王 燕，劉書偉，張?zhí)锾?，侯亞楠，沈?mèng)霞

(1.海南熱帶海洋學(xué)院 生態(tài)環(huán)境學(xué)院，海南 三亞 572022；2.三亞市功能檳榔研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 三亞 572022)

0 引言

檳榔(ArecacatechuL.)是棕櫚科多年生常綠喬木，屬溫濕熱型陽(yáng)性植物，主要分布在南北緯28°之間。海南省檳榔產(chǎn)量位居世界第二位，海南省也是我國(guó)檳榔的最大產(chǎn)區(qū)，檳榔已成為海南僅次于橡膠的第二大熱帶特色經(jīng)濟(jì)作物[1]。檳榔作為傳統(tǒng)中藥材，位居我國(guó)四大南藥之首[2]。現(xiàn)代藥理研究表明，檳榔中含有多種活性成分和代謝產(chǎn)物，具有促消化[3]、抑菌[4]、降血糖[5]、驅(qū)蟲[6]、抗抑郁[7]和抗氧化[8]等功能[9]。檳榔中含有的活性成分主要為生物堿、黃酮、鞣質(zhì)、脂肪酸、萜類和甾體等[10]。檳榔多酚是檳榔的次級(jí)代謝產(chǎn)物，檳榔果中含有大約15%的酚類物質(zhì)[11]。研究表明，檳榔多酚具有較強(qiáng)的抗氧化性，對(duì)檳榔抗氧化活性的貢獻(xiàn)可達(dá)到82.05%[12]，此外還具有抑菌抗病毒[13]、抗抑郁[14]、降血糖[15-16]等多種生理和藥理活性。

目前，檳榔多酚的多種生物活性引起相關(guān)研究人員的高度關(guān)注，但對(duì)檳榔多酚提取工藝的研究和報(bào)道較少。為了更有效地提取檳榔多酚，本文采用響應(yīng)面法優(yōu)化多酚提取工藝中的因素參數(shù)，響應(yīng)面法可以通過(guò)回歸模型方程和直觀圖形高效、全面地對(duì)提取工藝參數(shù)進(jìn)行分析及可行性判定[17]。本研究以新鮮全檳榔烘干樣為試驗(yàn)材料，以檳榔多酚得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定不同提取工藝參數(shù)(料液比、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度)的適宜數(shù)值后，采用響應(yīng)面法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、回歸方程模型擬合及對(duì)因素參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定多酚最佳提取工藝，提高檳榔多酚得率，為檳榔多酚的提取及相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料來(lái)源及預(yù)處理：2020年11月在瓊海市一處檳榔園采摘可上市的優(yōu)質(zhì)新鮮檳榔，洗凈晾干后切成兩半，放于烘箱中80 ℃殺青、60 ℃鼓風(fēng)烘干，然后用粉碎機(jī)將干果粉碎,混合均勻備用。

主要試劑：沒(méi)食子酸(標(biāo)準(zhǔn)品，北京索萊寶科技有限公司)，無(wú)水乙醇(AR)、福林酚試劑(BR)、碳酸鈉(AR，西隴科學(xué)股份有限公司)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱(博造機(jī)械設(shè)備有限公司)；HH-S4型恒溫水浴鍋(江蘇金怡儀器科技有限公司)；ME204E電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；UV2300分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)；微型粉碎機(jī)(上海微型電機(jī)廠)；RE311型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(大和科學(xué)重慶有限公司)；LC-HL210D離心機(jī)(上海力辰儀器科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法及步驟

1.3.1 浸提檳榔多酚

按照單因素實(shí)驗(yàn)要求稱取適量檳榔粉末放入試管中，加入相應(yīng)濃度的乙醇作為提取液，放入水浴鍋中，在設(shè)定的實(shí)驗(yàn)條件下浸沒(méi)提取檳榔多酚，之后轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)速3 500 r·min-1的離心機(jī)中離心10 min，收集上清液，于45 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(轉(zhuǎn)速14 r·min-1)除去乙醇，得到檳榔多酚粗提液，用蒸餾水定容至1 000 mL待測(cè)。

1.3.2 測(cè)定檳榔多酚含量

檳榔多酚采用福林酚比色法[18]測(cè)定。用沒(méi)食子酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以沒(méi)食子酸的濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，吸光值(OD)為縱坐標(biāo)，經(jīng)Excel表格處理得到二元一次標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.031 5x-0.016 8，R2=0.993 9。檳榔多酚計(jì)算參考田燕楠等[19]的如式(1)的計(jì)算方法。

(1)

其中：Y代表多酚得率(mg·g-1)；X1代表多酚濃度(mg·mL-1)；X2代表提取液定容體積(mL)；X3代表檳榔粉末質(zhì)量(g)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和多酚得率公式計(jì)算檳榔多酚得率，每個(gè)樣品平行試驗(yàn)3次。

