姚侃男 盛曉理 姚定國(guó)

2009年6月《Diabetologia》報(bào)道了4項(xiàng)糖尿病的流行病學(xué)研究，強(qiáng)調(diào)了甘精胰島素增加癌癥風(fēng)險(xiǎn)率的潛在聯(lián)系。胰島素及胰島素類(lèi)似物是治療糖尿病的重要手段，與胰島素受體和胰島素樣生長(zhǎng)因子1類(lèi)受體相結(jié)合，通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮作用，涉及多條通路。胰島素和胰島素樣生長(zhǎng)因子I（insulin-like growth factor-I，IGF1）屬肽類(lèi)家族激素，既可與胰島素受體結(jié)合，又能交叉結(jié)合于IGF1R，激活磷脂酰肌醇 3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB）（又稱(chēng) Akt）通路和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）信號(hào)通路，促使細(xì)胞增殖、抗細(xì)胞凋亡［1-2］。Akt信號(hào)通路與多種癌細(xì)胞增殖等均有相關(guān)性［3-5］。IGF1R屬于酪氨酸激酶受體家族，不僅廣泛分布在正常組織細(xì)胞表面，在腫瘤細(xì)胞表面也存在高表達(dá)，是某些類(lèi)型細(xì)胞轉(zhuǎn)化表型形成的前提，也是腫瘤發(fā)展、侵襲的必要條件［6-8］。本實(shí)驗(yàn)旨在探索比較胰島素及其類(lèi)似物對(duì)PTC-1s細(xì)胞增殖作用的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 （1）細(xì)胞株：甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞（papillary thyroid carcinoma-1 cells，PTC-1s），由比利時(shí)Institute of Interdisciplinary Research 提供。（2）藥品與試劑：RPMI Medium 1640、胎牛血清，購(gòu)自美國(guó) Gibco公司。生物合成人胰島素注射液（諾和靈R），購(gòu)自諾和諾德（中國(guó)）制藥有限公司。甘精胰島素注射液（來(lái)得時(shí)），購(gòu)自賽諾菲（北京）制藥有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟 （1）PTC-1s細(xì)胞培養(yǎng)：將胎牛血清10 mL加入到90 mLRPMI Medium 1640中，混勻配置成100 mL細(xì)胞完全培養(yǎng)液。以胎牛血清：DMSO=9∶1配置細(xì)胞凍存液，現(xiàn)配現(xiàn)用。PTC-1s細(xì)胞培養(yǎng)于含5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。①細(xì)胞換液：換液前，將細(xì)胞完全培養(yǎng)液置于室溫環(huán)境中預(yù)溫30 min，之后使用1 mL移液槍吸棄舊培養(yǎng)基，使用2 mL PBS沖洗1遍后加入新鮮細(xì)胞完全培養(yǎng)液，每2 d換液1次。②細(xì)胞傳代：待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合后，吸棄舊培養(yǎng)液，加入2 mL PBS沖洗1次后，加入1 mL含0.02%EDTA的胰酶，置于37 ℃培養(yǎng)箱中消化1 min，待倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓或細(xì)胞間隙變大，加入含10%胎牛血清的RPMI Medium 1640培養(yǎng)液2 mL中止消化，使用1 mL移液槍輕柔吹打混勻，于25 ℃環(huán)境中使用離心機(jī)以800 r/min離心5 min，棄上清，加入恢復(fù)室溫的新鮮細(xì)胞完全培養(yǎng)液重新懸浮，分裝入新的干凈培養(yǎng)瓶中，一般按照1∶2或1∶3的比例進(jìn)行傳代。③細(xì)胞凍存：將離心生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞加入1 mL細(xì)胞凍存液，使用移液器輕柔吹打，均勻后置于1.8 mL細(xì)胞凍存管中，每2小瓶?jī)鲆还?，封口膜封好管口，?biāo)記后置于細(xì)胞程序性降溫盒中，迅速放置-80 ℃冰箱降溫冷凍后，轉(zhuǎn)存于液氮罐中以備用。