彭汝雨,李 曦,Hebert Ely Vasquez,鄭 興,顧志峰

(1.中交天航南方交通建設(shè)有限公司,廣東 深圳 518000;2.海南大學(xué) 海洋學(xué)院，海口 570228)

0 引言

大珠母貝 (Pinctadamaxima) 俗稱白蝶貝，屬于珍珠貝科(Pteriidae)、珠母貝屬(Pinctada)，喜棲息在 10 m 以上水深的珊瑚礁或沙礫海域，營(yíng)附著生活[1]。大珠母貝是我國(guó)熱帶海域主要的大型珍珠貝品種，是海水珍珠貝中體型最大、貝殼最厚的種類，主要分布在海南、廣西、廣東等南方沿海區(qū)域[2-3]。大珠母貝所培育的圓形游離海水珍珠俗稱“南洋珠”，直徑最大可達(dá)2.0 cm，且具有珠層厚、光澤好的特點(diǎn)，其價(jià)值遠(yuǎn)高于其他珍珠貝品種所培育的珍珠，屬珍珠中的珍品[4-5]。

我國(guó)海水珍珠主要由體型較小的馬氏珠母貝培育，在20世紀(jì)90年代，其珍珠產(chǎn)量居世界海水珍珠產(chǎn)量首位，且珍珠質(zhì)量較好。然而21世紀(jì)以來(lái)，由于環(huán)境、苗種以及馬氏珠母貝體型本身的限制等，產(chǎn)量急劇下降，2013年全國(guó)海水珍珠產(chǎn)量已不足2 t，而且珍珠小、珠層薄、瑕疵多、質(zhì)量差，多數(shù)無(wú)法達(dá)到珠寶級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，基本上不被國(guó)際珠寶市場(chǎng)認(rèn)可[6]?；谀壳皣?guó)際珍珠市場(chǎng)大型海水珍珠價(jià)值、產(chǎn)量和地位迅速攀升的現(xiàn)實(shí)，培育規(guī)格大、珠層厚、光澤好的優(yōu)質(zhì)大型海水圓形珍珠是我國(guó)海水珍珠養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的必由之路，而大珠母貝是培育大型海水圓形珍珠最理想的珍珠貝。

我國(guó)海水珍珠研究人員自20世紀(jì)60年代就開始了大珠母貝研究，于20世紀(jì)80年代培育出中國(guó)第一顆大珠母貝“南洋珠”，該研究成果曾獲國(guó)家科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)。遺憾的是，這一成果至今沒有實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，其主要原因是在養(yǎng)殖生產(chǎn)中大珠母貝人工苗種養(yǎng)殖至殼長(zhǎng)3～7 cm時(shí)其存在規(guī)?；劳霈F(xiàn)象，這成為大珠母貝養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的技術(shù)瓶頸[7]。為有效提高大珠母貝稚貝養(yǎng)殖存活率，諸多學(xué)者開展了養(yǎng)殖方式、海上管理方式、喂養(yǎng)策略等多方面的研究[8-9]。在大珠母貝稚貝養(yǎng)殖過(guò)程中，餌料的類型會(huì)影響稚貝的存活率和生長(zhǎng)速度[10]，珍珠貝可能在不同發(fā)育階段對(duì)餌料的需求存在一定差異，不同發(fā)育階段不同規(guī)格的稚貝對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境的耐受能力也有差異。課題組前期進(jìn)行的大珠母貝稚貝接力式養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同規(guī)格的稚貝在海上中間培育階段存活率存在明顯差異。本文在此基礎(chǔ)上選擇兩種不同大小規(guī)格的大珠母貝稚貝在海棠灣海域繼續(xù)開展試養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，并從生長(zhǎng)性能、生理活力及腸道菌群結(jié)構(gòu)角度探究稚貝規(guī)格和存活率之間的關(guān)系，以期為大珠母貝稚貝海上中間培育技術(shù)的優(yōu)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與管理

