周文期 劉忠祥 王曉娟 何海軍 周玉乾 楊彥忠 連曉榮 李永生

摘要：為了利用生物學(xué)技術(shù)和手段來解決農(nóng)業(yè)問題，讓基因組測(cè)序技術(shù)、轉(zhuǎn)基因及基因編輯等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)為農(nóng)業(yè)遺傳育種服務(wù)，實(shí)現(xiàn)常規(guī)育種與分子設(shè)計(jì)育種的緊密結(jié)合，加速作物精準(zhǔn)育種進(jìn)程，近年頗受學(xué)術(shù)界關(guān)注?，F(xiàn)梳理了一些分子生物學(xué)專用名詞概念，概述了目前在正向遺傳學(xué)研究中如何利用極端表型材料基于全基因組測(cè)序的BSA-Seq方法（MutMap法、MutMap+法、MutMap-Gap法、QTL-seq法）快速定位重要農(nóng)藝性狀的QTL/基因，為快速定位和克隆候選基因提供新思路。

關(guān)鍵詞：QTL定位; BSA-Seq方法;遺傳群體;基因克隆;農(nóng)藝性狀;分子育種

中圖分類號(hào)：S336;Q78 ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? ? ? ? ?文章編號(hào)：1001-1463（2022）04-0001-10

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2022.04.001

Rapid Mapping of QTL/gene for Agronomic Traits in Crops Using BSA-Seq Method

ZHOU Wenqi， LIU Zhongxiang， WANG Xiaojuan， HE Haijun， ZHOU Yuqian， YANG Yanzhong， LIAN Xiaorong， LI Yongsheng

（Institute of Crops， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：In order to resolve the agriculture problem using biological technologies and tools， modern molecular biology technologies such as genome sequencing， transgenic technology and gene editing could serve agricultural genetics and breeding， to realize the close intergration of traditional breeding and molecular design breeding， and accelerate the process of precision breeding of crops， which has attracted academic attention in recent years. In this study， we sorted out some molecular biological terminology concepts， and summarized how to rapidly locate QTL/gene for important agronomic traits using extreme phenotypic materials and BSA-Seq （Bulked segregate analysis-sequencing） method （MutMap， MutMap+， MutMap-Gap and QTL-seq method） based on the whole genome sequencing in forward genetics， providing new ideas for rapid mapping and cloning of candidate genes.

Key words：QTL mapping;BSA-seqmethod;Genetical population;Map-based cloning;Agronomic traits;Molecular breeding

過去人們依靠傳統(tǒng)育種方法獲取農(nóng)作物新品種，根據(jù)所需新品種的特性，輪回選擇并純化其親本，然后通過雜交、回交或直系篩選程序來完成。傳統(tǒng)育種在整個(gè)農(nóng)業(yè)發(fā)展中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，但同時(shí)也存在著育種上的盲目性、經(jīng)驗(yàn)性、長(zhǎng)周期和不確定因素等諸多問題。目前，遺傳育種已經(jīng)歷了從原始馴化選育階段由耕作者選育具有廣泛表型變異的地方農(nóng)家品種（育種1.0版）;常規(guī)育種階段由職業(yè)育種家通過預(yù)先設(shè)計(jì)雜交育種試驗(yàn)選育現(xiàn)代栽培品種（育種2.0版）;進(jìn)入依靠生物技術(shù)的分子育種階段，采用分子標(biāo)記輔助選擇及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的手段實(shí)現(xiàn)對(duì)品種單一目標(biāo)性狀的導(dǎo)入與修飾（育種3.0版）。隨著基因工程和現(xiàn)代信息技術(shù)的迅速崛起，育種也逐漸步入互聯(lián)網(wǎng)+大數(shù)據(jù)+人工智能“三位一體”的設(shè)計(jì)育種時(shí)代，利用分子生物學(xué)技術(shù)和遺傳學(xué)方法控制動(dòng)植物群體數(shù)量和質(zhì)量均得以實(shí)現(xiàn)，從而將全面改寫生物育種的策略和方法，推動(dòng)育種技術(shù)向智能化階段（育種4.0版）發(fā)展[1 - 2 ]。生物技術(shù)向人類展示了巨大發(fā)展?jié)摿?，?chuàng)造著農(nóng)業(yè)革命的未來。利用分子設(shè)計(jì)育種彰顯出比傳統(tǒng)育種更為突出的優(yōu)越性，結(jié)合基因組學(xué)、表型組學(xué)、蛋白組學(xué)及代謝組學(xué)等多組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)的整合和分析、優(yōu)化和篩選，獲取最佳育種目標(biāo)基因型，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)或基因編輯手段，可高效精準(zhǔn)地培育出目標(biāo)新品種，縮短育種周期2～5 a，提高育種效率，因此智能化育種是未來作物育種的必然選擇，其精準(zhǔn)性、科學(xué)性和高效性都將帶領(lǐng)作物育種進(jìn)入一個(gè)新的時(shí)代[2 - 3 ]。智能化育種或分子設(shè)計(jì)育種4.0版的關(guān)鍵方案就是如何合理設(shè)計(jì)具有理想株型（玉米、小麥和水稻等有各自不同的理想株型，如玉米合理株高、穗上葉夾角減小、增強(qiáng)耐密性、株型性狀之間的協(xié)同調(diào)控機(jī)制等）、高產(chǎn)、高抗、綠色、優(yōu)質(zhì)等綜合農(nóng)藝性狀的優(yōu)良品種。為了實(shí)現(xiàn)設(shè)計(jì)目標(biāo)，定位和克隆控制農(nóng)藝性狀的關(guān)鍵基因，及解析其遺傳調(diào)控機(jī)理至關(guān)重要[4 - 7 ]。通過正向遺傳方法的圖位克隆技術(shù)是傳統(tǒng)經(jīng)典的基因克隆方法，但需要構(gòu)建永久遺傳群體或F2 ∶ 3分離群體，周期很長(zhǎng)，存在高密度分子標(biāo)記篩選工作量大、標(biāo)記難以獲得等缺點(diǎn)。我們通過介紹如何利用作物極端表型材料基于混合分組測(cè)序（Bulked segregate analysis-sequencing BSA-Seq）的MutMap方法快速獲得重要農(nóng)藝性狀的QTL/基因，旨在為定位和克隆候選基因提供思路和方法。