④細(xì)胞復(fù)蘇：將凍存于液氮罐中的細(xì)胞取出，迅速放入37 ℃電熱恒溫水槽中，不斷晃動(dòng)凍存管，于1 min內(nèi)將細(xì)胞解凍，使用移液器將凍存管中的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，于25 ℃環(huán)境中以800 r/min離心5 min，棄上清，加入恢復(fù)室溫的新鮮完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，分裝入新的干凈培養(yǎng)瓶中。輕輕晃勻細(xì)胞后置于含 5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。（2）建立IGF1R低表達(dá)PTC-1s細(xì)胞組模型。①構(gòu)建針對(duì)人IGF1R基因的RNA干擾慢病毒載體：病毒LV-IGF1RRNAi（44818-1）由上海吉?jiǎng)P構(gòu)建，設(shè)計(jì)SiRNA靶點(diǎn)，合成單鏈DNA oligo，退火后形成雙鏈DNA，通過(guò)T4 DNA連接酶，連接慢病毒載體，取產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，PCR鑒定實(shí)驗(yàn)后，送測(cè)序驗(yàn)證，質(zhì)粒抽提。②病毒包裝：慢病毒包裝由上海吉?jiǎng)P完成，其提供對(duì)應(yīng)的病毒上清。慢病毒載體系統(tǒng)由三質(zhì)粒組成，分別是pGC-LV載體、pHelper 1.0載體和pHelper 2.0載體。pGC-LV載體中含有HIV的基本元件5'LTR和3'LTR，帶有GFP標(biāo)記，用于RNA干擾。pHelper 1.0載體中包含HIV病毒的gag基因，其作用主要是編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白；pol基因，編碼病毒特異性的酶；rev基因是調(diào)節(jié)gag和pol基因表達(dá)。pHelper2.0載體中存在單純皰疹病毒來(lái)源的VSV-G 基因，編碼病毒包裝所需的包膜蛋白。三種質(zhì)粒載體分別進(jìn)行高純度無(wú)內(nèi)毒素抽提，均轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染8 h，更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，對(duì)其濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液。③病毒滴度測(cè)定：將293T細(xì)胞鋪板于96孔板，每個(gè)孔加4×104個(gè)細(xì)胞，加液量100 μL，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。在10個(gè)無(wú)菌的Ep管中分別加入90 μL的無(wú)血清培養(yǎng)基。取待測(cè)定的病毒原液10 μL加入到第1個(gè)管中，混勻后取10 μL加入到第2個(gè)管中，繼續(xù)相同的操作直到最后1管。選取所需的細(xì)胞孔，吸去90 μL培養(yǎng)基，丟棄，加入90 μL稀釋好的病毒溶液，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，加入完全培養(yǎng)基100 μL，4 d后觀察熒光表達(dá)情況，病毒的滴度等于帶有熒光的細(xì)胞數(shù)除以病毒原液量。④慢病毒感染：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PTC-1s細(xì)胞，胰酶消化后，完全培養(yǎng)基制成約3×104個(gè)/mL細(xì)胞懸液，接種到6孔培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度20%/孔，按MOI=10（滴度為1×108 TU /mL的病毒，加入1 μL病毒液）加入病毒，在含5μg /mL Polybrene的ENi.S中感染病毒，感染后16 h左右更換為常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，感染后72 h左右，熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá)情況，取感染效率＞80%者進(jìn)入下游實(shí)驗(yàn)。⑤逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)IGF1R基因敲減效率：收集部分感染細(xì)胞，未處理細(xì)胞作對(duì)照組，Trizol法提取各組細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用Oligo dT合成第一鏈，在20μL反應(yīng)體系中加入2 μg總cDNA。