趙雨璇　董南　董美玉

摘要：以單羥基七元瓜環(huán)（Q[7]-OH）和端羥基聚二甲基硅氧烷（OH-PDMS）為固定相，利用溶膠-凝膠方法制備了PDMS/Q[7]-OH的固相微萃取攪拌棒（stir-bar sorptive extraction， SBSE），建立了SBSE-高效液相色譜（high performance liquid chromatography， HPLC）-二極管陣列檢測器（diode-array detector， DAD）對環(huán)境水樣中3種硝基苯酚異構(gòu)體同時(shí)檢測的分析方法。方法對萃取時(shí)間、溶液的pH值、鹽離子濃度、解吸溶劑和解吸時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。在優(yōu)化條件下，SBSE-HPLC-DAD測定硝基苯酚異構(gòu)體的線性范圍為0.01～10.00 mg/L，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 7，檢測限在0.002～0.006 mg/L范圍內(nèi)，日內(nèi)及日間精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.9%～7.5%之間（C=0.8 mg/L），3個(gè)加標(biāo)濃度的平均相對回收率在71.5% ～116.8%范圍內(nèi)。 方法靈敏、簡便，可滿足環(huán)境水樣中硝基苯酚異構(gòu)體同時(shí)測定的要求。

關(guān)鍵詞：單羥基取代七元瓜環(huán);固相微萃取小棒;硝基苯酚異構(gòu)體;高效液相色譜;環(huán)境水樣

中圖分類號：O69;O657.72文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

作為重要有機(jī)合成中間體的鄰、間、對硝基苯酚在化工材料、農(nóng)藥和染料等工業(yè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。它們已被證實(shí)為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物之一，被聯(lián)合國環(huán)境署列為環(huán)境必測項(xiàng)目之一[1]。硝基苯酚在生產(chǎn)和使用過程中會隨生活污水及工業(yè)廢水進(jìn)入環(huán)境水體，對動物、微生物、植物和人體健康造成巨大的危害[2]。這幾種異構(gòu)體具有相似的物理化學(xué)性質(zhì)，同時(shí)測定較難，從而一直是人們關(guān)注的課題。目前，環(huán)境水體中硝基苯酚的測定方法有色譜法、電化學(xué)方法[3]和毛細(xì)管電泳法[4]等。其中，色譜法是最常用的分析方法，包括氣相色譜[5]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[6]及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[7]等。色譜法由于檢測靈敏度較低而環(huán)境水樣中硝基苯酚的含量很低，需對樣品進(jìn)行預(yù)處理以滿足儀器的測定要求。液/液萃取[6]、固相萃取[8]是傳統(tǒng)的樣品前處理方法，具有較好的富集、凈化能力，但大量的有毒、有害有機(jī)溶劑的使用，較復(fù)雜的操作以及較多的樣品使用量是其主要的缺陷。

固相微萃?。╯oild phase micro-extraction， SPME）于1989年由加拿大Waterloo大學(xué)Pawliszy教授課題組提出，是一種新型微型化和綠色環(huán)保的樣品前處理技術(shù)。這種方法具有樣品用量少、操作簡單、富集倍數(shù)高的特點(diǎn)，可以集成樣品的吸附、解吸、進(jìn)樣于一體，不使用或使用很少的有機(jī)溶劑[9-10]。SPME有多種萃取形式，包括管內(nèi)固相微萃取、固相微萃取纖維和固相微萃取攪拌棒（stir-bar sorptive extraction， SBSE）等。瓜環(huán)是一類人工合成的新型大環(huán)化合物。亞甲基橋聯(lián)不同數(shù)目的苷脲單元形成不同空腔大小的瓜環(huán)（Q[n]，n=5～10）。瓜環(huán)對分子的識別作用可通過疏水的空腔和富含羰基氧原子的端口來完成，呈現(xiàn)出作用模式豐富、分子識別能力強(qiáng)的特點(diǎn)。疏水的空腔與中性小分子或分子的中性部分通過疏水作用發(fā)生主客體包結(jié)作用，而瓜環(huán)的端口因呈負(fù)電性可與分子的極性部分發(fā)生離子-偶極、氫鍵等作用[11-12]。

