，且T1在1 630 cm-1和1 656 cm-1、T3在1 628 cm-1和1 659 cm-1在均被分成兩個譜帶，這是α-甲殼素的特征。而土元卵鞘產(chǎn)物分別在1 632 cm-1，1 515 cm-1和1 236 cm-1具有3個譜帶的吸收峰。另外，土元殼提取物T1在3 429 cm-1和T3在3 446 cm-1處表現(xiàn)振動譜帶，對應(yīng)于-OH的伸縮振動峰，二者均在3 107 cm-1和3 270 cm-1附近具有-NH的伸縮振動峰；而L1和L3在3 407 cm-1附近的譜帶對應(yīng)于-OH伸縮振動峰；四種物質(zhì)均在2 870～2 962 cm-1的范圍內(nèi)具有次甲基、亞甲基和甲基的伸縮振動引起的振動峰。

3.2 X衍射圖譜

由圖3 XRD圖譜知，土元殼提取物T1在2θ= 9.12°、19.17°、20.69°、26.57°和27.46°，T3在2θ= 9.12°、19.18°、20.79°、26.57°和27.82°附近具有衍射吸收峰。而土元卵鞘提取物L(fēng)1在2θ = 9.12°、19.45°和29.42°，L3在2θ= 9.30°、18.83°、和26.57°附近具有較弱的吸收峰。

圖3 土元殼和卵鞘粗提物和甲殼素的XRD譜圖

2.3 熱重分析

圖4 熱重分析

由圖4可以看出，提取物的熱重曲線上均表現(xiàn)出兩個降解階段，第一階段質(zhì)量損失是由于所獲得的甲殼素中水分蒸發(fā)所致，土元殼的提取物最大失重溫度稍高于卵鞘的，T1和T3的失重率分別為6.3%和2.7%，L1和L3失重率分別為5.1%和4.2%。第二階段的質(zhì)量損失是由于多糖結(jié)構(gòu)分解，甲殼素分子脫去乙?；?，土元殼提取物最大失重溫度分別為380.0和370.4 ℃，相對應(yīng)的失重率分別為50.8%和68.2%，而卵鞘提取物L(fēng)1和L3的最大失重溫度分別為338.5和341.3 ℃左右，相應(yīng)的失重率分別為68.8%和75.8%。提取物的殘留率率相比，L1（25.1%）高于L3（20.0%），T1（42.9%）高于T3（29.1%），從土元殼中所獲得的甲殼素的殘留率高于從卵鞘中獲得的。

表 1 熱重分析

2.4 掃描電子顯微鏡

圖5是通過掃描電子顯微鏡技術(shù)得到圖像，通過表面形態(tài)SEM分析，可以看出土元殼和卵鞘的提取物的表面結(jié)構(gòu)具有納米纖維的形態(tài)，與樣品的基本結(jié)構(gòu)相似。土元殼粗提物T1表面光滑，有少量礦物質(zhì)晶粒，表面毛刺直立；經(jīng)過氧化氫脫色處理后，T3表面有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，毛刺變軟。卵鞘的L1表面有起伏的龍骨，沒有任何孔隙和空隙。表面礦物質(zhì)晶粒較多，脫色后，表面的晶粒減少。表面元素分析顯示C、O、Ca三種元素含量高，Mg和S含量少。

圖5 土元殼和卵鞘粗提物和甲殼素的SEM圖及元素分析

3 討論與結(jié)論

昆蟲甲殼素在其不同的身體部位以及不同的發(fā)育階段，如幼蟲、蛹和成蟲的甲殼素分布有所不同[2,21,22]。采用FT-IR、XRD、TGA和SEM等發(fā)現(xiàn)，土元殼和土元卵鞘的殼中甲殼素結(jié)構(gòu)不同。紅外光譜可用于研究甲殼素晶型結(jié)構(gòu)，甲殼素有典型的三個酰胺譜帶，1 650 cm-1左右是酰胺1譜帶，1 555 cm-1左右是酰胺Ⅱ譜帶，1 310 cm-1左右是酰胺Ⅲ譜帶[26,27]。-甲殼素是由反向排列的糖鏈組成，酰胺Ⅰ帶的吸收在1655和1620cm-1附近會出現(xiàn)兩個吸收峰，而-甲殼素是由同向排列的糖鏈組成，一般僅出現(xiàn)一個吸收峰[27,28]。本研究發(fā)現(xiàn)，土元殼在1658和1628 cm-1附近為雙峰，卵鞘在1633cm-1附近為單峰，因此，初步判斷土元殼提取物均是-甲殼素，卵鞘提取物均是-型甲殼素。Kaya M[29]對3種蟑螂（東方大蠊、德國小蠊、美洲大蠊）的卵鞘甲殼素進(jìn)行紅外光譜分析，分別在1651、1621和1555 cm-1、1656、1621、1542 cm-1和1574、1623、1537 cm-1處觀測到紅外光譜，符合-甲殼素特征。目前，所有節(jié)肢動物的角質(zhì)層中都發(fā)現(xiàn)了異型體，并被認(rèn)為這是蛻皮動物的一個非異型特征[30]。但由于紅外光譜受到脫乙酰度和結(jié)晶度的影響[31]，提取物的具體結(jié)構(gòu)還要參照其他方法。