引物序列：上游為T(mén)GCGTGAGAGGATTGAGTTTC，下游為CTTATTGGCGTTGAGGTATGC，擴(kuò)增產(chǎn)物為269（bp）。內(nèi)參照GAPDH上游為T(mén)GACTTCAACAGCGACACCCA'，下游為CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA。退火溫度均為55 ℃。在同一條件下，每次PCR以GAPDH為內(nèi)參照。表達(dá)豐度以相對(duì)NC組樣品目的基因的相對(duì)表達(dá)水平表示。（3）建立IGF1R正常表達(dá)PTC-1s細(xì)胞組模型：①構(gòu)建RNAi 陰性對(duì)照慢病毒載體：RNAi 陰性對(duì)照慢病毒（LV-NC-GFP）載體由上海吉?jiǎng)P構(gòu)建?；蛐畔ⅲ篠cramble 序列，核心系列：TTCTCCGAACGTGTCACG。②病毒包裝：同建立IGF1R低表達(dá)PTC-1s細(xì)胞組模型。③病毒滴度測(cè)定：同建立IGF1R低表達(dá)PTC-1s細(xì)胞組模型。④慢病毒感染：同建立IGF1R低表達(dá)PTC-1 s細(xì)胞組模型。⑤逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)IGF1R基因表達(dá)：同建立IGF1R低表達(dá)PTC-1s細(xì)胞組模型。（4）藥物配置及分組干預(yù)：①細(xì)胞分組：兩類(lèi)細(xì)胞各分為三組。IGF1R正常表達(dá)PTC-1s組細(xì)胞（NC）分為空白對(duì)照組（NC-CON）、人胰島素組（NCHI）和甘精胰島素組（NC-IG）；IGF1R低表達(dá)PTC-1s組（RNAI）分為空白對(duì)照組（RNAI-CON）、人胰島素組（RNAI-HI）和甘精胰島素組（RNAI-IG）。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將藥物干預(yù)濃度設(shè)置10 IU/L。②藥物濃度配置：干預(yù)藥物分別用細(xì)胞完全培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋?zhuān)? mL細(xì)胞完全培養(yǎng)液中加入5 μL原始濃度藥物，得到100 IU/L的人胰島素或甘精胰島素，混勻后取上述濃度藥物0.5 mL加入5 mL細(xì)胞完全培養(yǎng)液中，得到10 IU/L的終濃度藥物。（5）細(xì)胞增殖能力檢測(cè)：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加胰酶消化離心，用細(xì)胞完全培養(yǎng)液進(jìn)行重懸，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為 2.5×104/mL，取200 μL細(xì)胞懸液接種于96孔板中；將3組細(xì)胞隨機(jī)分別放入孔板中，每組4復(fù)孔；將含細(xì)胞的96 孔板置于細(xì)胞板振蕩器上快速振蕩10 s，倒置顯微鏡下觀察每個(gè)孔細(xì)胞單個(gè)分布均勻后，靜置于含5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，用200 μL移液槍吸棄舊培養(yǎng)液?？瞻讓?duì)照組加入200 μL細(xì)胞完全培養(yǎng)液，人胰島素組和甘精胰島素組分別加入200 μL稀釋至10 μL/L的胰島素。每塊細(xì)胞板置于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)18、24、36、48、72 h后，每孔加10 μL CCK8試劑，于培養(yǎng)箱中孵育60 min。最后，將96孔板置于酶標(biāo)儀中，通過(guò)測(cè)波長(zhǎng)450 nm 光密度（optical density，OD）可檢測(cè)活性細(xì)胞。（6）細(xì)胞蛋白質(zhì)提?。喝∩L(zhǎng)對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，根據(jù)前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取72 h干預(yù)時(shí)間的細(xì)胞，用細(xì)胞刮鏟刮盡培養(yǎng)瓶底部的細(xì)胞，用移液器將刮離的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至 1.5 mL EP管中，預(yù)冷PBS洗3遍，4 ℃離心機(jī)離心收集細(xì)胞；每2×106個(gè)細(xì)胞加入50 μL 細(xì)胞裂解液，移液槍吹打混勻后，置于冰上裂解 30 min，每隔10 min于振蕩器上高速振蕩1次，裂解完畢，于4 ℃離心機(jī)中以 13,300 r/min離心15 min沉淀細(xì)胞碎片，用100 μL移液槍吸取上層無(wú)色透明上清液，即為所需的細(xì)胞總蛋白，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?）