1 ? 分子生物學(xué)一些專用名詞介紹

1.1 ? 基因測(cè)序及克隆相關(guān)概念

1.1.1 ? 表型與基因型（Phenotype andgenotype） ? 又稱性狀，是基因型（Genetype）和環(huán)境（Environment）共同作用的結(jié)果，即P=G+E;基因型是指某一生物個(gè)體全部基因組合的總稱[8 ]。

1.1.2 ? 質(zhì)量性狀（Qualitativecharacter） ? 指屬性性狀，是指同一種性狀的不同表現(xiàn)型之間不存在連續(xù)性的數(shù)量變化，而呈現(xiàn)質(zhì)的中斷性變化的那些性狀，組間差異顯著。質(zhì)量性狀通常受一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)主效基因調(diào)控，不易受環(huán)境因素影響。比如花色、抗病性、抗蟲性、育性等表現(xiàn)為質(zhì)量性狀遺傳的特點(diǎn)[8 ]。

1.1.3 ? 數(shù)量性狀（Quantitative character） ? 指某一性狀在群體中變異呈連續(xù)性正態(tài)分布，無法明確分組，如動(dòng)植物的高度、長(zhǎng)度、成熟期、產(chǎn)量等經(jīng)濟(jì)特性，這類性狀無法通過表型來推斷其基因型，易受環(huán)境影響和遺傳背景影響[8 ]。

1.1.4 ? ?數(shù)量性狀基因座（Quantitative trait locus，QTL） ? 指控制數(shù)量性狀的基因在基因組中的位置。把能控制數(shù)量性狀的位點(diǎn)就叫做QTL[8 ]。

1.1.5 ? 遺傳標(biāo)記（Genetic marker） ? ?指可追蹤染色體、染色體某一片段或某個(gè)基因座在家系中傳遞的任何一種遺傳特性。具有兩個(gè)基本特征，即可遺傳性和可識(shí)別性。某種生物的任何有差異表型的基因突變型均可作為遺傳標(biāo)記[8 ]。

1.1.6 ? 遺傳連鎖圖譜（Genetic linkage map） ? 指基因或DNA標(biāo)記在染色體上的相對(duì)位置與遺傳距離。單位由基因或DNA片段在染色體交換過程中分離的頻率厘摩（cM）來表示。1 cM表示每次減數(shù)分裂的重組頻率為1%[8 ]。

1.1.7 ? ?圖位克隆（Map-based cloning） ? ?又稱定位克隆，1986年首先由劍橋大學(xué)的Alan coulson提出[9 ]，可用于分離大部分性狀的相關(guān)基因，它是通過分析突變位點(diǎn)與已知分子標(biāo)記的連鎖關(guān)系來確定候選基因，根據(jù)目的基因在染色體上的位置進(jìn)行定位[8 ]。群體中的個(gè)體在某一表型性狀上有遺傳差異，導(dǎo)致這些差異的基因可以被已知的分子標(biāo)記定位在特定染色體位置。隨著各種分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展和高密度連鎖圖譜構(gòu)建完成，圖位克隆技術(shù)已經(jīng)成為分離生物基因最常規(guī)的手段之一。

1.1.8 ? 全基因組重測(cè)序（Genome-wide resequencing）

全基因組重測(cè)序是對(duì)基因組序列已知的個(gè)體進(jìn)行基因組水平測(cè)序，并在個(gè)體或群體水平上進(jìn)行差異性分析的方法。如擬南芥兩個(gè)已測(cè)序亞種Columbia和Landsberg、水稻粳稻和秈稻兩個(gè)亞種代表日本晴和9311、玉米R(shí)eid 和Lancaster類群代表自交系B73和Mo17等，均已經(jīng)有參考的基因組序列。對(duì)有優(yōu)異農(nóng)藝性狀的個(gè)體或者群體進(jìn)行基因組重測(cè)序，將結(jié)果與已有的基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，找出控制重要農(nóng)業(yè)性狀的QTLs或目標(biāo)基因，為育種精準(zhǔn)控制表型所用[8 ]。

1.1.9 ? 簡(jiǎn)化基因組測(cè)序（Reduced-representation genome sequencing，RRGS） ? 指利用限制性內(nèi)切酶分割基因組DNA，選擇性地回收一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的酶切片段進(jìn)行高通量測(cè)序，獲得海量遺傳多態(tài)性標(biāo)簽序列來充分代表目標(biāo)物種全基因組信息的測(cè)序策略[8 ]。

1.1.10 ? 混合分組測(cè)序分析法（Bulked segregate analysis-sequencing，BSA-Seq） ? 又稱分離體分組混合分析法或集團(tuán)分離分析法[10 ]，常用于單個(gè)QTL、突變位點(diǎn)定位等。將目標(biāo)性狀在F2后代或RILs群體中的極端表型，如株高或株矮、葉寬或葉窄、抗逆性狀表現(xiàn)高抗或敏感等中2組個(gè)體的DNA分別混合成2個(gè)DNA池，測(cè)序比較兩組群體在多態(tài)位點(diǎn)（SNPs）的等位基因頻率（AF）是否具有顯著差異，然后利用高密度分子標(biāo)記在兩池中進(jìn)行標(biāo)記與性狀間的共分離分析，通過SNP值計(jì)算，篩選與性狀相關(guān)聯(lián)的QTL/基因[8 ]。