本文團(tuán)隊(duì)報(bào)道將普通七元瓜環(huán)衍生化為單羥基七元瓜環(huán)（Q[7]-OH）后與端羥基聚二甲基硅氧烷（OH-PDMS）一起作為固定相，溶膠-凝膠法制備了基于單羥基七元瓜環(huán)的固相微萃取攪拌棒并應(yīng)用于食品中殘留雌激素的測定[13]。本文基于該萃取小棒良好的分子識別能力，首次對環(huán)境水樣中的3種硝基苯酚異構(gòu)體同時(shí)進(jìn)行了富集。為了提高萃取小棒對硝基苯酚異構(gòu)體的萃取效率，對影響萃取效率的因素，如萃取時(shí)間、溶液pH值、鹽離子濃度、解吸溶劑、解吸時(shí)間等進(jìn)行了優(yōu)化，并在最優(yōu)萃取條件下，利用SBSE-高效液相色譜（high performance liquid chromatography， HPLC）-二極管陣列檢測器（diode-array detector， DAD）方法對水中的硝基苯酚異構(gòu)體進(jìn)行了測定，取得了滿意的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

甲醇、乙腈，色譜純;磷酸、氯化鈉、二氯甲烷，分析純。三氟乙酸（TFA），γ-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷 （KH-560），端羥基聚二甲基硅氧烷（OH-PDMS），甲基三甲氧基硅烷（MTMOS），含氫硅油（PMHS）均購自阿拉丁試劑公司（上海）。去離子水由Millipore 公司超純水器制得。對照品鄰硝基苯酚、間硝基苯酚和對硝基苯酚購自阿拉丁試劑公司，用甲醇配成濃度為1.0×10g/mL的混合儲備液，于冰箱中4 ℃保存?；旌腺A備液經(jīng)甲醇進(jìn)一步稀釋配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液并于冰箱中4 ℃保存。

島津LC-10A高效液相色譜儀（日本），配備自動進(jìn)樣器和二極管陣列檢測器（diode-array detector， DAD）; KQ2200 型超聲波清洗器（昆山超聲波儀器有限公司）;ZNCL-S-5D 多點(diǎn)智能磁力攪拌器（河南予華儀器有限公司）。TGL-16C高速離心機(jī)（上海安亭儀器廠）。

根據(jù)文獻(xiàn)[14]的方法， 實(shí)驗(yàn)室自制單羥基七元瓜環(huán)（Q[7]-OH），結(jié)構(gòu)如圖1所示。

1.2 萃取小棒（SBSE）的制備

將1.0 mm × 15 mm 的玻璃管作為萃取小棒的載體，其內(nèi)心密封一段鐵絲并兩端燒結(jié)封死。將此玻璃管浸泡在l mol/L的NaOH溶液中8 h，去離子水清洗后再浸泡在0.1 mol/L的HCl溶液中2 h，最后用去離子水洗至中性并在120 ℃下烘干備用。

SBSE小棒的制備：于10 mL聚氯乙烯離心管中依次加入Q[7]-OH 20 mg，TFA（95%）300 μL，CHCI 500 μL，OH-PDMS 300 μL，MTMOS 50 μL，PMHS 50 μL和KH-560 300 μL。離心管在渦旋振蕩器上混勻3 min后，在高速離心機(jī)上以12 000 r/min離心5 min，用滴管移出上清液置于另一個(gè)10 mL的聚氯乙烯離心管中。將處理好的玻璃管放入此清液中進(jìn)行反復(fù)涂覆，涂覆的次數(shù)可控制小棒涂層的厚度。涂覆好的SBSE小棒于氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫放置12 h成膠。

小棒老化：為使凝膠涂層固化，需對小棒進(jìn)行加熱老化處理。成膠后的小棒放置于100 mL圓底燒瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下升溫老化小棒。溫度設(shè)置為60 ℃，小棒保持30 min，然后升溫至120 ℃停留1 h，最后溫度升到180 ℃保持1 h完成小棒的老化。