蛋白濃度測(cè)定：采用BCA法。①配制工作溶液：將BCA試劑、Cu試劑以50∶1體積混合，配制WR工作試劑，室溫下呈嫩綠色。②標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液配制：4,000 μg/mL BSA原液用雙蒸水進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?0 μL BSA原液中加入30 μL雙蒸水，得到50 μL的1,600μg /mL BSA標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，從中取25 μL連續(xù)倍比稀釋?zhuān)玫?,600、800、400、200、100、50、25μg /mL BSA 標(biāo)準(zhǔn)溶液各25 μL。③蛋白測(cè)定：將上述25 μL的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液和每組25 μL蛋白待測(cè)品分別與 200 μL WR工作試劑混合，得到225 μL最終反應(yīng)液。37 ℃溫育30 min，測(cè)定562 nm OD值。（8）免疫沉淀：根據(jù)上述蛋白濃度，吸取部分體積蛋白，用預(yù)冷的RIPA裂解液（弱）將蛋白稀釋至1 μg/ μL，每管1,000 μL，把混合液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管中；再以體積比1∶100加入IGF-1 Receptorβ抗體，做好標(biāo)記，封口膜封好EP管管口，搖床上緩慢搖晃過(guò)夜。準(zhǔn)備 Protein G Agarose珠子，于離心機(jī)中以14,000 r/min瞬時(shí)離心10 s，用RIPA裂解液（弱）洗滌2次，并用裂解液將珠子調(diào)成50%的體積濃度，過(guò)程中減掉槍頭槍尖部分，避免珠子沾壁以及破壞瓊脂糖珠；每1 mg蛋白抗體混合液中加入20 μL洗滌后的Protein G 瓊脂糖珠懸浮液，4 ℃，搖床上慢搖2 h；14,000 r/min瞬時(shí)離心10 s，收集沉淀瓊脂糖珠-抗體-蛋白復(fù)合物，用預(yù)冷的PBS洗3次；加入60 μL的2×Laemmli 上樣緩沖液，沸水煮5 min；離心收集上清液，即蛋白樣品，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩＃?）Western Blot分析目的蛋白水平：①試劑配置：5% BSA封閉液，SDS-PAGE電泳凝膠。②SDS-PAGE電泳：取細(xì)胞蛋白樣本與3×Red Loading Buffer 混合，100 ℃煮沸5 min后迅速置冰上；根據(jù)所測(cè)蛋白樣品濃度，計(jì)算含40 μg蛋白的溶液體積為上樣體積（根據(jù)條帶清晰度可適當(dāng)上調(diào)或下調(diào)上樣量，控制在30～50μg）；將玻璃板和膠一起放入電泳槽，電泳槽中由內(nèi)到外倒入足夠電泳液，兩手分別捏住梳子的兩端，豎直向上將其輕輕拔出，用10 μL移液槍吸取蛋白樣品或Marker，槍頭插至加樣孔中，垂直緩慢加入樣品，待樣品完全沉入加樣孔底部后再緩慢撤出移液槍?zhuān)B接電泳儀和電泳槽，注意正負(fù)極打開(kāi)電源；電泳時(shí)，濃縮膠電壓設(shè)置為60 V，分離膠90 V，時(shí)間約2 h，待酚紅進(jìn)入分離膠的底部時(shí)，關(guān)閉電源。③轉(zhuǎn)膜：在通風(fēng)柜內(nèi)，將剪好的PVDF膜（4 cm×7 cm）置于甲醇中浸泡處理10 min，再于轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡10～15 min以去除過(guò)多的甲醇；加適量轉(zhuǎn)移緩沖液于操作盤(pán)中，并放入轉(zhuǎn)膜夾、海綿墊、玻棒、濾紙和上述的PVDF膜；將轉(zhuǎn)膜夾打開(kāi)使黑面水平置于最底層，上面依次墊一張海綿墊濾紙，浸泡于轉(zhuǎn)膜液中，用玻棒搟去氣泡，輕柔撬開(kāi)玻璃板后，刮去濃縮膠，剝下分離膠，置于轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡數(shù)分鐘，分解分離膠中的SDS；將膠蓋于濾紙上，與濾紙對(duì)齊，用玻棒搟去氣泡，使用PVDF 膜蓋于膠上并除去氣泡，在膜上蓋濾紙并除去氣泡；最后，蓋上另一海綿墊后，合緊夾子，避免膜和膠之間產(chǎn)生氣泡，將夾子放入轉(zhuǎn)膜槽中，槽中繼續(xù)加滿(mǎn)轉(zhuǎn)移緩沖液，將轉(zhuǎn)膜槽置于冰塊中，250 mA轉(zhuǎn)膜2 h。