1.1.11 ? RNA的混合分組測(cè)序法（Bulked segregant RNA-sequencing，BSR-Seq） ? 指將轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與集群分離分析相結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)開發(fā)SNPs，篩選與性狀緊密連鎖的SNPs，進(jìn)行功能基因的定位，同時(shí)進(jìn)行基因差異表達(dá)分析等轉(zhuǎn)錄組常規(guī)分析的技術(shù)。基于RNA表達(dá)水平的BSR，更多的是轉(zhuǎn)錄本的比對(duì)[8 ]。

1.1.12 ? 全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-wide association study，GWAS） ? 是一種對(duì)全基因組范圍內(nèi)的常見遺傳變異（單核苷酸多態(tài)性和拷貝數(shù)）多態(tài)性總體關(guān)聯(lián)分析的方法[11 ]，在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行整體研究，能夠一次性對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行輪廓性概覽，適用于復(fù)雜性狀的研究[8 ]。

1.2 ? 遺傳群體定義及構(gòu)建方法

1.2.1 ? 作圖群體（Mapping population） ? 指雙親通過自交和雜交產(chǎn)生后代，后代中性狀和標(biāo)記位點(diǎn)基因型均是分離的群體，也叫分離群體，常被用于遺傳圖譜構(gòu)建，因此也叫作圖群體[8 ]。作圖群體被分為初級(jí)作圖群體和次級(jí)作圖群體2種。初級(jí)作圖群體根據(jù)遺傳穩(wěn)定性又可分為臨時(shí)性分離群體（F2、F3、BC1）和永久性分離群體（單倍體群體、重組自交系群體、永久性F2分離群體IF2等），個(gè)體間遺傳背景差異較大。次級(jí)作圖群體的群體基因組背景高度一致且與輪回親本相同，個(gè)體僅含少量供體親本片段，主要包括近等基因系類群體（NILs）、單片段代換系（SSSL）群體和染色體片段置換系（CSSL）群體。

1.2.2 ? 重組自交系（Recombinant inbred line，RIL）

群體是雜種后代經(jīng)過多代自交而產(chǎn)生的一種作圖群體，即重組近交系群體，是由重組近交系組成的分離群體[8 ]，通常從F2代開始采用單粒傳的方法來建立。由于自交的作用是使基因型純合化，RIL群體中每個(gè)株系都是純合的，因而RIL群體是一種可以長(zhǎng)期使用的永久性分離群體。目前RIL群體被廣泛應(yīng)用，能保持單個(gè)純合基因型個(gè)體。

1.2.3 ? ?近等基因系（Near isogenic line，NIL） ? ?群體將多個(gè)QTL位點(diǎn)分解成單個(gè)孟德爾遺傳因子，將數(shù)量性狀轉(zhuǎn)化為質(zhì)量形狀，從而可以對(duì)主效QTL進(jìn)行精細(xì)定位和圖位克隆[8 ]。

1.2.4 ? ?深度雜交系（Advanced intercross lines，AIL）

群體AIL開始于F2群體，F(xiàn)1雜交后裔繼續(xù)雜交一定數(shù)目的世代，F(xiàn)2 ∶ 3繼續(xù)雜交后代（與RIL近似，但是遠(yuǎn)交，而不是近交）[8 ]。

1.2.5 ? 雙單倍體（Doubled haploid，DH） ? ?群體指高等植物的單倍體經(jīng)過染色體加倍形成的二倍體。DH群體產(chǎn)生的途徑很多，亦因物種不同而異，最常見的方法是通過花藥培養(yǎng)，即取F1 植株的花藥進(jìn)行離體培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體植株，然后對(duì)染色體進(jìn)行加倍產(chǎn)生DH植株。也可通過單倍體誘導(dǎo)系誘導(dǎo)，通過自然加倍或化學(xué)藥劑處理加倍產(chǎn)生DH群體[8 ]。

1.2.6 ? ?回交（Back Cross，BC）群體 ? 也是常用的作圖群體，如BC1為A與B的雜交F1代與A或者B回交產(chǎn)生的子代，直接反映了F1代配子的分離比例[8 ]。

1.2.7 ? ?F2群體 ? ?為A與B的雜交F1代經(jīng)自交產(chǎn)生的子代，是一種暫時(shí)性分離群體。特點(diǎn)是群體內(nèi)個(gè)體間基因型不同，各個(gè)體的基因型雜合。這類群體的優(yōu)點(diǎn)是不但可提供豐富的遺傳信息，而且可以用來估算加性效應(yīng)及顯性效應(yīng)。F2群體或衍生的F2 ：3群體是最常用的作圖群體[8 ]。

1.2.8 ? ?連鎖群體（Linkage group） ? 標(biāo)記組成的序列，染色體是堿基組成的序列，連鎖群上的標(biāo)記只是存在多態(tài)性的堿基位點(diǎn)，即SNP，所以來自于同一條染色體的標(biāo)記一定構(gòu)建到同一連鎖群上[8 ]。