小棒清洗：小棒涂層上未反應(yīng)的固定相可通過清洗的方法去除。將制備好的小棒在80 ℃蒸餾水中浸泡清洗1 h可去除未反應(yīng)的Q[7]-OH，然后再放入40 ℃二氯甲烷中回流清洗2 h可去除未反應(yīng)的其他有機(jī)反應(yīng)試劑。制備好的小棒經(jīng)電鏡測量厚度大約為 440 μm ，如圖2所示。小棒的涂層表面具有粗糙、多孔的特點(diǎn)，與文獻(xiàn)[13-14]的結(jié)果一致，因此有關(guān)的表征如電鏡、紅外、熱重等不過多贅述。（a）小棒涂層的厚度 （b）小棒的形狀

1.3 SBSE-HPLC 實(shí)驗(yàn)方法

在10 mL帶密封墊的樣品瓶中放入1根自制的萃取小棒，精密加入經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后的水樣樣品8.0 mL，并在室溫下攪拌萃取50 min。萃取完成后，取出小棒用無塵紙擦干表面的水分。將萃取后的小棒放入200 μL樣品瓶內(nèi)插管中，加入甲醇100 μL，超聲解吸10 min。取20 μL解吸液進(jìn)行HPLC分析。小棒每次使用后，需用5 mL甲醇分別超聲洗滌3次以除去吸附的雜質(zhì)。

1.4 色譜條件

色譜柱，ODS-BP（SinoChrom，4.6 mm×200 mm， 5 μm）;檢測波長220 nm;流動相，甲醇-水（用磷酸調(diào)pH=5.0），其中甲醇的體積分?jǐn)?shù)為30%;流速0.8 mL/min;進(jìn)樣量20 μL;溫度，室溫。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件的優(yōu)化

用自制的SBSE小棒考察了解吸溶劑的種類、溶液的pH值、鹽離子濃度、萃取時(shí)間、解吸時(shí)間等因素對3種硝基苯酚異構(gòu)體萃取效率的影響，確定最佳萃取條件。

2.1.1 解吸溶劑的考察

解吸溶劑是影響小棒萃取效率比較重要的因素。合適的解吸溶劑可使吸附的待測物質(zhì)完全解吸以提高萃取效率。本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、乙醇和乙腈作為解吸溶劑對硝基苯酚異構(gòu)體萃取效率的影響，結(jié)果如圖3（a）所示。從圖3（a）可以看出：甲醇對3種化合物的解吸效果最好，故選做本實(shí)驗(yàn)的解吸劑;自制小棒對鄰硝基苯酚的萃取效率最好，這可能是因?yàn)猷徬趸椒拥目臻g位阻最小，最有利于分子上的苯環(huán)進(jìn)入七元瓜環(huán)的空腔而發(fā)生相互作用。

2.1.2 萃取溶液的pH值

酸性或堿性化合物在溶液中的存在形式受溶液pH值的影響很大。一般中性存在形式更利于涂層的萃取。酚類化合物是酸性物質(zhì)，在酸性條件下以分子形式存在有利于萃取。從圖3（b）可以看出，3種硝基苯酚異構(gòu)體在pH為3時(shí)，萃取效率均為最佳，故選擇pH為3作為最佳萃取pH值。

2.1.3 鹽離子濃度

鹽效應(yīng)可通過增加溶液中離子強(qiáng)度的方式降低有機(jī)物在水中的溶解度，使待測物以分子形式析出，有利于在涂層上的吸附。從圖3（c）可以看出：隨著加入鹽離子濃度的增大，3個(gè)硝基苯酚化合物的萃取效率提高，鹽離子濃度為0.30 g/mL時(shí)幾乎已達(dá)到其飽和濃度，因此采用飽和氯化鈉作為鹽離子濃度。

2.1.4 萃取時(shí)間

萃取時(shí)間越長，待測物在小棒上吸附的量越多，最后吸附達(dá)到平衡，萃取量不再增加。從圖3（d）可以看出，當(dāng)萃取時(shí)間為50 min時(shí)，吸附量達(dá)到最大，所以選擇50 min為最佳萃取時(shí)間。

2.1.5 解吸時(shí)間

解吸時(shí)間越長，目標(biāo)物解吸得越徹底，但過長的解吸時(shí)間會縮短涂層的使用壽命。從圖3（e）可以看出，解吸時(shí)間為10 min 時(shí)就可獲得最好的萃取效率，因此選擇10 min為最佳解吸時(shí)間。

