李雨霏，初海平，李 妍，王曉靜，牟艷玲*，孫 捷**

（1山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）藥學(xué)與制藥科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250014；2山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（山東省千佛山醫(yī)院）麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科，濟(jì)南 250014）

血管鈣化是一種類似于骨形成的過(guò)程，具有高度可調(diào)節(jié)性和主動(dòng)性［1］，其發(fā)生與高血糖、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等各種刺激因素下導(dǎo)致的血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的過(guò)程有關(guān)［2-4］，糖尿病患者中廣泛存在血管鈣化現(xiàn)象［5-6］。目前常用的他汀類藥物和二甲雙胍等［7-9］可以通過(guò)減少與鈣化相關(guān)的氧化應(yīng)激反應(yīng)和阻斷炎癥反應(yīng)的信號(hào)分子及通路來(lái)減少機(jī)體的血糖和血脂，從而延緩血管鈣化的進(jìn)展［10-12］。

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，與單一靶點(diǎn)藥物相比，多靶點(diǎn)的天然藥物在心血管的保護(hù)中具有不可替代的優(yōu)勢(shì)，尤其是香豆素類化合物具有良好的AGEs 生成抑制活性，異黃酮類化合物具有良好的抗氧化、抗炎活性，近年來(lái)備受關(guān)注［13-15］。若能設(shè)計(jì)一類藥物同時(shí)兼具兩類化合物的優(yōu)點(diǎn)，將會(huì)在血管保護(hù)領(lǐng)域邁出重要一步。前期本課題組利用孿藥的設(shè)計(jì)原理，將具有相關(guān)活性的香豆素與異黃酮類化合物重疊結(jié)合，設(shè)計(jì)了500多個(gè)芳基香豆素類化合物，通過(guò)體外篩選發(fā)現(xiàn)其中基于傘形花內(nèi)酯、大豆異黃酮設(shè)計(jì)的3-（4′-羥基苯基）-6-羥基香豆素（C15H10O4，代號(hào)SJ-6，相對(duì)分子質(zhì)量225.5）具有較好的體外降糖、清除氧自由基、抑制晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）生成活性，本研究進(jìn)一步對(duì)化合物SJ-6 的作用靶點(diǎn)及相關(guān)的藥理活性開展研究［16-17］，化合物SJ-6的合成路線見圖1。

Figure 1 Synthetic route of compound SJ-6

1 材 料

1.1 藥品與試劑

1.2 儀 器

3111 型CO2培養(yǎng)箱、Evolution 220 紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司）；Eclipse TE 2000-S熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）；Infinite M200 PRO 型酶標(biāo)儀（法國(guó)Tecan 公司）；CFX96 TOUCK 熒光定量PCR 儀、Trans-Blot SD 半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；Azure cSeries 200 型化學(xué)發(fā)光成像儀（美國(guó)Azure Biosystems公司）。

1.3 細(xì) 胞

人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（HCASMCs）由山東第一醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)與制藥科學(xué)學(xué)院藥理室提供。使用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2孵育。

2 方 法

2.1 人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞鈣化誘導(dǎo)

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第2~5代HCASMCs，按照每皿1×106個(gè)的密度接種于35 mm 培養(yǎng)皿中，5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)至80% ~ 90%細(xì)胞融合貼壁，加入含100 mg/L 晚期糖基化終產(chǎn)物-牛血清白蛋白（AGEs-BSA）的鈣化誘導(dǎo)液進(jìn)行培養(yǎng)，隔天換液，4 d 后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色并于顯微鏡下觀察，若視野中細(xì)胞出現(xiàn)密集鈣化斑時(shí)，視為造模成功。

2.2 茜素紅染色實(shí)驗(yàn)

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第2~5代HCASMCs，按照每皿1 × 106個(gè)的密度接種于35 mm 培養(yǎng)皿中，各組細(xì)胞誘導(dǎo)及藥物干預(yù)4 d，隔天換液，各組細(xì)胞培養(yǎng)完成后，吸棄培養(yǎng)基并用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗2 次，4%多聚甲醛固定15 min，去離子水洗滌3 次，加入0.2%茜素紅S 溶液（pH 8.3），室溫避光染色30 min，去離子水洗滌5 次，顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)染色情況并拍照。染色后進(jìn)行茜素紅定量，每孔加入十六烷基氯化吡啶200 μL，37 ℃孵育1 h，于562 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸收度，記錄并分析數(shù)據(jù)。