2 ? 基于遺傳群體進(jìn)行基因定位方法

目前，定位質(zhì)量性狀控制基因主要利用近等基因系分析法、連鎖分析法和混合分組分析法等途徑，在不同作物基因定位及遺傳改良中均有成功案例。

2.1 ? 近等基因系分析法（Near isogenic line analysis）

將遺傳背景相近或相同、多個(gè)農(nóng)藝性狀相似、個(gè)別染色體位置存在差異的材料稱之為近等基因系。其主要獲得手段是將兩個(gè)具有不同目標(biāo)表型的親本P1和P2雜交，再與P1或P2多代回交后篩選得到在目標(biāo)表型上有差異的品系，這樣，品系以及品系間與輪回親本間就構(gòu)成了近等基因系。在育種中，親本輪回改良或品種特性改良應(yīng)用最多的就是近等基因系分析法[12 - 13 ]，當(dāng)市場(chǎng)推廣品種缺少某個(gè)優(yōu)良性狀時(shí)（如不抗蟲、易感?。?，常采用輪回轉(zhuǎn)育方法將外源品種中含有目標(biāo)性狀的抗性基因?qū)氲浆F(xiàn)有品種中，提高該品種的綜合抗性;若是雜交種，只改變存在缺陷性狀的父本或母本之一，以保證雜交種其他農(nóng)藝性狀的穩(wěn)定性。因此將用于多次回交的親本稱為受體親本或輪回親本，是目標(biāo)表型的接受者，僅用于首次雜交時(shí)的親本稱為供體親本或非輪回親本，是目標(biāo)表型的提供者。如此，多代回交的結(jié)果就是不斷提高后代中輪回親本的遺傳基因，減少供體材料的遺傳成分，逐漸向輪回親本遺傳背景純合，7～8代后理論上除了含有需改良的目標(biāo)性狀基因片段外，其他染色體遺傳信息與輪回親本幾乎相同（育種上講就是擁有了99%以上的輪回親本血緣）。為了加快回交后代基因組恢復(fù)成輪回親本的速度，在每代選擇繼續(xù)回交的植株時(shí)，除了要保證含有供體目標(biāo)基因外，應(yīng)盡量選擇形態(tài)上與輪回親本接近的植株。因此，改良的品系與輪回親本間實(shí)際上構(gòu)成了一對(duì)近等基因系，通過持續(xù)的自交保持目標(biāo)性狀位點(diǎn)的雜合可以建立成對(duì)的近等基因系，利用近等基因系分析法可以克隆控制重要農(nóng)藝性狀的候選基因。

2.2 ? 連鎖分析法（Linkage analysis）

用連鎖分析法定位QTL的基本原理是經(jīng)典遺傳學(xué)中的連鎖分析（兩點(diǎn)測(cè)交、三點(diǎn)測(cè)交），利用與QTL連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行推斷[14 - 15 ]。因?yàn)楫?dāng)一個(gè)分子標(biāo)記與QTL連鎖時(shí)，傾向于一起遺傳，這樣就可以借助分子標(biāo)記信息近似估計(jì)QTL在群體中的傳遞情況。還可利用區(qū)間定位方法。與單標(biāo)記分析法比較，區(qū)間定位法能大大提高QTL的檢測(cè)效率，并能較準(zhǔn)確的估計(jì)出QTL的位置和效應(yīng)值。區(qū)間定位已成為目前QTL檢測(cè)中的標(biāo)準(zhǔn)方法。QTL連鎖分析常用的統(tǒng)計(jì)分析方法有區(qū)間作圖法（IM）、復(fù)合區(qū)間作圖法（CIM）、混合線性模型（MLM）、完備區(qū)間作圖法（ICIM）等。關(guān)聯(lián)分析需要依賴作圖群體，構(gòu)建遺傳圖譜周期長(zhǎng)，成本較高。

2.3 ? 關(guān)聯(lián)分析法（Correlation analysis）

關(guān)聯(lián)分析可以解決連鎖分析在挖掘種質(zhì)資源等位變異時(shí)效率低、成本高、在群體數(shù)量和研究目標(biāo)性狀方面依賴作圖群體等缺陷。GWAS分析是對(duì)多個(gè)個(gè)體全基因組范圍的遺傳變異（標(biāo)記）進(jìn)行檢測(cè)，獲得基因型，進(jìn)而將基因型與可觀測(cè)的性狀即表型進(jìn)行群體水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，根據(jù)統(tǒng)計(jì)量或顯著性P值篩選出最有可能影響該性狀的遺傳標(biāo)記，定位與性狀相關(guān)的遺傳位點(diǎn)或挖掘與性狀變異相關(guān)的候選基因，在群體水平上解析性狀遺傳基礎(chǔ)[10， 16 ]。關(guān)聯(lián)分析具有許多優(yōu)點(diǎn)，如可以直接使用自然群體或種質(zhì)資源，不需要專門構(gòu)建作圖群體;檢測(cè)效率高，可同時(shí)檢測(cè)同一座位的多個(gè)等位基因;節(jié)省研究時(shí)間且分辨率高。但相應(yīng)地，GWAS 也存在一定的缺點(diǎn)，如當(dāng)群體結(jié)構(gòu)分化明顯時(shí)容易造成假陽(yáng)性，需要足夠多的樣本才能保證P值足夠低，來避免假陰性和假陽(yáng)性。同時(shí)，精確的表型鑒定是GWAS成功定位的重要保障。

2.4 ? 離體分組混合分析法（Bulked segregate analysis， BSA）

離體分組混合分析法是1991年由R. W. MICHELMORE[10 ]在萵苣上首次應(yīng)用的一種快速定位控制目標(biāo)性狀基因的方法。取F2群體中具有極端表型的15～100個(gè)單株等量混合其DNA形成2個(gè)DNA池，然后在親本和兩個(gè)池之間進(jìn)行標(biāo)記多態(tài)篩選。如果某個(gè)標(biāo)記在親本和混池之間具有一致的多態(tài)，則該標(biāo)記很可能和性狀連鎖，通過F2群體對(duì)這些篩選到的多態(tài)標(biāo)記進(jìn)行基因型分析即可完成對(duì)目標(biāo)基因的定位，而不需要對(duì)每個(gè)標(biāo)記在群體里進(jìn)行基因型分析。BSA的方法常用于單個(gè)QTL、突變位點(diǎn)定位等，BSA建立的混池因?yàn)榻?jīng)過了目標(biāo)性狀篩選，所以保證了2個(gè)混池之間除了目標(biāo)性狀外其他遺傳背景基本相同，僅目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)的DNA區(qū)段存在差異，所以兩個(gè)混池又被稱為近等基因池。該方法主要用于植物性狀的初定位，適用于單基因的質(zhì)量性狀和主效基因的數(shù)量性狀上，常用分離群體為F2、BC、RIL、DH群體等，常用的分子標(biāo)記有RAPD、RFLP、AFLP、SSR、SNP、InDel等。

