梁宗英，楊 陽(yáng)，孫光蕊，趙寶山，辛國(guó)華，張 樂(lè)，侯繼申

1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科，河北 承德 067000；2.河北省胸科醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050000

食管癌是全世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率位居高不下［1］。雖然手術(shù)及放化療在一定程度上改善了部分食管癌患者的預(yù)后，但其總體生存率仍不容樂(lè)觀(guān)［2］。因此，研究食管癌發(fā)生、發(fā)展的具體分子機(jī)制，就成為預(yù)防和治療食管癌新的理論突破口。

ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子E1（ATP-combined box transporter E1，ABCE1）的基因是一種癌基因，其編碼的ABCE1蛋白在多種腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)，且其與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)［3］。研究［4］發(fā)現(xiàn)，ABCE1在食管癌組織中呈高表達(dá)，且其與食管癌的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

蛋白質(zhì)乙?；揎検潜碛^(guān)遺傳學(xué)修飾中的重要組成部分，參與多種生物學(xué)過(guò)程。蛋白質(zhì)的乙?；揎椥枰谝阴；D(zhuǎn)移酶的催化下進(jìn)行，故在蛋白質(zhì)乙?；揎椀纳飳W(xué)過(guò)程中，乙?；D(zhuǎn)移酶也扮演了重要的角色，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［5］。 食管癌中乙酰基轉(zhuǎn)移酶3b（acetyltransferase 3b，KAT3b）是乙酰基轉(zhuǎn)移酶家族中的重要一員，可以催化多種組蛋白及非組蛋白發(fā)生乙?；M(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

本研究通過(guò)檢測(cè)食管癌中ABCE1和KAT3b的表達(dá)及ABCE1蛋白的乙?；剑治鯧AT3b、ABCE1乙?；c病理學(xué)特征之間的相關(guān)性，并觀(guān)察下調(diào)KAT3b對(duì)ABCE1蛋白乙酰化水平的影響，探討乙酰基轉(zhuǎn)移酶KAT3b與ABCE1蛋白乙?；揎椫g的內(nèi)在聯(lián)系、在食管癌發(fā)病過(guò)程中的作用及其機(jī)制。

1 資料和方法

1.1 組織和細(xì)胞

選取2020年1月—2021年5月承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科手術(shù)切除的食管癌標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后腫瘤組織病理學(xué)檢查證實(shí)為鱗癌，無(wú)其他腫瘤病史，術(shù)前無(wú)放化療、免疫及靶向治療史；實(shí)驗(yàn)組：55例食管癌組織；對(duì)照組：55例相同患者與之對(duì)應(yīng)正常食管黏膜組織。一般資料：男性44例，女性11例；≥60歲42例，＜60歲13例；TNM分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期32例，Ⅲ期16例；組織分化：高分化7例，中分化40例，低分化8例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例。本研究經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得患者知情同意。人食管癌細(xì)胞系EC109由承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑

ABCE1單克隆抗體、Acetylated-Lysine抗體、KAT3b抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，A/G瓊脂糖珠購(gòu)自美國(guó)CST公司，DNA提取試劑盒購(gòu)自北京全式金生物有限公司，免疫組織化學(xué)SP試劑盒和濃縮型DAB試劑均購(gòu)自珠海市泉暉企業(yè)有限公司，Alexa Fluor 488-conjugated羊抗兔熒光抗體、ATTO 594-conjugated羊抗鼠熒光抗體購(gòu)自河北貝博實(shí)驗(yàn)用品有限公司。RNA引物由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)SP法

組織切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇浸泡，滴加3%H2O2，室溫放置10 min。破膜后，放入檸檬酸緩沖液，高溫修復(fù)抗原。切片冷卻，加山羊血清，室溫封閉。清洗后，濕盒中加入一抗（KAT3b單克隆抗體1∶1 000；ABCE1單克隆抗體，1∶1 000）4℃溫育過(guò)夜。室溫條件下，二抗溫育30 min。DBA顯色，蘇木精復(fù)染。