2.3 ALP酶活力測(cè)定

將細(xì)胞以每孔5.0×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于24 孔板，參考并依據(jù)本課題組已進(jìn)行的體外活性篩選的最佳濃度，分別設(shè)置正常對(duì)照組（HCASMCs正常培養(yǎng)）、溶媒對(duì)照組（HCASMCs + 0.5%DMSO）、鈣化誘導(dǎo)組（HCASMCs+100 mg/L AGEs-BSA）、陰性對(duì)照組（HCASMCs + 100 mg/L AGEs-BSA + 0.5%DMSO）、陽(yáng)性對(duì)照氨基胍鹽酸鹽（AGH）組（HCASMCs+100mg/LAGEs-BSA+0.5%DMSO+5.7×10-2mmol/L AGH）、SJ-6 處理組（HCASMCs+100 mg/L AGEs-BSA+0.5%DMSO+0.025 mmol/L SJ-6）、SJ-6 處理組（HCASMCs + 100 mg/L AGEs-BSA+0.5%DMSO+0.012mmol/L SJ-6）、SJ-6 處理組（HCASMCs+100 mg/L AGEs-BSA+0.5%DMSO+0.006mmol/L SJ-6），誘導(dǎo)及藥物干預(yù)4 d，隔天換液，各組細(xì)胞培養(yǎng)完成后，按照堿性磷酸酶活力測(cè)定試劑盒說(shuō)明進(jìn)行裂解和加樣，測(cè)定各組在405 nm 處的吸收度，根據(jù)各組吸收度計(jì)算各組ALP活性。

2.4 細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第2~5代HCASMCs，按照每皿1×106個(gè)的密度接種于35 mm培養(yǎng)皿中，各組細(xì)胞誘導(dǎo)及藥物干預(yù)4 d，隔天換液，培養(yǎng)完成后，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，以每孔5.0×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板，培養(yǎng)貼壁后，將各組培養(yǎng)液更換為不含血清的DMEM 培養(yǎng)液以使細(xì)胞同步化，分組及處理同每組做6 個(gè)孔，重復(fù)3 次。采用MTT法測(cè)定各組細(xì)胞增殖情況。每孔加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL，37 ℃孵育4 h。小心吸出培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL 溶解結(jié)晶，振蕩混勻后于波長(zhǎng)490 nm下測(cè)定各孔吸收度。

在一列快速行進(jìn)的地鐵車廂里，某人客氣地彎腰對(duì)身旁的一位女士說(shuō)：“車廂真暗，請(qǐng)?jiān)试S我為你找扶手吊帶吧。”

2.5 AGEs含量測(cè)定

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第2~5代HCASMCs，按照每皿1 × 106個(gè)的密度接種于35 mm 培養(yǎng)皿中，各組細(xì)胞誘導(dǎo)及藥物干預(yù)4 d，隔天換液，各組細(xì)胞誘導(dǎo)完成后，按照ELISA 試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，向預(yù)先包被了抗體的酶標(biāo)孔中加入樣本，再加入生物素標(biāo)記的識(shí)別抗原，在37 ℃下孵育30 min，兩者與固相抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合形成免疫復(fù)合物，經(jīng)PBS 洗滌后加入親和素-HRP，在37 ℃下孵育30 min，親和素-HRP 與生物素抗原相結(jié)合，洗滌后加入反應(yīng)終止液，于波長(zhǎng)450 nm下檢測(cè)各孔吸收度。

2.6 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度測(cè)定

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第2~5代HCASMCs，按照每皿1 × 106個(gè)的密度接種于35 mm 培養(yǎng)皿中，各組細(xì)胞誘導(dǎo)及藥物干預(yù)4 d，隔天換液，各組細(xì)胞培養(yǎng)完成后，取適當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行勻漿，低速離心取上清液，鄰甲酚酞絡(luò)合銅法測(cè)定各組細(xì)胞鈣含量。