BSA技術(shù)應(yīng)用廣泛的主要有以下4種方法，分別是MutMap[17 - 18 ]、MutMap+[19 ]、MutMap-Gap[20 ]、QTL-seq[21 - 22 ]，他們的基本原理相同，即針對(duì)研究的目標(biāo)性狀，選擇表型差異顯著的親本構(gòu)建出分離群體（或家系群體），再?gòu)姆蛛x群體中選取目標(biāo)性狀表型極端的一定數(shù)量的單體，混合構(gòu)建2個(gè)DNA池（DNA pools）。通常以雙親的DNA作為對(duì)照（參考基因組以利于對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行正確的分析和判斷），比較2個(gè)DNA池之間的差異，2個(gè)DNA池之間的差異片段即為候選區(qū)域，所關(guān)注的基因或者QTL可能存在于該候選區(qū)域中[23 ]。

3 ? 不同MutMap方法及應(yīng)用

3.1 ? MutMap方法

3.1.1 ? ?MutMap定義及適宜條件 ? ?MutMap是基于高通量第二代測(cè)序技術(shù)的全基因組測(cè)序（Whole genome sequencing，WGS）發(fā)展起來的新的正向遺傳學(xué)基因定位和遺傳分析方法[17 ]。2012年Abe ? 等[17 ]開發(fā)的MutMap方法應(yīng)用于水稻性狀篩選改良，利用甲基磺酸乙酯（ethylmethanesulfonate，EMS）誘變處理野生稻后獲得穩(wěn)定遺傳突變體，且目標(biāo)性狀由隱性單基因控制。取突變表型個(gè)體DNA等量混合獲得突變體DNA池（選擇30～200株不等）進(jìn)行全基因組重測(cè)序，混池測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)誘變親本基因組獲取SNP位點(diǎn)，計(jì)算SNP指數(shù)，指數(shù)峰作為目的性狀關(guān)聯(lián)的目的基因所在的候選位置。利用該技術(shù)成功定位到4個(gè)水稻半矮稈、1個(gè)雄性不育、2個(gè)葉色淡綠性狀關(guān)聯(lián)基因在染色體上的遺傳位置[17 ]。

3.1.2 ? MutMap原理及分析 ? 利用二代測(cè)序技術(shù)，根據(jù)BSA極端性狀混池測(cè)序原理[17，23 ]，分別抽提具有極端表型性狀植株的親本及子代植株DNA或RNA建庫(kù)測(cè)序。在分離群體搭建過程中，子代會(huì)根據(jù)表型進(jìn)行選擇，篩選出突變型子代池和野生型子代池。根據(jù)遺傳連鎖交換定律，子代池的基因型會(huì)和表型產(chǎn)生共分離，反應(yīng)在物理圖譜層面，與表型連鎖的染色體區(qū)段會(huì)和不連鎖的染色體區(qū)間產(chǎn)生穩(wěn)定的SNP-指數(shù)差異（SNP-index）。SNP指數(shù)的概念：SNP-index =突變SNP的reads數(shù)/對(duì)應(yīng)SNP位點(diǎn)的總reads數(shù)。差異大小范圍為0～1。如果SNP-index=0，說明該池中僅包含來自參考基因序列的親本基因組片段;如果SNP-index=1，說明該池中僅僅包含來自于另一個(gè)親本（突變體）的基因組片段;如果SNP-index=0.5，說明該池中存在2個(gè)親本的基因組片段，此子代混池中SNP來自2個(gè)親本的基因組的頻率一致（圖1）。操作及分析步驟：①篩選親本間純合差異的SNP位點(diǎn);②子代SNP根據(jù)親本的基因型，確定突變親本來源的Reads，計(jì)算SNP-index;③只有突變子代池（Highbulk）的群體采用SNP-index定位，同時(shí)存在突變子代池和野生子代池（Lowbulk）的群體，采用ΔSNP-index定位，即將突變池的SNP指數(shù)減去野生池的SNP指數(shù)以獲得每個(gè)位點(diǎn)的SNP指數(shù)差值，即Δ（SNP-index）;④定位時(shí)以每15個(gè)點(diǎn)為窗口，5個(gè)點(diǎn)步移統(tǒng)計(jì)該窗口內(nèi)所有SNP-index平均值，做出紅色擬合線，排除部分噪音影響，使連鎖區(qū)域峰值更加明顯;⑤ΔSNP-index的群體可以利用二項(xiàng)分布檢驗(yàn)Highbulk和Lowbulk的覆蓋深度，考慮其混池?cái)?shù)量以及群體類型，算出其統(tǒng)計(jì)學(xué)上95%的和99%的置信線;⑥ΔSNP-index定位時(shí)，擬合線超出置信線的染色體區(qū)域?yàn)榭赡艿谋硇瓦B鎖區(qū)域。根據(jù)擬合線超出染色體置信區(qū)間，判斷候選基因位置[17 ]。測(cè)序完成后，要對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)分析，常用的且最重要的分析參數(shù)有以下6種：一是SNP，單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism），主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性;二是InDel，插入/缺失（Insertion/Deletion）基因組中小片段的插入和缺失序列;三是SV，基因組結(jié)構(gòu)變異（Structure variation），染色體結(jié)構(gòu)變異是指在染色體上發(fā)生了大片段的插入和缺失、重復(fù)復(fù)制、翻轉(zhuǎn)顛換、易位等;四是CNV，基因組拷貝數(shù)變異（Copy number variation），是基因組變異的一種形式，通常使基因組中大片段的DNA形成非正常的拷貝數(shù)量;五是基因組測(cè)序深度，測(cè)序得到的總堿基數(shù)與待測(cè)基因組大小的比值;六是基因組覆蓋率，由于大片段拼接的gap、測(cè)序讀長(zhǎng)有限、重復(fù)序列等問題的存在，測(cè)序分析后組裝得到的基因組序列通常無法完全覆蓋所有區(qū)域，覆蓋度就是最終得到的結(jié)果占整個(gè)基因組的比例。