2.2 SBSE-HPLC-DAD分析方法的方法學(xué)驗(yàn)證

精密量取相同體積不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入到8 mL水樣中，配成一系列濃度的加標(biāo)溶液，按照1.3 和 1.4的方法進(jìn)行處理并測定。以3個(gè)硝基苯酚異構(gòu)體的峰面積對質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得到3個(gè)硝基苯酚的線性范圍和相關(guān)系數(shù)。方法的檢測限（Ld）和定量限（Lq）分別按照公式L = 3S/S和L= 10S/S進(jìn)行計(jì)算，其中，S為10次空白試劑所測值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，S為分析校準(zhǔn)曲線的斜率。日內(nèi)精密度以濃度為0.8 mg/L的樣品在一日內(nèi)連續(xù)測定5次的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示;日間精密度則以同一個(gè)樣品連續(xù)測定5 d，每天重復(fù)測定3次的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。所有測定結(jié)果如表1所示。從表1可以看出：本法的線性范圍為0.01～10.00 mg/L，檢測限為0.002～0.006 mg/L，日內(nèi)、日間精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（D）為2.9%～7.5%， 說明該法具有較寬的線性范圍、良好的靈敏度和重現(xiàn)性。

2.3 實(shí)際樣品分析

為檢驗(yàn)本方法的適用性，對當(dāng)?shù)鼗ㄏ铀?、自來水和校園湖水進(jìn)行了檢測，沒有檢測出3種硝基苯酚異構(gòu)體。以花溪河水為樣本，在高、中、低3個(gè)濃度水平進(jìn)行了加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，相關(guān)的色譜圖如圖4所示，測定結(jié)果見表2。3個(gè)加標(biāo)濃度的平均相對回收率為71.5%～116.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%～8.7%，說明所建立方法的準(zhǔn)確度和精密度良好，可用于實(shí)際水樣中3種硝基苯酚異構(gòu)體的測定。

2.4 本文方法與其他分析方法的比較

將本文方法與文獻(xiàn)報(bào)道的測定水樣中硝基苯酚異構(gòu)體的方法進(jìn)行了比較，結(jié)果見表3。從表3可以看出，本文方法具有更好的靈敏度，樣品處理簡單、環(huán)保、取樣量少。結(jié)果表明：自制萃取小棒選擇性好，萃取性能高，能較好地提高儀器測定的靈敏度。

3結(jié)論

通過溶膠-凝膠方法制備了基于單羥基七元瓜環(huán)的固相微萃取攪拌棒，聯(lián)用HPLC-DAD建立了水樣中3種硝基苯酚異構(gòu)體的測定方法。通過對萃取條件的優(yōu)化，得到固相微萃取攪拌棒對酚類物質(zhì)萃取的最優(yōu)萃取條件為：萃取時(shí)間50 min， 溶液的pH值為3.0，鹽離子濃度為飽和氯化鈉，解吸溶劑為甲醇，解吸時(shí)間10 min。方法的樣品預(yù)處理簡單、環(huán)保、樣品用量少。測定結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏，滿足水樣中痕量硝基苯酚異構(gòu)體的檢測要求。參考文獻(xiàn)：

[1]BHUSHAN B， CHAUHAN A， SAMANTA S K， et al. Kinetics of biodegradation of p-Nitrophenol by different bacteria[J]. Bio-chemical & Biophysical Research Communications， 2000， 274： 626-630.

[2] 王志強(qiáng)， 張依章， 張遠(yuǎn)， 等. 太湖流域宜潥河酚類內(nèi)分泌干擾物的空間分布及風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)[J]. 環(huán)境科學(xué)研究， 2012（12）： 1351-1358.

[3] 郭九吉， 薄新黨， 王非， 等. 單壁碳納米管-Nafion修飾電極同時(shí)測定硝基苯酚異構(gòu)體[J]. 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)（理學(xué)版）， 2012， 44（2）： 72-75.

[4] 程佳， 候文欣， 程曉昆， 等. 雙濁點(diǎn)萃取-毛細(xì)管電泳法分離測定井水中痕量硝基苯酚位置異構(gòu)體[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011， 39（12）： 7338-7341.

[5] 環(huán)境保護(hù)部. 水質(zhì) 酚類化合物的測定 液液萃取/氣相色譜法： HJ 676—2013[S]. 北京： 中國環(huán)境科學(xué)出版社， 2013.