2.7 細(xì)胞內(nèi)總活性氧含量測(cè)定

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第2~5代HCASMCs，按照每皿1 × 106個(gè)的密度接種于35 mm 培養(yǎng)皿中，各組細(xì)胞誘導(dǎo)及藥物干預(yù)4 d，隔天換液，各組細(xì)胞培養(yǎng)完成后，采用活性氧檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總活性氧（ROS）含量，去除培養(yǎng)液，用PBS 溶液洗細(xì)胞后加入熒光染料DCFH-DA，孵育20 min，然后用PBS 清洗細(xì)胞，熒光顯微鏡下進(jìn)行拍攝。使用IPP5.0進(jìn)行熒光面積分析。

2.8 超氧化物歧化酶含量測(cè)定

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第2~5 代HCASMCs，按照每皿1 × 106個(gè)的密度接種于35 mm 培養(yǎng)皿中，各組細(xì)胞誘導(dǎo)及藥物干預(yù)4 d，隔天換液，各組細(xì)胞培養(yǎng)完成后，收集細(xì)胞至離心管，超聲破碎并離心，按照超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定試劑盒（黃嘌呤氧化酶法）檢測(cè)各組細(xì)胞SOD的含量。

2.9 炎癥因子表達(dá)量測(cè)定

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第2~5 代HCASMCs，按照每皿1 × 106個(gè)的密度接種于35 mm 培養(yǎng)皿中，各組細(xì)胞誘導(dǎo)及藥物干預(yù)4 d，隔天換液，各組細(xì)胞誘導(dǎo)完成后，按照ELISA 試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，向預(yù)先包被了抗體的酶標(biāo)孔中加入樣本，再加入生物素標(biāo)記的識(shí)別抗原，在37 ℃下孵育30 min，兩者與固相抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合形成免疫復(fù)合物，經(jīng)PBS 洗滌后加入親和素-HRP，在37 ℃下孵育30 min，親和素-HRP 與生物素抗原相結(jié)合，洗滌后加入反應(yīng)終止液，于波長(zhǎng)450 nm下檢測(cè)各孔吸收度。

2.10 Runx2 mRNA的表達(dá)量測(cè)定

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第2~5 代HCASMCs，按照每皿1 × 106個(gè)的密度接種于35 mm 培養(yǎng)皿中，各組細(xì)胞誘導(dǎo)及藥物干預(yù)4 d，隔天換液，各組細(xì)胞誘導(dǎo)完成后，提取各組細(xì)胞總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA），并以cDNA 為模板行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)步驟：預(yù)熱：95 ℃（30 s），1 個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增：95 ℃（10 s），60 ℃（20 s），40個(gè)循環(huán)；熔解：95 ℃（15 s），60 ℃（60 s），95 ℃（60 s），1個(gè)循環(huán)；冷卻：40 ℃（60 s）1 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 作為內(nèi)參，計(jì)算各組別成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 mRNA（Runx2 mRNA）表達(dá)的倍比關(guān)系即為各組別Runx2 m RNA相對(duì)表達(dá)量。

2.11 RAGE、NF-κB、NOX-1、PKC、Akt、p38、SMAα蛋白表達(dá)量測(cè)定

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第2~5 代HCASMCs，按照每皿1×106個(gè)的密度接種于35 mm培養(yǎng)皿中，各組細(xì)胞誘導(dǎo)及藥物干預(yù)4 d，隔天換液，各組細(xì)胞誘導(dǎo)完成后，用預(yù)冷的PBS沖洗2遍，參照總蛋白提取試劑盒的操作說(shuō)明，刮取細(xì)胞并提取總蛋白，取上清液后采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量。取蛋白20 μg 進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入兔抗人晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）抗體（1∶1 000）、兔抗人蛋白激酶C（PKC）抗體（1∶1 000），兔抗人核因子κB（NF-κB）抗體（1∶1 000）、兔抗人蛋白激酶B（AKT）抗體（1∶1 000）、兔抗人NADPH 氧化酶-1（NADPH oxidase-1，NOX-1）抗體（1∶1 000）、兔抗人p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）抗體（1∶1 000）、兔抗人α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（SMA-α）抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗Ig G（1∶10 000），室溫孵育1 h，ECL 試劑盒顯影，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，以對(duì)照組為參照樣本，計(jì)算各組目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有的數(shù)據(jù)結(jié)果均按照平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析及t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異的比較。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組指標(biāo)的組間差異；采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）比較各項(xiàng)指標(biāo)的組間差異，用P＜0.05 來(lái)表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 不同濃度SJ-6對(duì)細(xì)胞存活率的影響