3.1.3 ? MutMap應(yīng)用實(shí)例 ? 2011年日本地震導(dǎo)致海嘯爆發(fā)、海水倒灌農(nóng)田，使當(dāng)?shù)卦痉饰值耐恋刈兂闪他}堿地，水稻產(chǎn)量大幅下降。科學(xué)家采用EMS誘變的方法對(duì)當(dāng)?shù)厮酒贩N“Hitomebore” 進(jìn)行了處理，F(xiàn)1代自交得到的 F2群體，獲得了耐鹽型單基因控制耐鹽突變株，野生型和突變型表型個(gè)體數(shù)的比值約為 3∶1，符合孟德爾隱性單基因控制遺傳定律。選取帶有目標(biāo)性狀的子代個(gè)體構(gòu)建混合池并測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與野生親本基因組比對(duì)，得到SNP位點(diǎn)，通過Δ（SNP_index）的方法將目標(biāo)性狀定位在6號(hào)染色體2.76～8.57 Mb之間。該候選區(qū)域其中1個(gè)SNP的突變使一個(gè)無義色氨酸密碼子突變?yōu)榻K止子，在篩選到與耐鹽性狀相關(guān)的基因OsRR22，導(dǎo)致突變體hst1產(chǎn)生耐鹽表型。該研究縮短了耐鹽品種水稻的育種進(jìn)程，將對(duì)當(dāng)?shù)厮井a(chǎn)量恢復(fù)做出巨大貢獻(xiàn)[18 ]。

3.2 ? MutMap+方法

3.2.1 ? MutMap+適宜條件及原理 ? 常規(guī)的MutMap方法是將 M3～M5世代的突變體與野生型親本株系進(jìn)行雜交構(gòu)建后代群體，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行BSA分析。對(duì)于人工雜交困難的突變體，以及發(fā)育早期死亡或不育的突變體，因?yàn)闊o法直接構(gòu)建子代群體，MutMap方法就不適用了。為了解決這個(gè)問題，F(xiàn)ekih等[19 ]開發(fā)了MutMap+方法：隱性純合M1代株系不育或死亡，因此利用雜合的M1代自交產(chǎn)生的雜合后代來保存變異基因，并在構(gòu)建群體時(shí)重點(diǎn)關(guān)注那些自交后代表型發(fā)生分離的株系。在導(dǎo)致表型的突變位點(diǎn)上野生型株系理論上有2/3是雜合的。以水稻為例，簡(jiǎn)單闡述MutMap+方法的原理（圖2）。

3.2.2 ? MutMap+應(yīng)用實(shí)例 ? ?應(yīng)用該方法不雜交只自交，在雜合的株系自交獲得的后代群體中，野生型表型和隱性純合突變表型分離比例約為3∶1。將野生型 M1后代個(gè)體自交，收集雜合的M1株系自交獲得的M2代群體。同樣收集雜合的M2代自交獲得的M3群體。根據(jù)表型將M3株系分為兩組，構(gòu)建2組混合DNA池，并進(jìn)行全基因組重測(cè)序?；斐販y(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)野生型親本基因組獲取SNP位點(diǎn)，2個(gè)混池分別計(jì)算SNP-index，Δ（SNP-index）峰作為目的性狀關(guān)聯(lián)的目的基因所在的候選位置。該方法主要用來定位早衰、致死、不育、白化等性狀的定位分析，也用來分析花蕊太小或去雄難度大而尚未建立有效的人工雜交物種。例如谷子：利用MutMap+方法，F(xiàn)ekin等找到了表型為早衰和過早死亡的突變體Hit9188的候選基因OsNAP6，并且找到了表型為苗白化和過早死亡的突變體Hit11440 的候選基因Os08g0139100[19 ]。

3.3 ? Mutmap-Gap方法

3.3.1 ? Mutmap-Gap適宜條件 ? Mutmap或Mutmap+都需要根據(jù)參考基因組序列先構(gòu)建一個(gè)誘變親本的Pseudo-genome。如果野生型親本的基因組和參考基因組的序列有結(jié)構(gòu)性差異，而導(dǎo)致性狀改變的區(qū)域位點(diǎn)恰巧不在參考基因組序列上，相對(duì)參考基因組是一個(gè)大的插入片段，是參考基因組上的缺乏的區(qū)域（Gap），直接做Mutmap分析將得不到關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的全部信息。為了鑒別在參考基因組序列Gap內(nèi)的變異，Takagi等[20 ]開發(fā)了Map-Gap方法。該方法將MutMap方法與對(duì)基因組gap區(qū)域的從頭（de novo）組裝相結(jié)合，對(duì)這類特異的突變基因進(jìn)行定位和分離。MutMap-Gap將MutMap方法得出的靶基因組區(qū)域的gap通過de novo組裝補(bǔ)齊，以判斷不在參考基因組上變異候選區(qū)段位置（圖3）。