④免疫反應(yīng)：轉(zhuǎn)膜后的膜用TBST漂洗2次，然后轉(zhuǎn)移至含有封閉液的封閉盒中；室溫下脫色搖床上慢搖2 h；用封閉液稀釋一抗，稀釋倍數(shù)為：β-actin Rabbit mAb（1∶1,000）、p-Akt Antibody（1∶1,000）、Phospho-p-Akt（Ser473）Antibody（1∶1,000）、p44/42、MAPK（p-Erk1/21/2）Antibody（1∶1,000）、Phosphop44/42MAPK（p-Erk1/21/2）（thr202/Tyr204）Antibody（1∶1,000）、IGF-1 Receptor βAntibody（1∶1,000）；從封閉液中取出膜，將膜正面朝向管腔卷曲置入15 mL離心管中，與一抗稀釋液充分接觸，4 ℃層析柜中慢搖過(guò)夜；室溫條件下用TBST液在脫色搖床上洗3次，10 min/次，去除膜上殘留的未結(jié)合一抗；同上述方法準(zhǔn)備二抗稀釋液（稀釋倍數(shù)為 1∶5,000），二抗與膜充分接觸，室溫下孵育2 h；室溫條件下采用TBST液在脫色搖床上洗3次，10 min/次，將化學(xué)發(fā)光HRP顯影試劑盒中A、B兩種試劑在EP 管內(nèi)等體積混合，現(xiàn)配現(xiàn)用，避光保存；將膜置于凝膠成像系統(tǒng)暗室中，將顯影劑滴加在PVDF膜上，啟動(dòng)機(jī)器曝光；使用Quantity One軟件進(jìn)行量化分析蛋白表達(dá)水平，以β-actin蛋白水平作為等量蛋白上樣內(nèi)部參照標(biāo)準(zhǔn)；目的蛋白磷酸化水平=磷酸化目的蛋白條帶灰度值/相應(yīng)總蛋白條帶灰度值×100%。（10）RT-PCR檢測(cè)：①CDKN1B表達(dá)檢測(cè)：收集細(xì)胞（6孔板80%細(xì)胞密度），2,000 r/min離心5 min，去上清，細(xì)胞沉淀中加入1 mL Trizol，充分混勻后室溫靜置5 min，然后轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP 管中；使用Promega M-MLV 試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，引物序列：上游為T(mén)AATTGGGGCTCCGGCTAACT，下游為T(mén)GCAGGTCGCTTCCTTATTCC，擴(kuò)增產(chǎn)物為116（bp）。內(nèi)參照GAPDH上游為T(mén)GACTTCAACAGCGACACCCA，下游為CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA。退火溫度均為55 ℃。同一條件下，每次PCR以GAPDH為內(nèi)參照，表達(dá)豐度以相對(duì)NC組樣品目的基因的相對(duì)表達(dá)水平表示。②BCL2L11表達(dá)檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)步驟同CDKN1B表達(dá)檢測(cè)，引物系列：上游為ATCCCCGCTTTTCATCTTTATG，下游為T(mén)CTCCAATACGCCGCAACTCT，擴(kuò)增產(chǎn)物為243（bp）。以上各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析或LSD 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組IGF1R正常表達(dá)PTC-1s細(xì)胞藥物干預(yù)不同時(shí)間的活細(xì)胞OD值（450 nm）比較 藥物干預(yù)24 h時(shí)，NC-HI組和NC-IG組相較于NC-CON組具有明顯的促細(xì)胞增殖作用，并且NC-IG組的促細(xì)胞增殖作用明顯強(qiáng)于NC-HI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。藥物干預(yù)至48 h、72 h，與空白對(duì)照組相比，NC-HI組和NC-IG組仍能表現(xiàn)出促細(xì)胞增殖作用，與NC-CON組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但NC-HI組與NC-IG組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。由此可見(jiàn)，人胰島素和甘精胰島素對(duì)IGF1R正常表達(dá)PTC-1s細(xì)胞的促細(xì)胞增殖作用呈時(shí)間依賴(lài)性，且甘精胰島素作用更強(qiáng)。見(jiàn)表1。