MTT 測(cè)定的結(jié)果表明，AGEs 和化合物SJ-6 均對(duì)細(xì)胞存活沒(méi)有顯著影響（P＞0.05）（圖2）。這些結(jié)果表明該化合物對(duì)細(xì)胞無(wú)毒。

Figure 2 Effects of different concentrations of compound SJ-6 on cell viability(± s,n = 3)

3.2 茜素紅染色的平滑肌細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)

AGEs 能促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的鈣化［18］。根據(jù)顯微鏡拍攝的照片和茜素紅的定量結(jié)果，與對(duì)照組相比，AGEs 組與AGEs+DMSO 組細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外鈣結(jié)節(jié)數(shù)量明顯增多。相比于AGEs組與AG?Es+DMSO 組，不同濃度化合物SJ-6 處理組，隨化合物濃度增加，鈣結(jié)節(jié)數(shù)量及區(qū)域面積逐漸減少，呈濃度依賴性（圖3）。

Figure 3 Calcified nodules of smooth muscle cells stained with alizarin red

3.3 化合物SJ-6對(duì)平滑肌細(xì)胞ALP活力的影響

研究表明，ALP 與主動(dòng)脈鈣化密切相關(guān)［19-20］，是評(píng)估血管鈣化和骨質(zhì)疏松癥的可靠指標(biāo)。通過(guò)測(cè)量各個(gè)組別中的ALP 活性，發(fā)現(xiàn)各個(gè)濃度梯度的SJ-6 均可顯著抑制鈣化的血管平滑肌細(xì)胞中的ALP 的增加（P ＜0.01）（表1），推測(cè)化合物SJ-6 對(duì)主動(dòng)脈鈣化可能具有良好的抑制作用。

3.4 不同濃度SJ-6對(duì)AGEs含量的影響

與對(duì)照組相比，AGEs 組的細(xì)胞內(nèi)AGEs 含量顯著增加（P ＜0.01）（圖4）。隨著濃度的增加，化合物SJ-6 逐漸降低細(xì)胞中的AGEs（P ＜0.01）。推測(cè)這些化合物可能能夠直接裂解AGEs 或加速AGEs的自然分解。

3.5 不同濃度SJ-6對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣含量的影響

相比對(duì)照組，AGEs 組細(xì)胞內(nèi)鈣含量明顯增加（P ＜0.01），說(shuō)明AGEs 可以誘導(dǎo)HCASMCs 鈣化。與AGEs 組相比，不同濃度的SJ-6 干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)鈣含量明顯降低（P ＜0.01），在不同濃度組之間，隨著化合物的濃度增加，細(xì)胞內(nèi)鈣含量逐漸下降，說(shuō)明化合物SJ-6 可以抑制AGEs 誘導(dǎo)的HCASMCs 鈣化，且細(xì)胞內(nèi)鈣含量減少與化合物SJ-6 呈濃度依賴性（圖5）。研究證明胞內(nèi)鈣含量以及ALP 活性均與HCASMCs 鈣化呈正相關(guān)，因此再次間接證明化合物SJ-6 可抑制AGEs 誘導(dǎo)的血管鈣化。

Table 1 Effects of compound SJ-6 on alkaline phosphatase (ALP)activity(± s,n = 3)

Table 1 Effects of compound SJ-6 on alkaline phosphatase (ALP)activity(± s,n = 3)

ΔΔP ＜0.01 vs normal group; **P ＜0.01 vs AGEs group

Group Normal DMSO AGEs AGEs+DMSO AGH 0.025 mmol/L SJ-6 0.012 mmol/L SJ-6 0.006 mmol/L SJ-6 ALP activity/(U/mg)0.117±0.003 0.116±0.003 0.245±0.003ΔΔ 0.241±0.002ΔΔ 0.183±0.003**0.180±0.004**0.187±0.005**0.208±0.003**

Figure 4 Effects of different concentrations of compound SJ-6 on AGEs content(± s,n = 3)