3.3.2 ? Mutmap-Gap原理及應(yīng)用 ? 首先將比對(duì)到候選區(qū)域的臨近區(qū)域和未對(duì)應(yīng)參考序列的reads序列合并起來做de novo組裝，將組裝得到scaffold序列和pseudo-genome序列一起當(dāng)作參考序列（圖3），重新比對(duì)計(jì)算SNP指數(shù)，關(guān)聯(lián)定位區(qū)域。如突變位于P特異性基因組區(qū)域內(nèi)，僅通過MutMap分析無法識(shí)別。因?yàn)槎ㄎ粎^(qū)域相對(duì)參考基因組是一個(gè)新的發(fā)現(xiàn)，參考序列里面沒有基因相關(guān)的信息，通過對(duì)P的全基因組測(cè)序及與參考基因組的重新組裝pseudo-genome序列，需要對(duì)該區(qū)域進(jìn)行基因預(yù)測(cè)和注釋，以得到目的基因。一般情況下Mutmap或Mutmap+沒定位到結(jié)果，可以嘗試用Mutmap-Gap。

3.4 ? QTL-Seq方法

3.4.1 ? QTL-Seq方法原理及操作 ? MutMap系列僅適用于質(zhì)量性狀，對(duì)于數(shù)量性狀，產(chǎn)生了QTL-seq法。QTL-seq是一種在極端表型混池高通量測(cè)序的基礎(chǔ)上，根據(jù)極端表型池間SNP頻率的差異進(jìn)行QTL/基因定位的方法，是一種結(jié)合BSA與NGS 來快速定位單個(gè)數(shù)量性狀的方法[21 - 22 ]。具體操作：選取目標(biāo)性狀差異大的兩個(gè)親本雜交，產(chǎn)生分離群體如F2、RILs、DH 等，目標(biāo)性狀理論上將會(huì)呈現(xiàn)正態(tài)分布選取目標(biāo)性狀表型極端的20%的比例的個(gè)體分別混合成2個(gè)表型極端池，進(jìn)行重測(cè)序。以對(duì)照親本的基因型為參照，計(jì)算子代極端池中的SNP-index[17 ]。若該參數(shù)為0，代表子代所有測(cè)到的Reads都來自野生親本;若該參數(shù)為1，代表子代所有Reads都來自突變親本;該參數(shù)為0.5，說明該池中存在2個(gè)親本的基因組片段。一般而言，大部分位點(diǎn)的SNP index值在0.5左右的區(qū)域，但如果某SNP與目標(biāo)QTL連鎖，導(dǎo)致SNP-index的值偏離0.5。比較ΔSNP-index，候選區(qū)間內(nèi)的ΔSNP-index應(yīng)該接近于1，從而將QTL定位到了基因組上的某一區(qū)域[18 - 19 ]（圖4）。

3.4.2 ? QTL-Seq方法應(yīng)用實(shí)例 ? QTL-seq定位黃瓜早花農(nóng)藝性狀：采用BSA混樣策略對(duì)10株F2子代群體極端性狀（早花和晚花）的樣品混合的DNA池，及其親本進(jìn)行基因組重測(cè)序。通過全基因組掃描SNP，分析頻率差異，檢測(cè)F2群體早花性狀的QTL，找到了一個(gè)位于早花QTL Ef1.1中的候選基因。利用F2群體，SSR標(biāo)記構(gòu)建的遺傳圖譜進(jìn)行QTL定位，兩種策略結(jié)合，將Ef1.1縮小到980 Kb，其中包含基因Csa1G651710，與FT基因同源[22 ]。

3.5 ? 4種不同MutMap方法的比較

從表1可以看出，MutMap、MutMap+、Mut Map-Gap、QTL-seq這4種方法在樣本材料、親本類型、雜交方式、所需測(cè)序樣本、適用范圍等不盡相同，但均可快速獲得與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記，且遺傳定位的周期短、效率高?；谡T變突變體的MutMap方法、自交的MutMap+方法、用于識(shí)別基因組缺失區(qū)間變異的MutMap-Gap方法以及用于定位數(shù)量性狀基因座的QTL-seq方法等均不需要建立繁瑣的后代定位群體，加快了對(duì)重要表型變異位點(diǎn)的識(shí)別過程，縮短了育種時(shí)間，大大加快了新品種的開發(fā)速度。

4 ? 小結(jié)與展望

由于MutMap方法的應(yīng)用使得基因得以快速定位，這些基因資源將有可能促進(jìn)玉米、水稻等作物的遺傳改良[1 - 2 ]?；赪GS的MutMap方法的正向遺傳學(xué)研究，不僅有利于QTL/基因的定位，也利于新的基因資源在作物育種中的應(yīng)用。早在1991年，Michelmore等[10 ]就建立了BSA法，克服了許多作物沒有或難以創(chuàng)建相應(yīng)的NIL群體的限制，在自交和異交作物中均有廣泛的應(yīng)用前景。對(duì)于尚無連鎖圖或連鎖圖飽和程度較低的植物，BSA法也是快速獲得與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記的有效方法，該方法的優(yōu)點(diǎn)是遺傳定位的周期短且效率高。在此基礎(chǔ)上擴(kuò)展的新方法也不斷出現(xiàn)，如基于自交的MutMap+、用于識(shí)別基因組缺失區(qū)間變異的MutMap-Gap，以及用于定位數(shù)量性狀基因座的QTL-seq方法等。這些方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要建立繁瑣的后代定位群體，甚至不依賴于遺傳雜交和任何連鎖信息，加快了對(duì)重要表型變異位點(diǎn)的識(shí)別過程。Mutmap采用EMS誘變技術(shù)將育種時(shí)間縮短至傳統(tǒng)育種的1/5左右，大大加快了新品種的開發(fā)，通過利用MutMap對(duì)突變體進(jìn)行遺傳定位研究，可以快速鑒別出靶基因[23 - 24 ]。