實(shí)驗(yàn)所用兩種規(guī)格的大珠母貝稚貝(殼長(zhǎng)分別為30 mm和20 mm)均由海南三亞邁豐實(shí)業(yè)有限公司提供。稚貝在移入海棠灣海域開展試養(yǎng)實(shí)驗(yàn)前，都在室內(nèi)養(yǎng)殖車間進(jìn)行養(yǎng)殖管理。期間每天使用湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)、亞心形扁藻(Platymonassubcordiformis)和牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)進(jìn)行混合投喂，養(yǎng)殖水體每天換水，換水量為30%，以保證養(yǎng)殖水體中的總氨氮含量小于0.02 mg·L-1，溶解氧濃度不小于6 mg·L-1。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)采用片籠吊養(yǎng)方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的養(yǎng)殖，將殼長(zhǎng)30 mm和20 mm的大珠母貝實(shí)驗(yàn)組分別標(biāo)記為HA組和HB組，在養(yǎng)殖場(chǎng)室內(nèi)移入相應(yīng)片籠中后，直接運(yùn)至海棠灣蜈支洲島試養(yǎng)海域。實(shí)驗(yàn)共持續(xù)60 d，期間每10 d進(jìn)行一次附著物清理工作，試養(yǎng)結(jié)束后分別對(duì)HA組和HB組稚貝進(jìn)行樣品采集及數(shù)據(jù)收集，進(jìn)而開展統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)分析。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 存活率的檢測(cè)

試養(yǎng)的大珠母貝稚貝存活率(SR，記為ρSR)的計(jì)算方法為

ρSR=(N2/N1)×100%,

(1)

其中：N1、N2分別為稚貝總數(shù)和存活稚貝個(gè)數(shù)。

1.3.2 殼長(zhǎng)相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

使用游標(biāo)卡尺對(duì)稚貝樣品進(jìn)行殼長(zhǎng)測(cè)量，以便計(jì)算絕對(duì)增長(zhǎng)率(AGR,記為kAGR)和相對(duì)增長(zhǎng)率(RGR，記為kRGR)，其計(jì)算公式為

(2)

(3)

其中：X1和X2分別是試養(yǎng)實(shí)驗(yàn)前后樣品的平均殼長(zhǎng)，t是實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

1.3.3 消化酶及免疫酶活力的檢測(cè)

對(duì)HA組和HB組樣品測(cè)量其形態(tài)指標(biāo)后，隨機(jī)取部分樣品分別分成2份投入液氮中進(jìn)行保存，其中一部分用于消化酶和免疫酶活力的檢測(cè)。消化酶包括淀粉酶(AMS)、胃蛋白酶(PES)、脂肪酶(LPS)，免疫酶包括溶菌酶(LZM)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)。實(shí)驗(yàn)采用南京建成生物科技有限公司的生化試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書所示的方法進(jìn)行。

1.3.4 腸道微生物分析

液氮保存的另一份樣品用于腸道菌群構(gòu)成分析，該部分樣品直接送至杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)，樣品保存方法及步驟嚴(yán)格按照技術(shù)要求進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用統(tǒng)計(jì)分析軟件DPS 14.5進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 存活率及生長(zhǎng)差異比較

HA組和HB組間的實(shí)驗(yàn)存活率、生長(zhǎng)性能(表1)存在顯著差異(P<0.05)，且HA組優(yōu)于HB組。HA組存活率為(86.16±1.58)%，顯著高于HB組的結(jié)果(67.88±3.02)%。試養(yǎng)結(jié)束后，HA組和HB組殼長(zhǎng)分別增至(43.18±3.17) mm和(26.65±2.06) mm；HA組殼長(zhǎng)的絕對(duì)和相對(duì)增長(zhǎng)率分別為(0.22±0.05)mm·d-1、(0.73±0.06)%·d-1，顯著高于HB組的相應(yīng)結(jié)果(0.11±0.04)mm·d-1、(0.55±0.09)%·d-1。

表1 不同規(guī)格大珠母貝稚貝存活率及殼長(zhǎng)比較(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

2.2 部分消化酶和免疫活力差異比較

試養(yǎng)結(jié)束后，HA組與HB組間部分消化酶和免疫酶活力(表2)存在顯著差異(P<0.05)，HA組的酶活力均高于HB組。其中，HA組淀粉酶和胃蛋白酶活力分別為(4.07±0.45)、(3.38±0.19)U·mg·prot-1，顯著高于HB組的相應(yīng)結(jié)果(2.00±0.52)、(2.36±0.16) U·mg·prot-1；HA組堿性磷酸酶、酸性磷酸酶和溶菌酶活力都高于HB組，分別為(16.49±0.80)、(14.58±0.38)King·mg·prot-1和(16.86±1.25) U·mg·prot-1。

表2 不同規(guī)格大珠母貝稚貝消化酶和免疫酶活力比較(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

2.3 腸道菌群組成比較

試養(yǎng)結(jié)束后，HA組與HB組間腸道菌群結(jié)構(gòu)(圖1)總體相似，群落結(jié)構(gòu)不存在顯著差異(P>0.05)。其中，在門水平上，變形菌門(Proteobacteria)和浮霉菌門(Planctomycetes)都為兩組實(shí)驗(yàn)貝的優(yōu)勢(shì)菌群，