Jang MK等[32]研究表明，-甲殼素在9.6、19.6、21.1和23.7處有四種晶體反射峰，而-甲殼素在9.1和20.3處有兩個晶體反射峰。本研究從XRD衍射圖可以看出，土元殼的甲殼素有5個峰，其中有兩個尖銳的峰，與-甲殼素的XRD圖譜相似；卵鞘的衍射峰少、強(qiáng)度較小、峰形較寬，與-甲殼素的圖譜相似。Kaya M等[27]認(rèn)為在XRD衍射圖中，尖峰表明材料具有較高的結(jié)晶度，-甲殼素比-甲殼素具有更強(qiáng)的晶體結(jié)構(gòu)。

結(jié)晶性不同，熱穩(wěn)定性也不同，300℃以上的溫度，直接從晶體發(fā)生熱分解，因而熱分解溫度表征了結(jié)晶的穩(wěn)定性[28]。本研究中土元殼提取的甲殼素最大降解溫度(DTGmax)約為367.8和384.1℃，而從卵鞘提取的物質(zhì)最大降解溫度分別為338.5和341.3℃，這與Kaya M等[27]的研究結(jié)果一致。DTGmax常用于確認(rèn)甲殼素異構(gòu)體，DTGmax值小于350℃是-甲殼素，而大于350℃是-甲殼素[32,33]。Sagheer FAA等[34]認(rèn)為-甲殼素異構(gòu)體的低熱穩(wěn)定性歸因于其較低的晶體結(jié)構(gòu)。在-甲殼素中，多糖鏈以反平行的方式排列，導(dǎo)致片間和片內(nèi)的氫鍵很強(qiáng)。相比之下，-甲殼素薄片采用平行構(gòu)型，鏈間形成較弱的片內(nèi)氫鍵網(wǎng)絡(luò)。

前人研究了魷魚骨中分離得到了-甲殼素，并與蝦類分離得到的-甲殼素進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)β-甲殼素在堿性脫乙酰反應(yīng)中的活性明顯高于-甲殼素，且在去乙酰化過程中更容易破壞無定形的晶體結(jié)構(gòu)。-甲殼素對有機(jī)溶劑和水具有良好的親和力，-甲殼素和殼聚糖也表現(xiàn)出比-甲殼素和殼聚糖高得多的吸濕性和吸水率，被認(rèn)為是一種有用的高親水性材料[35]。土元卵鞘甲殼素的型結(jié)構(gòu)的理化性質(zhì)有待進(jìn)一步研究。

此外，利用掃描電鏡可對提取甲殼素前后的昆蟲角質(zhì)層進(jìn)行原位觀察，分離角質(zhì)層甲殼素的SEM顯示清晰的甲殼素束，其觀察結(jié)果與甲殼素的已知特征一致。Kaya M等[36]利用掃描電鏡對3種蟑螂的卵鞘進(jìn)行了物理化學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)三種蟑螂卵鞘的甲殼素表面形態(tài)呈高度纖維狀，并伴有一些高度且很少多孔的區(qū)域。對舌形蟲甲殼素上進(jìn)行掃描電鏡觀察的結(jié)果一致[37]。相比之下，在研究的少數(shù)β-甲殼素例子中，纖維幾乎不可見[27,35]，這一觀察對鑒別甲殼素異型的意義尚不完全清楚。

4 結(jié) 論

土元是一種傳統(tǒng)的中藥材，目前主要靠養(yǎng)殖獲得原料，土元的養(yǎng)殖技術(shù)和養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，已經(jīng)實現(xiàn)了工廠化養(yǎng)殖，這為甲殼素工廠化提供了條件。從土元殼和卵鞘中提取的物質(zhì)進(jìn)行紅外光譜分析，X射線衍射及熱重分析，均發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)不同，來源于土元殼的甲殼素是-型，卵鞘的為-型。本研究結(jié)果為昆蟲甲殼素進(jìn)一步的開發(fā)利用提供了理論支持。

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Structure Characteristics and Comparison of Chitin from Slough and Ootheca of

WANG Xiao-yun1,2, XIE Jia-zhuo2, SUN Zhong-tao3, SHI Qing-hua1, YANG Yue-chao2*

1.271018,2.271018,3.271018,

In this study, crude extract and chitin were isolated from Eupolyphaga slough andootheca after hatching by acid-base method. The physical properties of the extracted insect chitin were determined using Fourier transform infrared spectroscopy, X-ray diffraction, thermogravimetric analysis and scanning electron microscopy and compared the properties of them. The results showed that the physical properties of the chitin from Eupolyphaga sloughs were different from those from oocytes. The IR spectra of the extracts from sloughs showed that the amide Ⅰ was split into two peaks at 1659 and 1628 cm-1, and the extracts from ootheca had one peak at 1633 cm-1. The XRD results show that the extracts from sloughs have strong peaks, and thermogravimetric analysis showed that the degradation temperature of extracts was higher than these from ootheca. These characteristics indicated that the extracts were chitin that crude extract and chitin were isolated from Eupolyphaga slough had α-chitin structure, while these from ootheca had β-chitin characteristics. These results will contribute to the further development and application of insect chitin.

; ootheca; chitin; structure characteristics

Q969.9

A

1000-2324(2022)02-0215-07

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.02.006

2021-12-10

2022-02-20

山東省蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系SDAIT-05;山東農(nóng)業(yè)大學(xué)科研啟動資助經(jīng)費(72098);山東省重點研發(fā)計劃子課題(2021CXGC010810-03);中國博士后科學(xué)基金(294570);山東省重大科技創(chuàng)新工程(Grant No. 2021CXGC010804-05-02);國家重點研發(fā)計劃(Grant# 2021YFD190090103)

王曉云(1975-),女,研究生,講師,研究方向:蔬菜栽培生理. E-mail:wxyun02@163.com

Author for correspondence. E-mail:yangyuechao2010@163.com