[6] 環(huán)境保護(hù)部. 水質(zhì) 酚類化合物的測定 氣相色譜法-質(zhì)譜法： HJ 744—2015[S]. 北京： 中國環(huán)境科學(xué)出版社， 2015.

[7] 彭華， 趙新娜， 王晶晶， 等. 固相萃取-液相色譜/質(zhì)譜法測定水中硝基苯酚類化合物[J]. 環(huán)境監(jiān)控與預(yù)警， 2017， 9（3）： 31-34.

[8] 王芳， 岳方. 固相萃取-高效液相色譜法同時(shí)測定水中硝基苯酚的三種異構(gòu)體[J]. 廣東化工， 2011， 38（10）： 155-156.

[9] ARTHUR C L， PAWLISZYN J. Solid phase microextraction with thermal desorption using fused silica optical fibers[J]. Analtical Chemistry， 1990， 62： 2145-2148.

[10]JELEN H H， MAJCHER M， DZIADAS M. Microextraction techniques in the analysis of food flavor compounds： a review[J]. Analytical Chimica Acta， 2012， 738：13-26.

[11]KIM J， JUNG I S， KIM S Y， et al. New cucurbituril homologues syntheses， isolation characterization and X-ray crystal structures of cucurbit[n]uril（n=5，7，and 8） [J]. Journal of the American Chemical Society， 2000， 122： 540-541.

[12]ANTHONY I D， RODNEY J B， ALAN P A， et al. A cucurbituril-based gynoscane a new supramolecular form[J]. Angewandte Chemie International Edition， 2002， 41： 275-277.

[13]姚鍵梅， 董美玉， 張凌雪， 等. 衍生瓜環(huán)固相微萃取攪拌棒-高效液相色譜測定食品中殘留雌激素[J]. 分析化學(xué)， 2019， 47（3）： 463-470.

[14]DONG N， ZHANG L X， YAO J M， et al. Monohydroxycucurbit[7]uril-coated stir-bar sorptive extraction coupled with high-performance liquid chromatography for the determination of apolar and polar organic compounds [J]. Microchimica Acta， 2019， 186： 846-856.

[15]王峻敏， 范哲峰. 石墨烯復(fù)合材料修飾電極對硝基苯酚同分異構(gòu)體的測定[J]. 分析試驗(yàn)室， 2015， 34（9）： 1086-1089.

[16]張?jiān)俜澹?沈志群， 陸亮. 在線富集固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定地表水中對硝基苯酚[J]. 環(huán)境監(jiān)控與預(yù)警， 2019， 11（2）： 31-33.

（責(zé)任編輯：周曉南）

Determination of Nitrophenol Isomers in Environmental Water by

Solid-phase Microextraction Based on Monohydroxy-Cucurbit[7]uril

ZHAO Yuxuan， DONG Nan*， DONG Meiyu

（School of Chemistry and Chemical Engineering， Guizhou University， Guiyang 550025， China）Abstract： Stir-bar sorptive extraction （SBSE） based on PDMS/Q[7]-OH was prepared by sol-gel method using hydroxyl-terminated polydimethylsiloxane （OH-PDMS） and monohydroxy-cucurbit[7]uril （Q[7]-OH） as stationary. A SBSE-High performance liquid chromatography with diode array detector （HPLC/DAD） method was developed for the simultaneous determination of three nitrophenol isomers in environmental water samples. The extraction time， pH value of solution， the concentration of salt ions， desorption solvent and desorption time were optimized. Under optimal conditions， the linear range of three nitrophenol isomers determined by SBSE-HPLC-DAD was between 0.01 mg/L and 10.00 mg/L， and the correlation coefficient were all greater than 0.999 7. The limits of detection of the proposed method were in the range of 0.002-0.006 mg/L. The mean relative recoveries at three spiked levels ranged from 71.5% to 116.8%， with intra-precision and inter-precision both in the range of 2.9%-7.5%. The proposed method is simple and sensitive， and it is suitable for the simultaneous analysis of phenols in environmental water.

Key words： monohydroxy-cucurbit[7]uril; stir-bar sorptive extraction; nitrophenols isomers; high performance liquid chromatography; environmental water samples