(a)門水平 (b) 屬水平 圖1 不同規(guī)格大珠母貝稚貝腸道菌群組成比較

在HA組中其相對(duì)豐度分別為63.36%、68.87%，在HB組中則分別為16.35%、18.32%。在屬水平上，伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)和弧菌屬(Vibrio)為優(yōu)勢(shì)菌群，在HA組中其相對(duì)豐度分別為53.83%、55.11%，在HB組中則分別為18.26%、16.29%。

3 討論

養(yǎng)殖活動(dòng)中存活率和生長(zhǎng)性能是行業(yè)中最關(guān)注的重要評(píng)判因素之一[10-12]。本文所選海棠灣蜈支洲島試養(yǎng)海域?yàn)榈湫蜔釒夂蚝Ｓ?，自然環(huán)境下餌料種類豐富，鹽度和溫度等環(huán)境條件合適，對(duì)于大珠母貝、珠母貝、馬氏珠母貝等熱帶養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)貝類而言是較好的棲息環(huán)境。本研究所獲結(jié)果表明，兩種規(guī)格的大珠母貝稚貝在蜈支洲島試養(yǎng)海域存活率可達(dá)67%以上，該存活率雖然低于室內(nèi)培養(yǎng)的同批次稚貝的結(jié)果(88%，數(shù)據(jù)來(lái)源于養(yǎng)殖場(chǎng))，但其生長(zhǎng)性能優(yōu)于室內(nèi)同批次稚貝的結(jié)果。這可能是因?yàn)轵谥е迧u試養(yǎng)海域餌料種類較豐富和數(shù)量比較充足，可滿足大珠母貝稚貝在該階段生長(zhǎng)發(fā)育所需的餌料的營(yíng)養(yǎng)性和數(shù)量。本研究結(jié)果與Yang等[13]關(guān)于大珠母貝稚貝室內(nèi)養(yǎng)殖與海上養(yǎng)殖的情況對(duì)比，以及與楊創(chuàng)業(yè)等[12]關(guān)于馬氏珠母貝室內(nèi)養(yǎng)殖與海上養(yǎng)殖效果的比較均較為一致，主要原因在于餌料種類和營(yíng)養(yǎng)的豐富度和充足性。本研究中，將30 mm規(guī)格組與20 mm規(guī)格組的稚貝的存活率和生長(zhǎng)性能進(jìn)行對(duì)比，得到的結(jié)果是30 mm規(guī)格組稚貝的存活率較高，生長(zhǎng)性能也較優(yōu)。其原因可能在于較大規(guī)格的稚貝具有相對(duì)較強(qiáng)的體質(zhì)、攝食能力，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)耐受性更強(qiáng)，且對(duì)餌料的營(yíng)養(yǎng)吸收更為快速有效。

動(dòng)物對(duì)餌料或飼料的消化吸收過(guò)程較為復(fù)雜，消化酶在這個(gè)過(guò)程中有著十分重要的作用。消化酶可以幫助機(jī)體消化和分解從外界攝取的食物，從而為機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖等生命活動(dòng)提供所需的能量[14]。目前所關(guān)注的消化酶主要為淀粉酶、胃蛋白酶和脂肪酶，酶活力的大小常被用作反映動(dòng)物消化性能、營(yíng)養(yǎng)狀況等方面的重要指標(biāo)[15]。本研究結(jié)果表明，大珠母貝稚貝在海區(qū)吊養(yǎng)期間，30 mm規(guī)格組稚貝的胃蛋白酶、脂肪酶活力顯著高于20 mm規(guī)格組的結(jié)果，這代表著30 mm規(guī)格組稚貝的消化能力強(qiáng)于20 mm規(guī)格組稚貝，從而可獲得更多的能量用于生長(zhǎng)及環(huán)境適應(yīng)，這在一定程度上也反映了兩組不同規(guī)格稚貝在同一試養(yǎng)海域養(yǎng)殖時(shí)生長(zhǎng)性能和存活率存在差異的原因。30 mm規(guī)格組稚貝具有較好的攝食及消化能力，可更有效地獲得食物及吸收營(yíng)養(yǎng)，從而擁有更多的能量抵御不良環(huán)境因子的脅迫，有更多機(jī)會(huì)生存于野外環(huán)境，繼而生長(zhǎng)發(fā)育。