1.3.3單因素試驗(yàn)

按照1.3.1和1.3.2的多酚測(cè)定方法，在參考文獻(xiàn)[20-21]的基礎(chǔ)上設(shè)置單因素試驗(yàn)并做修改。在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以檳榔多酚得率為指標(biāo)，分別測(cè)定不同料液比(0.025、0.050、0.075、0.100、0.125、0.150、0.175 g·mL-1)、提取時(shí)間(10、30、50、70、90 min)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(10%、25%、40%、55%、70%、85%)、提取溫度(30、45、60、75、90 ℃)下多酚得率的變化情況，并確定各因素適宜取值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定均設(shè)3次重復(fù)。采用Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)處理分析；采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1料液比的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間50 min的條件下，分別測(cè)定不同料液比0.025、0.050、0.075、0.100、0.125、0.150、0.175 g·mL-1對(duì)檳榔多酚得率的影響。由圖1可知，多酚得率隨料液比的增大而增大，直至料液比為0.150 g·mL-1時(shí)達(dá)到最大值，而后降低。這可能是隨著料液比增大，活性成分濃度增大，使得多酚得率增大，但料液比過(guò)大則使溶劑滲透壓降低，不利于活性成分的溶出，導(dǎo)致多酚得率降低[22]570。然而在實(shí)際操作中，料液比達(dá)到0.125 g ·mL-1時(shí)浸提液已過(guò)于濃稠不利于操作，所以從經(jīng)濟(jì)、操作方便性等方面考慮，以0.100 g·mL-1為最佳提取料液比。同時(shí)料液比這一單因素不進(jìn)行響應(yīng)面法分析。

2.1.2提取時(shí)間的影響

固定料液比0.100 g·mL-1，在乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、提取溫度60 ℃條件下，分別測(cè)定不同提取時(shí)間10、30、50、70、90 min對(duì)檳榔多酚得率的影響。由圖2可知，檳榔多酚得率隨提取時(shí)間增長(zhǎng)而增大，至50 min時(shí)達(dá)到峰值，而后急劇下降。其原因可能是隨提取時(shí)間增長(zhǎng)，檳榔樣品與溶劑充分接觸致使多酚更加有效地從樣品中釋放，但提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，提取出的酚類物質(zhì)可能會(huì)被空氣中的氧氣破壞，導(dǎo)致多酚得率降低[23]。因此提取時(shí)間以50 min為宜。

圖1 料液比對(duì)檳榔多酚得率的影響 圖2 提取時(shí)間對(duì)檳榔多酚得率的影響

2.1.3乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

固定提取時(shí)間50 min、料液比0.100 g·mL-1，在提取溫度60 ℃的條件下，分別測(cè)定不同乙醇體積分?jǐn)?shù)10%、25%、40%、55%、70%、85%對(duì)檳榔多酚得率的影響。由圖3可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)低于40%時(shí)，多酚得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)升高快速增加，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%時(shí)達(dá)到峰值，之后呈緩慢降低的趨勢(shì)。這可能是乙醇體積分?jǐn)?shù)升高更容易破壞檳榔樣品中多酚類物質(zhì)與其他物質(zhì)間的氫鍵，從而提高多酚得率，但乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高導(dǎo)致溶液極性降低，使檳榔樣品中其他醇溶性物質(zhì)與多酚產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性溶出，導(dǎo)致多酚得率降低[24]31。因此乙醇體積分?jǐn)?shù)以55%為宜。

2.1.4提取溫度的影響

固定提取時(shí)間50 min、料液比0.100 g·mL-1、乙醇體積分?jǐn)?shù)55%的條件下，分別測(cè)定不同提取溫度30、45、60、75、90 ℃對(duì)檳榔多酚得率的影響。由圖4可知，檳榔多酚得率隨提取溫度的增加緩慢增加至75 ℃時(shí)達(dá)到峰值，之后呈平緩下降趨勢(shì)。原因可能是隨著溫度的逐漸升高，分子的溶出與擴(kuò)散加快，從而提高多酚得率；而溫度過(guò)高時(shí)，多酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)可能被破壞或與其他成分產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性溶出而降低多酚得率[24]32。因此提取溫度以75 ℃為宜。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)檳榔多酚得率的影響 圖4 提取溫度對(duì)檳榔多酚得率的影響

2.2響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)確定的各因素?cái)?shù)值，以提取溫度(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)、提取時(shí)間(C)為自變量，以檳榔多酚得率Y為響應(yīng)值，使用Design-Expert 軟件中的Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)為3因素3水平。響應(yīng)面試驗(yàn)因素、試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。

表1 提取溫度、時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)及其水平對(duì)多酚得率影響的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.2回歸方程與方差分析

以檳榔多酚得率Y為響應(yīng)值，利用Design-Expert軟件對(duì)各提取工藝因素進(jìn)行擬合分析，得到Y(jié)對(duì)A、B、C的回歸方程模型為

Y= 19.69-0.59A+0.27B+0.25C-1.11AB-0.11AC-0.33BC-0.41A2-0.93B2+0.45C2,

(2)

對(duì)回歸方程模型進(jìn)行方差分析，如表2所示。

由表2可知，A、AB(交互項(xiàng))、B2、C2的P值均小于0.01，說(shuō)明該因素或交互因素極顯著地影響檳榔多酚得率；B、C、交互項(xiàng)BC、A2的P值小于 0.05，說(shuō)明該因素或交互因素顯著地影響檳榔多酚得率；交互項(xiàng)AC的P值大于 0.05，說(shuō)明該交互項(xiàng)對(duì)檳榔多酚得率沒(méi)有顯著影響。分別用FA、FB、FC表示因素A、B、C對(duì)檳榔多酚得率影響的參數(shù)(對(duì)應(yīng)的F值)，根據(jù)F值的大小[22]572可知，這3個(gè)提取因素參數(shù)對(duì)檳榔多酚得率的影響為：FA>FB>FC。

表2 檳榔多酚得率與提取溫度、時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)的回歸方程模型方差分析結(jié)果

表2 (續(xù))

2.2.3響應(yīng)面曲線

用Design-Expert軟件做出3個(gè)提取工藝因素之間的兩兩因素交互作用的響應(yīng)面曲線圖，結(jié)果見圖5～圖7。響應(yīng)面曲線圖可反映出提取因素之間兩兩交互作用是否對(duì)檳榔多酚得率具有顯著影響，若響應(yīng)面坡度越陡峭，表明響應(yīng)值受該實(shí)驗(yàn)因素的影響越大變化也越大[22]573，即說(shuō)明該因素對(duì)多酚得率的影響越大，反之則影響越小。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度的響應(yīng)面

圖6 檳榔多酚得率提取時(shí)間和提取溫度的響應(yīng)面 圖7 檳榔多酚得率提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)的響應(yīng)面

由圖5～圖7可看出，3個(gè)提取因素參數(shù)對(duì)檳榔多酚得率的影響為：FA>FB>FC；交互項(xiàng)對(duì)多酚得率的影響中，A與B、B與C交互作用顯著，A與C交互作用不顯著。此結(jié)論與表3的方差分析結(jié)果相同。

2.2.4最佳提取工藝及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在料液比為0.100 g·mL-1的條件下，通過(guò)軟件分析預(yù)測(cè)得出檳榔多酚的最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)63.45%、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間70 min?？紤]到實(shí)際操作的可行性，將乙醇體積分?jǐn)?shù)修改為64%，其他2個(gè)因素的參數(shù)不變。在此最佳提取工藝參數(shù)下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，檳榔多酚得率分別為20.58、19.22、21.86 mg·g-1，取平均值后得到檳榔多酚得率實(shí)際值為(20.55 ± 0.706)mg·g-1，與模型的理論預(yù)測(cè)值20.98 mg·g-1的相對(duì)誤差為2.03%，說(shuō)明該優(yōu)化后的提取工藝準(zhǔn)確性高、可行。普義鑫[25]以甲醇為溶劑，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝后，檳榔多酚提取率為17.82 mg·g-1，稍低于本試驗(yàn)的提取率。韓林[26]以乙醇為溶劑，采用超聲波輔助響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝后得到檳榔核中總酚含量為160.95 mg·g-1，高于本試驗(yàn)結(jié)果，原因一是可能提取方法存在差異；二是總酚含量包含多酚和單酚；三是檳榔核中多酚含量遠(yuǎn)高于檳榔殼和檳榔花[25]。

3 結(jié)論

本研究以全檳榔為原料，以檳榔多酚得率為響應(yīng)值，采用單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面法優(yōu)化檳榔多酚提取工藝。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該回歸方程模型極顯著，與實(shí)驗(yàn)擬合程度良好；回歸方程的方差分析及兩兩因素交互作用響應(yīng)面曲線圖表明，在提取工藝因素參數(shù)對(duì)檳榔多酚得率的影響中，以提取溫度的影響最顯著，其次是乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間；在固定料液比0.100 g·mL-1的條件下，根據(jù)回歸方程模型進(jìn)行預(yù)測(cè)和驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，確定了檳榔多酚的最佳提取工藝參數(shù)為提取溫度60 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)64%、提取時(shí)間70 min。在此最佳工藝條件下，檳榔多酚得率為(20.55±0.706)mg·g-1，與理論預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差較小。該研究可為檳榔多酚的提取及檳榔藥用資源的開發(fā)提供參考依據(jù)。