3.6 不同濃度SJ-6 對(duì)各組細(xì)胞ROS 熒光強(qiáng)度表達(dá)的影響

氧化應(yīng)激可以誘發(fā)心血管疾?。?1-22］。與對(duì)照組相比，AGEs 組細(xì)胞綠色熒光面積明顯增大（P＜0.01），且熒光強(qiáng)度更加聚集。與AGEs 組對(duì)比，加入不同濃度化合SJ-6 組綠色熒光面積明顯減少（P ＜0.01），且隨濃度增加而面積逐漸減少，說(shuō)明AGEs 可誘導(dǎo)HCASMCs 發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，但化合物SJ-6 抑制這一效應(yīng)，對(duì)HCASMCs 起到保護(hù)作用（圖6）。

Figure 5 Effects of different concentrations of SJ-6 on intracellular calcium content(± s,n = 3)

Figure 6 Effects of compound SJ-6 on ROS.The induction of AGEs increases the ROS content in vascular smooth muscle cells, and each compound group can reduce the ROS content

3.7 不同濃度SJ-6對(duì)SOD表達(dá)量的影響

與對(duì)照組相比，AGEs 組細(xì)胞的抗氧化指標(biāo)SOD 的活性顯著降低（P ＜0.01）。相比AGEs 組不同濃度化合物SJ-6干擾組細(xì)胞內(nèi)SOD 的活性明顯升高（P ＜0.01），且不同濃度組之間，SOD 的活性隨化合物濃度增加而逐漸升高，說(shuō)明化合物SJ-6可以增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力，且抗氧能力的增強(qiáng)與化合物SJ-6呈濃度依賴性（圖7）。

3.8 不同濃度SJ-6對(duì)炎癥因子TNF-α、1L-6、1L-β表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，AGEs 組細(xì)胞的炎性細(xì)胞因子TNF-α，1L-6 和1L-β 顯著增加（P＜0.01），表明AGEs 可以誘導(dǎo)HCASMCs 發(fā)生炎癥反應(yīng)。相比AGEs 組不同濃度SJ-6 干擾組細(xì)胞內(nèi)炎癥因子TNF-α、1L-6、1L-β 的表達(dá)明顯降低（P ＜0.01），且不同濃度組之間，炎癥因子表達(dá)量隨化合物濃度增加而逐漸下降，說(shuō)明化合物SJ-6 可以抑制AGEs誘導(dǎo)的HCASMCs 的炎癥反應(yīng)，且炎癥因子表達(dá)量的減少與化合物SJ-6呈濃度依賴性（圖8）。

Figure 7 Effect of different concentrations of compound SJ-6 on SOD expression(± s,n = 3)

Figure 8 Influence of different concentrations of compound SJ-6 on the expression of inflammatory factors TNF-α(A),1L-6(B),1L-β(C).The induc?tion of AGEs increased the content of TNF-α,1L-6,1L-β(± s,n = 3)

3.9 不同濃度SJ-6 對(duì)Runx 2 mRNA 表達(dá)量的影響

Runx2 mRNA 是正常骨骼形成所必需的，AG?Es 顯著增加了Runx2 mRNA（P ＜0.01），表明AG?Es可以誘導(dǎo)HCASMCs 的成骨轉(zhuǎn)化。與AGEs 組相比，化合物SJ-6 的濃度升高時(shí)，細(xì)胞中Runx2 mRNA 的表達(dá)逐漸降低（P ＜0.01），提示化合物SJ-6 可以抑制AGEs 誘導(dǎo)的HCASMCs 的成骨轉(zhuǎn)化且Runx 2 mRNA 表達(dá)量的減少與化合物SJ-6呈濃度依賴性（圖9）。

3.10 不同濃度SJ-6 對(duì)AGEs 誘導(dǎo)的RAGE，SMAα，NF-κB，p38，Akt，PKC，NOX-1蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，AGEs 組RAGE，NF-κB，pp38，Akt，PKC，NOX-1 蛋白 達(dá) 量明 顯增高（P ＜0.01），平滑肌動(dòng)蛋白SMA-α 的蛋白表達(dá)量明顯降低（P ＜0.01），與AGEs組相比，化合物SJ-6處理組中RAGE，NF-κB，p-p38，Akt，PKC，NOX-1 蛋白達(dá)量表達(dá)量明顯降低（P ＜0.01），SMA-α 的蛋白表達(dá)量明顯增多（P ＜0.01），且表達(dá)量隨化合物濃度增加而逐漸降低，說(shuō)明化合物SJ-6可以抑制AGEs誘導(dǎo)的HCASMCs 向成骨細(xì)胞分化的相關(guān)通路，且這種抑制具有濃度依賴性（圖10）。