表1 各組IGF1R正常表達(dá)PTC-1s細(xì)胞藥物干預(yù)不同時(shí)間的活細(xì)胞OD值（450 nm）比較（±s）

表1 各組IGF1R正常表達(dá)PTC-1s細(xì)胞藥物干預(yù)不同時(shí)間的活細(xì)胞OD值（450 nm）比較（±s）

注：與同時(shí)間點(diǎn)NC-CON組比較，cP＜0.05，aP＜0.001；組間比較，bP＜0.001

組別 活細(xì)胞OD值（450 nm）18 h 24 h 48 h 72 h NC-CON 0.338±0.007 0.494±0.022 0.797±0.023 1.133±0.015 NC-HI 0.343±0.021 0.615±0.026a 0.886±0.048a 1.138±0.026 NC-IG 0.342±0.013 0.800±0.035ab 0.907±0.036a 1.157±0.014c

2.2 各組IGF1R低表達(dá)PTC-1s細(xì)胞藥物干預(yù)不同時(shí)間的活細(xì)胞OD值（450 nm）比較 藥物干預(yù)干預(yù)18、24、48、72 h，RNAI-HI組和RNAI-IG組的活細(xì)胞OD值與RNAI-CON組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。由此可見(jiàn)，人胰島素和甘精胰島素均不能促使IGF1R低表達(dá)PTC-1s細(xì)胞增殖。

表2 各組IGF1R低表達(dá)PTC-1s細(xì)胞藥物干預(yù)不同時(shí)間的活細(xì)胞OD值（450 nm）比較（±s）

表2 各組IGF1R低表達(dá)PTC-1s細(xì)胞藥物干預(yù)不同時(shí)間的活細(xì)胞OD值（450 nm）比較（±s）

組別 活細(xì)胞OD值（450 nm）18 h 24 h 48 h 72 h RNAI-CON 0.323±0.011 0.518±0.023 0.774±0.042 0.795±0.121 RNAI-HI 0.315±0.014 0.521±0.024 0.808±0.020 0.845±0.099 RNAI-IG 0.320±0.018 0.504±0.028 0.811±0.035 0.686±0.127

2.3 各組IGF1R正常表達(dá)和低表達(dá)PTC-1s細(xì)胞藥物干預(yù) 24 h后的p-Akt水平比較 藥物干預(yù) 24 h后，NC-HI組和NC-IG組的p-Akt水平都高于NC-CON組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）且NC-IG組高于NC-HI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明人胰島素和甘精胰島素均能明顯促使IGF1R正常表達(dá)PTC-1s細(xì)胞內(nèi)Akt磷酸化，甘精胰島素的促Akt磷酸化作用強(qiáng)于人胰島素。藥物干預(yù)24 h后，RNAI-HI組和RNAI-IG組的p-Akt水平與RNAI-CON組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明人胰島素和甘精胰島素均不能促使IGF1R低表達(dá)PTC-1s細(xì)胞內(nèi)Akt磷酸化。見(jiàn)圖1和表3。