抗氧化系統(tǒng)可清除體內(nèi)過(guò)量活性氧，保護(hù)機(jī)體不受氧化損傷，其中起免疫防御功能的免疫酶對(duì)機(jī)體抗逆能力是十分重要的。ACP、AKP 是兩種重要的代謝調(diào)控酶，同時(shí)也是巨噬細(xì)胞溶酶體酶的標(biāo)志酶，通過(guò)形成水解酶體系消除異物，從而起到免疫防御的功能[16-18]。LZM屬于機(jī)體的非特異性免疫因子，是非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成成分，參與多種免疫反應(yīng)，在免疫反應(yīng)中可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬和消化能力，激活白細(xì)胞的吞噬功能，誘導(dǎo)其他免疫因子的合成和分泌，其活力變化可作為動(dòng)物免疫機(jī)能狀態(tài)的指標(biāo)[19-20]。ACP、ALP和LZM的活力都可以反應(yīng)機(jī)體的抗氧化水平及免疫健康狀態(tài)，本研究結(jié)果表明，在海棠灣海域養(yǎng)殖結(jié)束后的30 mm規(guī)格組稚貝的ACP、ALP和LZM的活力都顯著優(yōu)于20 mm規(guī)格組稚貝，這在一定程度上代表著30 mm規(guī)格組稚貝具有較強(qiáng)的抗氧化劑免疫性能，體質(zhì)情況相對(duì)較佳，因此可更有效地適應(yīng)和抵抗外界自然環(huán)境因素的變化，從而提高自身存活能力，這可能就是30 mm規(guī)格組稚貝在本試養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中存活率相對(duì)較高的原因之一。

腸道菌群由種類多樣和數(shù)量龐大的微生物所構(gòu)成，并通過(guò)各個(gè)種類的相互作用形成復(fù)雜的生態(tài)網(wǎng)絡(luò)，在宿主生長(zhǎng)、發(fā)育、免疫等諸多重要生命活動(dòng)環(huán)節(jié)中發(fā)揮著重要作用[21-22]。腸道菌群的結(jié)構(gòu)合理性及穩(wěn)定性對(duì)宿主的健康極其重要，不合適的環(huán)境、食物等因素都可能會(huì)導(dǎo)致腸道菌群的紊亂，從而影響宿主的生命質(zhì)量。腸道菌群的負(fù)向改變會(huì)損害宿主的免疫功能，從而使其患病風(fēng)險(xiǎn)提高，影響存活能力[23]。不同物種的腸道菌群組成結(jié)構(gòu)有所差異，且會(huì)受到養(yǎng)殖環(huán)境、餌料環(huán)境等因子的影響[13]。本研究結(jié)果表明，在海棠灣蜈支洲島海域養(yǎng)殖的大珠母貝稚貝腸道菌群結(jié)構(gòu)在門水平上其優(yōu)勢(shì)菌群是變形菌門(Proteobacteria)和浮霉菌門(Planctomycetes)，該結(jié)果與長(zhǎng)牡蠣(Crassostreagigas)的腸道菌群研究結(jié)果較為一致[24-25]。變形菌門是動(dòng)物所有生命階段中數(shù)量最大、表型最多樣化和最豐富的門[26-27]。本文進(jìn)一步在屬水平上對(duì)大珠母貝稚貝進(jìn)行腸道菌群結(jié)構(gòu)分析，其分析結(jié)果表明伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)和弧菌屬(Vibrio)是其核心優(yōu)勢(shì)菌群。弧菌屬中的弧菌是我們所認(rèn)知的條件致病菌，但在本研究過(guò)程中并未發(fā)現(xiàn)大珠母貝稚貝存在感染病害或發(fā)病的跡象，其原因可能是條件致病菌只有在滿足環(huán)境惡劣、宿主體質(zhì)及抵抗力較差的條件下才會(huì)發(fā)生致病現(xiàn)象，而本研究所在蜈支洲島海域環(huán)境良好、稚貝體質(zhì)較佳，且弧菌數(shù)量較低，因此在該環(huán)境中本實(shí)驗(yàn)試養(yǎng)的稚貝未發(fā)生致病現(xiàn)象。此外，相關(guān)研究表明病原微生物在水生動(dòng)物腸道中的存在可以看作是一種普遍現(xiàn)象，在宿主體內(nèi)主要是對(duì)代謝和免疫等生命過(guò)程起著或大或小的作用，而并不是致病的關(guān)鍵因素[28-30]。

綜上所述，殼長(zhǎng)30 mm規(guī)格的大珠母貝稚貝相對(duì)于20 mm規(guī)格稚貝而言，在海棠灣蜈支洲島試養(yǎng)海域的存活率較高，生長(zhǎng)性能較好，消化和免疫性能較佳，其后期養(yǎng)殖成功的可能性更大。本研究結(jié)果可為大珠母貝稚貝海上中間培育技術(shù)的優(yōu)化奠定基礎(chǔ)。