Figure 9 Effect of different concentrations of compound SJ-6 on the expression of Runx2 mRNA (± s,n = 3).The induction of AGEs increased the Runx2 mRNA content of the osteogenic transcription factor in vascular smooth muscle cells,and each compound group could reduce the Runx2 mRNA content

4 討 論

血管鈣化是糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、慢性腎臟病等多種疾病的共同病理表現(xiàn)，而目前血管鈣化的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚［23］。目前尚無(wú)直接逆轉(zhuǎn)血管鈣化的手段，但多種干預(yù)措施可用于減慢或延緩血管鈣化的進(jìn)展，例如控制高血糖等傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素、阻斷AGEs 生成、抑制AGEs/RAGE的相互作用、降低氧化應(yīng)激等，但這些干預(yù)措施存在作用靶點(diǎn)單一、副作用大、治療效果差等缺點(diǎn)，所以治療血管鈣化仍是目前研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。本研究首次發(fā)現(xiàn)多靶點(diǎn)化合物SJ-6 能直接對(duì)抗鈣化對(duì)平滑肌細(xì)胞的損害，這對(duì)于血管鈣化發(fā)病機(jī)制的深入理解和防治靶點(diǎn)的開發(fā)具有重要意義。

Figure 10 Effects of compound SJ-6 at different concentrations on RAGE, SMA-α, NF-κB, p38, Akt, PKC, NOX-1 protein expression induced by AGEs(± s,n = 3)

化合物SJ-6 在不影響細(xì)胞的正常增殖的情況下呈劑量依賴性地降低血管平滑肌細(xì)胞的鈣化程度，包括促進(jìn)AGEs 的裂解、降低胞內(nèi)的鈣離子濃度、減弱ALP 酶活力、抑制成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子以及相關(guān)信號(hào)蛋白的表達(dá)并增強(qiáng)平滑肌動(dòng)蛋白的表達(dá)，同時(shí)伴隨著氧化應(yīng)激以及部分炎癥反應(yīng)的減弱和抗氧化能力的增強(qiáng)。因此推測(cè)化合物SJ-6 對(duì)于鈣化的保護(hù)作用機(jī)制可能與其抗氧化特性以及對(duì)AGEs/RAGE通路的抑制有關(guān)。

化合物SJ-6 降低了ROS、OX-1、NF-κB、p38、Akt、PKC 蛋白和炎癥因子TNF-α、1L-6、1L-β 的總量，同時(shí)增加了細(xì)胞內(nèi)SOD 的含量，推測(cè)該化合物可抑制氧化應(yīng)激過(guò)程，從而抑制NF-κB和PKC信號(hào)通路并減少β細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，最終減輕鈣化過(guò)程。

AGEs 的刺激增加了RAGE 的表達(dá)，并且AGEs/RAGE 途徑與血管鈣化密切相關(guān)［24-26］。隨著化合物SJ-6 濃度的增加，AGEs 和RAGE 的表達(dá)均受到明顯抑制，推測(cè)化合物SJ-6 可能促進(jìn)AGEs的裂解，進(jìn)而下調(diào)RAGE受體的表達(dá)并抑制下游信號(hào)通路和多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，包括NF-κB，p38，Akt，PKC，ROS，NOX-1 等，抑制了Runx2 mRNA 的表達(dá)并刺激SMA-α的表達(dá)，最終減少AGEs誘導(dǎo)的HCASMCs向成骨細(xì)胞的分化。

氨基胍同樣能夠緩解鈣化對(duì)平滑肌細(xì)胞的損害，氨基胍的保護(hù)作用與0.012mmol/L 的化合物SJ-6 的保護(hù)作用相似，而0.025mmol/L 的化合物SJ-6 的延緩鈣化效果更好?；衔颯J-6 對(duì)于更多其他相關(guān)的信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響以及其是否可以有效抑制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血管鈣化，有待進(jìn)一步探索?？傊?-芳基香豆素衍生物SJ-6 的抑制血管鈣化作用使其成為潛在的候選藥物，并有望開發(fā)成為治療血管鈣化的新藥。