圖1 藥物干預(yù) 24 h后各組IGF1R正常表達(dá)和低表達(dá)PTC-1s細(xì)胞內(nèi)的Akt磷酸化水平

表3 各組IGF1R正常表達(dá)和低表達(dá)PTC-1s細(xì)胞藥物干預(yù)24 h后的p-Akt水平比較

2.4 各組IGF1R正常表達(dá)和低表達(dá)PTC-1s細(xì)胞藥物干預(yù)24 h的p-Erk1/2水平比較 藥物干預(yù) 24 h后，NC-HI組和NC-IG組IGF1R正常表達(dá)PTC-1s細(xì)胞內(nèi)的p-Erk1/2水平均高于NC-CON組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且NC-HI組高于NC-IG組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），說(shuō)明人胰島素和甘精胰島素均能使IGF1R正常表達(dá)細(xì)胞內(nèi)Erk1/2磷酸化，且人胰島素的促Erk1/2磷酸化作用強(qiáng)于甘精胰島素。藥物干預(yù) 24 h后，RNAI-HI組和RNAI-IG組的p-Erk1/2水平與RNAICON組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明人胰島素和甘精胰島素均不能促使IGF1R低表達(dá)PTC-1s細(xì)胞內(nèi)Erk1/2磷酸化。見(jiàn)圖2和表4。

圖2 藥物干預(yù)24 h各組IGF1R正常表達(dá)和低表達(dá)PTC-1s細(xì)胞內(nèi)的Erk1/2磷酸化水平

表4 各組IGF1R正常表達(dá)和低表達(dá)PTC-1s細(xì)胞藥物干預(yù)24 h的p-Erk1/2水平比較

3 討論

有研究表明，體內(nèi)高胰島素水平可能造成糖尿病患者甲狀腺結(jié)節(jié)或者腫瘤的發(fā)生率提高［9-11］。多項(xiàng)研究顯示，胰島素有明顯的促細(xì)胞增殖作用，而且甘精胰島素可促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移［12］，甘精胰島素比人胰島素具有更強(qiáng)的促有絲分裂作用［13］。KURTZHAL等［14］研究發(fā)現(xiàn)，在人骨肉瘤細(xì)胞中，四種胰島素類(lèi)似物和人胰島素均有促細(xì)胞增殖作用，并且甘精胰島素的促有絲分裂效應(yīng)是人胰島素的8倍。本研究分別使用常規(guī)人胰島素和甘精胰島素注射液體外干預(yù)人甲狀腺乳頭狀癌 PTC-1s細(xì)胞株，均表現(xiàn)出促甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖作用。人胰島素與甘精胰島素促細(xì)胞增殖作用的差異，在IGF1R正常表達(dá)與低表達(dá)PTC-1s細(xì)胞中的表現(xiàn)不同。在胰島素干預(yù)下，IGF1R正常表達(dá)PTC-1s 細(xì)胞增殖明顯，提示胰島素通過(guò)IGF1R促進(jìn)細(xì)胞增殖，并且甘精胰島素的促細(xì)胞增殖作用明顯強(qiáng)于人胰島素。在IGF1R正常表達(dá)PTC-1s 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，筆者發(fā)現(xiàn)Akt信號(hào)通路和Erk信號(hào)通路都被人胰島素和甘精胰島素激活，并且在Akt磷酸化過(guò)程中以甘精胰島素作用為主，而Erk磷酸化則以人胰島素作用較為顯著，因此兩條通路效應(yīng)可能存在交叉作用，以甘精胰島素的細(xì)胞增殖作用較為顯著。IGF1R低表達(dá)PTC-1s細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，Akt信號(hào)通路和Erk信號(hào)通路均不能被激活，這與IGF1R低表達(dá)PTC-1s細(xì)胞中IGF1R基因敲減相符合。

綜上所述，人胰島素和甘精胰島素均能通過(guò)激活I(lǐng)GF1R細(xì)胞內(nèi)Akt和Erk信號(hào)通路，促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖。