劉婷 張紅2 萬億3 李曉宇 任明翰 王斌4 田字彬

(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，山東 青島 266021； 2 青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、公共衛(wèi)生學(xué)院；3 青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)實驗室； 4 青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院特種醫(yī)學(xué)實驗室)

全球范圍內(nèi)胃癌發(fā)病率居惡性腫瘤的第5位，居癌癥死亡原因的第3位，近年來胃癌的發(fā)病率呈逐年增加趨勢，進(jìn)展期胃癌雖可進(jìn)行手術(shù)、化療和放療等相關(guān)治療[1-3]，但在改善進(jìn)展期胃癌患者的長期生存率方面還存在一定的局限性，因此迫切需要進(jìn)一步的探索胃癌的發(fā)生機(jī)制和尋找主要的致病基因，為胃癌的精準(zhǔn)治療提供數(shù)據(jù)參考。

近年來腫瘤分子標(biāo)記物的早期檢測備受關(guān)注，腫瘤微環(huán)境(TME)與實體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，胃癌與TME的相關(guān)性也是目前胃癌研究的熱點之一[4-5]。TME是一個復(fù)雜的綜合系統(tǒng),主要由腫瘤細(xì)胞及其周圍的免疫細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞以及附近的間質(zhì)組織、微血管、各種細(xì)胞因子和趨化因子構(gòu)成，TME的改變對腫瘤患者的療效和預(yù)后均會產(chǎn)生影響[6]。TME評分包括基質(zhì)評分以及免疫評分，是采用ESTIMATE算法對TME中的基質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞以及腫瘤純度進(jìn)行估計計算而得來。目前臨床普遍以TME評分作為篩選前列腺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌的生物標(biāo)記物的指標(biāo)之一[7-10]。本研究首先通過運用CIBERSORT和ESTIMATE算法對TCGA數(shù)據(jù)庫中胃癌樣本計算基質(zhì)評分以及免疫評分，然后分析基質(zhì)評分、免疫評分與患者生存率以及胃癌臨床病理特征的相關(guān)性，篩選出與胃癌患者生存率和預(yù)后密切相關(guān)的差異表達(dá)基因(DEGs)，旨在為胃癌的臨床治療能夠提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 胃癌組織樣本基質(zhì)評分和免疫評分與患者生存率的相關(guān)性分析

從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)中下載胃癌組織及癌旁正常組織樣本的轉(zhuǎn)錄組RNA-seq數(shù)據(jù)，通過R語言軟件轉(zhuǎn)換后，再使用R語言中的“estimate”軟件包計算每個胃癌樣本的基質(zhì)成份和免疫成份比例，進(jìn)一步獲得基質(zhì)評分和免疫評分；按照ESTIMATE算法中的要求，將基質(zhì)評分和免疫評分以中位數(shù)為界限，分為高基質(zhì)評分、低基質(zhì)評分、高免疫評分、低免疫評分，繪制Kaplan-Meier生存曲線并進(jìn)行Log-rank檢驗，分析胃癌患者樣本基質(zhì)評分、免疫評分與患者生存率的相關(guān)性。

1.2 基質(zhì)評分、免疫評分與胃癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析

下載TCGA數(shù)據(jù)庫中胃癌患者臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)，包括grade分級(G1、G2、G3)、Stage分期(StageⅠ、StageⅡ、StageⅢ)、TNM分期(T分期、N分期、M分期)，再通過R語言軟件分析胃癌患者的臨床病理特征與樣本基質(zhì)評分、免疫評分的相關(guān)性。

1.3 DEGs的初步篩選并進(jìn)行KEGG和GO富集分析

對從數(shù)據(jù)庫中下載的胃癌組織與癌旁正常組織數(shù)據(jù)通過R語言軟件轉(zhuǎn)換以后，進(jìn)一步通過R語言“l(fā)imma”軟件包分析獲得胃癌組織與癌旁正常組織的DEGs。使用R語言“enrichplot”“ClusterProfi-ler”“ggplot2”和“org.Hs.eg.db”軟件包對初步篩選出的DEGs進(jìn)行KEGG和GO富集分析，以P(調(diào)整后的P值)<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)并篩選關(guān)鍵DEGs

通過STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)對胃癌組織與癌旁正常組織的DEGs構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，以置信水平>0.9設(shè)為過濾值，使用Cytoscape(version 3.6.1，https://cytoscape.org)對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行評分及重構(gòu)，提取網(wǎng)絡(luò)中的前150個DEGs。采用R語言“survival”軟件包對胃癌組織樣本進(jìn)行單變量COX回歸分析，篩選出與胃癌患者生存具有顯著相關(guān)性的DEGs，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義，并按照P值從小到大的順序進(jìn)行排序。將單因素COX回歸分析獲得的DEGs與PPI網(wǎng)絡(luò)中的前150個DEGs取交集，獲得顯著DEGs。采用R語言軟件分別對獲得的每一個顯著DEGs在胃癌組織和癌旁正常組織中進(jìn)行樣本配對分析、患者生存率分析以及臨床病理特征相關(guān)性分析以后，篩選出關(guān)鍵DEGs。

1.5 關(guān)鍵DEGs的基因集富集分析(GSEA)

通過R語言軟件對關(guān)鍵DEGs進(jìn)行GSEA，以同時滿足P<0.05、NOMP<0.05、|NES|>1為有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.6 TME中腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞(TICs)類型及比例、TICs差異分析以及TICs與關(guān)鍵基因的相關(guān)性分析

通過CIBERSORT方法計算所有胃癌組織樣本TME中TICs的類型和比例。以關(guān)鍵DEGs表達(dá)水平的中位值為閾值，將關(guān)鍵DEGs分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，對同一種TICs在關(guān)鍵DEGs高表達(dá)組和低表達(dá)組的占比與癌旁正常組織間進(jìn)行差異分析，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義，并對TICs與關(guān)鍵DEGs表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基質(zhì)評分和免疫評分與胃癌患者生存率的相關(guān)性分析

從TCGA數(shù)據(jù)庫共下載胃癌組織及癌旁正常組織樣本407例，其中375例胃癌組織樣本，32例癌旁正常組織樣本。通過R語言軟件分析并計算胃癌組織樣本的基質(zhì)評分和免疫評分，并繪制Kaplan-Meier生存曲線顯示，高基質(zhì)評分與患者生存率呈負(fù)相關(guān)(P=0.030)(圖1A)，免疫評分與患者生存率無顯著相關(guān)性(圖1B)。

2.2 基質(zhì)評分、免疫評分與胃癌患者臨床病理特征相關(guān)性分析

對基質(zhì)評分、免疫評分與胃癌患者臨床病理特征進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，基質(zhì)評分和免疫評分均與胃癌grade分級、Stage分期、TNM分期的T分期呈顯著相關(guān)(P<0.05)，見圖2。基質(zhì)評分和免疫評分與TNM分期的N分期及M分期不具有顯著相關(guān)性(P>0.05)。

2.3 DEGs的篩選及其KEGG和GO富集分析

通過R語言軟件分析后，共獲得胃癌組織與癌旁正常組織的DEGs 1 305個，其中1 070個DEGs表達(dá)上調(diào)，235個DEGs表達(dá)下調(diào)。進(jìn)而對1 305個DEGs進(jìn)行KEGG富集分析結(jié)果顯示，這些DEGs主要參與了免疫應(yīng)答過程，其中排列在前4位的主要通路分別為細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路、細(xì)胞黏附分子、B細(xì)胞受體信號通路和原發(fā)性免疫缺陷；GO富集分析結(jié)果顯示，DEGs主要參與免疫應(yīng)答過程，如免疫反應(yīng)激活表面受體信號通路、免疫反應(yīng)激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及淋巴細(xì)胞免疫、體液免疫反應(yīng)。

2.4 顯著DEGs的篩選及其與患者預(yù)后等相關(guān)性分析結(jié)果

對1 305個DEGs通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并使用Cytoscape提取出PPI網(wǎng)絡(luò)中的前150個DEGs。對胃癌組織樣本進(jìn)行單因素COX 回歸分析，共篩選出18個與胃癌患者生存具有顯著相關(guān)性的DEGs，與PPI網(wǎng)絡(luò)提取出的150個DEGs取交集后，獲得5個顯著DEGs，分別為MCEMP1、HTR2A、PTGFR、F13A1和HGF。采用R語言軟件分別對上述5個顯著DEGs進(jìn)行樣本配對分析，結(jié)果顯示，僅F13A1、MCEMP1在胃癌組織與癌旁正常組織中的表達(dá)有顯著差異(P<0.05)；患者的生存分析結(jié)果顯示，F(xiàn)13A1、MCEMP1低表達(dá)患者的中位生存時間均顯著高于高表達(dá)患者(P<0.05)；另一方面與臨床病理特征相關(guān)性分析顯示，F(xiàn)13A1、MCEMP1的表達(dá)與grade分級、Stage分期、TNM分期的T分期及N分期均顯著相關(guān)(P<0.05)，通過上述分析得出F13A1、MCEMP1為關(guān)鍵DEGs。

A:基質(zhì)評分與患者生存率的相關(guān)性，B:免疫評分與患者生存率的相關(guān)性圖1 基質(zhì)評分、免疫評分與患者生存率的相關(guān)性Fig.1 Correlation between Stromal Score and Immune Score and survival rate of patients