過去，人們依靠傳統(tǒng)育種方法獲取作物新品種，根據(jù)選擇的特性確定植物親本，然后通過雜交、回交或者直系篩選程序來完成。傳統(tǒng)育種方法存在著極大的盲目性、經(jīng)驗(yàn)性、不確定因素和長(zhǎng)周期等問題。為了實(shí)現(xiàn)育種4.0的目標(biāo)，需要為分子育種制定一個(gè)育種路線圖。應(yīng)用新的生物技術(shù)，依托人工智能、基因組測(cè)序、基因編輯等相關(guān)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)玉米組學(xué)基因型與表型大數(shù)據(jù)的快速積累。通過遺傳變異等數(shù)據(jù)的整合，實(shí)現(xiàn)作物性狀調(diào)控基因的快速挖掘與表型的精準(zhǔn)預(yù)測(cè)。通過人工改造基因元器件與人工合成基因回路，使作物具備新的抗逆、高效等生物學(xué)性狀，創(chuàng)建智能組合優(yōu)良等位基因的自然變異、人工變異、數(shù)量性狀位點(diǎn)的育種設(shè)計(jì)方案，最終實(shí)現(xiàn)智能、高效、定向培育新品種[25 ]。分子育種的精準(zhǔn)實(shí)施可幫助育種家在最短的時(shí)間里實(shí)現(xiàn)以下目標(biāo)。①大大縮短育種時(shí)間，加速育種進(jìn)程。比如玉米自交系選育中，通過常規(guī)育種回交6代及以上才能達(dá)到99%純合的后代，而分子標(biāo)記選育只需要3代就可以達(dá)到，利用單倍體誘導(dǎo)技術(shù)只需要2代就能達(dá)到100%純合。②最大限度地繞過物種生殖隔離的障礙，實(shí)現(xiàn)生物界遺傳物質(zhì)的自由交流。利用基因重組操作技術(shù)，將不同物種中特定的基因與載體結(jié)合，可以導(dǎo)入到其他物種中表達(dá)，發(fā)揮其基因功能，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)讓現(xiàn)存的作物品種快速適應(yīng)新環(huán)境[26 ]。如抗棉鈴蟲轉(zhuǎn)基因棉花的普及和大面積種植推廣，以及抗旱耐鹽堿、抗除草劑等玉米品種的獲得，都大大降低了人工打藥、鋤草、灌溉等成本，提高了產(chǎn)量和收入，且轉(zhuǎn)基因觀賞園藝植物在休閑觀光農(nóng)業(yè)中被廣泛應(yīng)用。③可幫助育種從多個(gè)目標(biāo)性狀帶有經(jīng)驗(yàn)性的多代重組選擇，轉(zhuǎn)變成針對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行基因編輯的精準(zhǔn)性狀選擇和改良，可將主效基因及其優(yōu)異等位基因集于一個(gè)骨干自交系或品種中，大大提高了育種效率。如孟山都公司利用分子標(biāo)記將多個(gè)不同的抗旱位點(diǎn)聚合育成高抗旱玉米品種（gene stacking），是復(fù)雜性狀通過分子標(biāo)記獲得育成品種的成功案例[3 ]。劉忠祥[27 ]系統(tǒng)闡述玉米株高主效QTL定位研究進(jìn)展及與株高相關(guān)基因的功能與響應(yīng)途徑， 對(duì)玉米分子育種的選育工作有積極借鑒作用。④隨著人們對(duì)身體健康，美容保健等方面的重視，育種家通過分子育種可選育功能保健型（低脂低糖、高蛋白、高氨基酸等）品種，以滿足人們通過飲食對(duì)特殊營(yíng)養(yǎng)成分需求，如“黃金大米”，其β-胡蘿卜素的含量是普通大米的23倍。⑤基因組編輯技術(shù)作為一項(xiàng)變革性的新興技術(shù)，尤其是CRISPR/Cas 9基因編輯技術(shù)的興起和廣泛應(yīng)用，將推動(dòng)新技術(shù)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展[28 - 29 ]。中國(guó)科學(xué)院高彩霞團(tuán)隊(duì)等聯(lián)合攻關(guān)，闡明了小麥新型mlo突變體既抗白粉病又高產(chǎn)的分子機(jī)制，并通過CRISPR/Cas9多重基因組編輯，使主栽小麥品種快速獲得廣譜抗白粉病的優(yōu)異性狀[30 ]。然而，沒有前期的對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行克隆和功能的深入剖析，根本談不上DNA水平的分子標(biāo)記輔助選擇育種。因此，加強(qiáng)農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)和開發(fā)利用，創(chuàng)新農(nóng)作物分子改良與技術(shù)應(yīng)用體系，加強(qiáng)作物分子育種方面的應(yīng)用基礎(chǔ)性研究是未來提高中國(guó)種業(yè)發(fā)展水平最為重要的步驟和方向[31 - 35 ]。

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收稿日期：2022 - 03 - 09

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（32160490、31860384）;2020年甘肅省科協(xié)青年科技人才托舉工程項(xiàng)目;甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新專項(xiàng)-博士基金（2020GAAS34）。

作者簡(jiǎn)介：周文期（1985 — ），男，甘肅靜寧人，副研究員，博士，主要從事玉米遺傳育種及基因功能研究工作。Email： zhouwenqi850202@163.com。

通信作者：周玉乾（1979 — ），男，甘肅靖遠(yuǎn)人，研究員，主要從事玉米育種工作。Email：yuqianzhou2008@163.com。