A:基質(zhì)評分與胃癌grade分級的相關(guān)性；B:基質(zhì)評分與胃癌Stage分期的相關(guān)性；C:基質(zhì)評分與胃癌T分期的相關(guān)性；D:免疫評分與胃癌grade分級的相關(guān)性；E:免疫評分與胃癌Stage分期的相關(guān)性；F:免疫評分與胃癌T分期的相關(guān)性圖2 基質(zhì)評分、免疫評分與胃癌患者臨床病理特征的相關(guān)性Fig.2 Correlation between Stromal Score and Immune Score and clinicopathological features of patiants with gastric cancer

2.5 關(guān)鍵DEGs的GSEA

關(guān)鍵DEGs的GSEA結(jié)果顯示，F(xiàn)13A1的高表達(dá)與結(jié)直腸癌、前列腺癌腫瘤相關(guān)通路以及JAK/STAT和MAPK信號通路顯著相關(guān)，MCEMP1的低表達(dá)與抗原加工和呈遞、半乳糖代謝、糖胺聚糖降解、自然殺傷(NK)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、Nod樣受體信號通路、蛋白酶體和Toll樣受體信號通路具有相關(guān)性(P<0.05)。

2.6 關(guān)鍵DEGs與TICs比例的差異及相關(guān)性

CIBERSORT算法結(jié)果顯示，每一例胃癌組織樣本中含有22種TICs。F13A1、MCEMP1與22種TICs的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在F13A1高表達(dá)和低表達(dá)的胃癌組織樣本中，F(xiàn)13A1的表達(dá)與8種TICs存在顯著相關(guān)性(P<0.05)，其中M0巨噬細(xì)胞、T調(diào)節(jié)(Treg)細(xì)胞與F13A1的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，活化的樹突狀細(xì)胞、靜息的樹突狀細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、靜息的肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞與F13A1的表達(dá)均呈顯著正相關(guān)(|R|>0.1)。另外MCEMP1的表達(dá)與14種TICs存在顯著相關(guān)性(P<0.05)，其中幼稚B細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞、活化的NK細(xì)胞、靜息忘記性CD4陽性T細(xì)胞、Treg細(xì)胞與MCEMP1的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，活化的樹突狀細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、活化的肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、靜息NK細(xì)胞、活化的CD4陽性細(xì)胞和γδT細(xì)胞與MCEMP1的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(|R|>0.1)。

3 討 論

胃癌早期癥狀隱匿，大多數(shù)患者就診時已經(jīng)處于進(jìn)展期[11]，傳統(tǒng)的治療方式對于進(jìn)展期胃癌的療效有限，進(jìn)展期胃癌5年生存率不足10%。近年來分子靶向治療在胃癌領(lǐng)域有一定進(jìn)展，但僅有部分人群獲益。TME在腫瘤的發(fā)生發(fā)展方面起著關(guān)鍵性的作用，因此從TME角度去探索腫瘤潛在的治療靶標(biāo)對深入研究腫瘤的發(fā)病機(jī)制有著極其重要的意義和價值[12-13]。另外許多研究結(jié)果表明，TME與胃癌的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)[14-15]，TME中的TICs與胃癌患者的臨床預(yù)后密切相關(guān)[16]。

本研究通過下載TCGA數(shù)據(jù)庫中胃癌及癌旁正常組織樣本數(shù)據(jù)，計算胃癌患者樣本中基質(zhì)成份及免疫成份比例，獲得基質(zhì)和免疫評分，并對基質(zhì)評分、免疫評分與患者生存及胃癌臨床病理特征進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示基質(zhì)評分越高，患者生存率越低、腫瘤組織分化程度越低、分期越晚，提示TME中的基質(zhì)評分可能適用于預(yù)測胃癌患者的預(yù)后。為進(jìn)一步分析DEGs的作用機(jī)制和途徑，本研究對胃癌組織與癌旁正常組織中的DEGs進(jìn)行了KEGG及GO富集分析，提示所有DEGs主要參與了免疫應(yīng)答過程。隨后通過對DEGs構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)以及對胃癌組織樣本進(jìn)行單變量COX回歸分析，進(jìn)一步篩選得到5個顯著DEGs。通過對顯著DEGs在胃癌組織和癌旁正常組織中進(jìn)行樣本配對分析，獲得2個關(guān)鍵DEGs。對關(guān)鍵DEGs在胃癌組織和癌旁正常組織中進(jìn)行患者生存率分析以及臨床病理特征相關(guān)性分析，提示腫瘤組織分化程度越低、分期越晚、淋巴結(jié)受累越多，F(xiàn)13A1、MCEMP1表達(dá)水平越高，提示F13A1、MCEMP1參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展，并且F13A1、MCEMP1的表達(dá)可能對胃癌的發(fā)展和患者的預(yù)后有著重要影響。為進(jìn)一步分析關(guān)鍵DEGs參與的信號通路，以及進(jìn)一步明確關(guān)鍵DEGs與TME之間的關(guān)系，本研究又對關(guān)鍵DEGs進(jìn)行了GSEA并分析了關(guān)鍵DEGs與22種TICs的相關(guān)性，結(jié)果顯示F13A1、MCEMP1與多種TICs相互關(guān)聯(lián)，在胃癌TME中的表達(dá)對免疫細(xì)胞激活相關(guān)的信號通路和細(xì)胞毒性作用有較大影響。提示F13A1、MCEMP1是一種潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物，也許可作為胃癌的治療靶點。

研究發(fā)現(xiàn)F13A1、MCEMP1是胃癌的高?；?，可分別獨立用于預(yù)測胃癌患者的生存和預(yù)后。F13A1也稱為凝血因子A，是一種谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，可以交聯(lián)纖維蛋白形成穩(wěn)定的血凝塊，也可在炎癥和血管生成過程中發(fā)揮作用。F13A1在血栓性疾病形成過程中充當(dāng)重要角色，F(xiàn)13A1基因和蛋白在血漿中的表達(dá)水平及活性均與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。另有研究表明F13A1與多種癌癥的增殖以及轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且與M2巨噬細(xì)胞的極化顯著相關(guān)[17-19]。結(jié)合本研究結(jié)果，可以推測F13A1在胃癌的發(fā)展中起著促進(jìn)作用。

MCEMP1主要由單核細(xì)胞和肥大細(xì)胞表達(dá)，編碼一種單向跨膜蛋白，可參與調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞分化或免疫應(yīng)答過程。腫瘤內(nèi)肥大細(xì)胞的增加可促進(jìn)免疫抑制和胃癌的進(jìn)展[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)，MCEMP1在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)中起著重要作用，與先天免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，其缺失可增加T淋巴細(xì)胞的活性、NK細(xì)胞的活性和免疫球蛋白的表達(dá)水平，抑制炎癥因子的釋放，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡[22]。研究發(fā)現(xiàn)MCEMP1的高表達(dá)與膀胱癌的發(fā)生和患者不良預(yù)后顯著相關(guān)[20]。另外HU等[23]構(gòu)建的胃癌患者預(yù)后的預(yù)測風(fēng)險模型中也顯示，MCEMP1可以作為預(yù)測胃癌進(jìn)展和預(yù)后的生物標(biāo)記物。結(jié)合本研究結(jié)果，可以推測MCEMP1與胃癌的預(yù)后密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)13A1、MCEMP1基因表達(dá)與M2巨噬細(xì)胞呈顯著相關(guān)。M2巨噬細(xì)胞又稱狹義的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)，主要由單核細(xì)胞分化而來，腫瘤細(xì)胞分泌的集落刺激因子等趨化因子能招募外周血中的單核細(xì)胞到TME中，從而使單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。據(jù)報道TAMs對甲狀腺乳頭狀癌與乳腺癌的細(xì)胞增殖、血管生成、免疫抑制起著促進(jìn)作用[24-25]。有研究證明胃癌TME中浸潤的TAMs以M2亞型巨噬細(xì)胞為主，發(fā)揮著促進(jìn)腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用[26]。本研究結(jié)果提示，隨著F13A1、MCEMP1表達(dá)水平的上調(diào)，存在于胃癌TME中的主導(dǎo)反應(yīng)從抗腫瘤免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榇龠M(jìn)腫瘤細(xì)胞代謝反應(yīng)。此外本研究GSEA結(jié)果也提示，F(xiàn)13A1表達(dá)與JAK/STAT和MAPK等腫瘤相關(guān)的信號通路具有顯著相關(guān)性，這也提示F13A1、MCEMP1可能與胃癌的發(fā)展和患者的預(yù)后具有密切相關(guān)性。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)方法篩選了與胃癌的進(jìn)展和患者的預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因。研究發(fā)現(xiàn)在胃癌的TME中，F(xiàn)13A1、MCEMP1高表達(dá)對胃癌的發(fā)展起著促進(jìn)作用，與胃癌患者的臨床預(yù)后密切相關(guān)，對胃癌患者的預(yù)后預(yù)測和治療指導(dǎo)有重要意義。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

作者貢獻(xiàn)：劉婷、王斌、田字彬參與了研究設(shè)計；劉婷、李曉宇、張紅、萬億、任明翰、田字彬參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions： The study was designed byLIUTing,WANGBin, andTIANZibin. The manuscript was drafted and revised byLIUTing,LIXiaoyu,ZHANGHong,WanYi,RENMinghan, andTIANZibin. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.