1.3.2 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)

提取蛋白，蛋白濃度測(cè)定；采用凝膠電泳分離總蛋白，并采用半干轉(zhuǎn)膜法將總蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，將膜放入稀釋好的一抗（KAT3b單克隆抗體1∶1 000；ABCE1單克隆抗體，1∶1 000）溫育40 min。漂洗后，將膜放入稀釋好的二抗中溫育30 min。漂洗后，暗室中進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，并曝光成片。采用Image pro plus軟件分析蛋白條帶的積分光密度（integral optical density，IOD）值，以目的蛋白IOD值和內(nèi)參IOD值的比值反映各組目的蛋白的表達(dá)量。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）

提取組織和細(xì)胞總RNA，取300 ng RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。應(yīng)用熒光定量試劑盒檢測(cè)ABCE1和KAT3b mRNA的相對(duì)表達(dá)量。相對(duì)表達(dá)量為2-ΔΔCt。

1.3.4 生物信息學(xué)分析和預(yù)測(cè)

生物信息學(xué)軟件乙?；患ㄜ浖ˋcetylation Set Enrichment Based，ASEB）預(yù)測(cè)可以將ABCE1蛋白作為底物催化其發(fā)生乙?；囊阴；D(zhuǎn)移酶［6］。ASEB不僅可以預(yù)測(cè)目的蛋白乙酰化狀態(tài)，還可以預(yù)測(cè)催化目的蛋白發(fā)生乙?；揎椀囊阴；D(zhuǎn)移酶及可能發(fā)生乙?；馁?lài)氨酸位點(diǎn)。

1.3.5 熒光免疫組織化學(xué)（fluorescence immunohistochemistry，IF）法

組織切片60 ℃恒溫箱中烘烤20 min，二甲苯及乙醇脫蠟，磷酸鹽緩沖生理鹽水（phosphatebuffered saline，PBS）清洗后抗原修復(fù)；5%山羊血清室溫封閉30 min，甩去多余液體；加一抗（ABCE1抗體1∶1 000，KAT3b抗體1∶1 000），4 ℃過(guò)夜，37 ℃復(fù)溫45 min，PBS洗3次；加熒光標(biāo)記的二抗（羊抗兔熒光抗體1∶200、羊抗鼠熒光抗體1∶200），室溫避光溫育1 h，PBS洗3次；DAPI染色10 min，PBS洗3次；抗熒光淬滅封片劑封片，拍照。

1.3.6 免疫共沉淀

組織提取蛋白質(zhì)，加入A/G瓊脂糖珠5 mL和ABCE1單克隆純抗體5 μL，混勻后補(bǔ)充2×裂解緩沖液至每管總體積450 μL，取上清液400 μL置入離心管，4 ℃、15 r/min，固定混勻器共沉淀12 h。4 ℃離心，棄上清液。1×裂解緩沖液500 μL洗滌A/G瓊脂糖珠。4 ℃，3 000 r/min，離心3 min，棄上清液。最后一次洗滌完畢后，棄去上清液。1×裂解緩沖液35 μL和等體積的2×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulphate，SDS）上樣緩沖液混合，煮沸8 min；3 000 r/min，離心；行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）、電轉(zhuǎn)移、封閉，加入一抗（acetylated-lysine抗體1∶2 000，KAT3b抗體 1∶1 000，GAPGH抗體1∶1 000）于3%BSA中 4 ℃溫育過(guò)夜。加入二抗后顯影。

1.3.7 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

EC109細(xì)胞系用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法，將KAT3b siRNA和陰性對(duì)照siRNA分別轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)組為KAT3b siRNA組（si-K組），陰性對(duì)照組為KAT3b siRNA空載體組（si-N組），空白對(duì)照組為空白細(xì)胞組 （NC組）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料資料符合正態(tài)分布、方差齊的數(shù)據(jù)用x±s表示，計(jì)數(shù)資料采用χ2分析，配對(duì)樣本采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 食管癌和正常食管黏膜組織中ABCE1和KAT3b蛋白表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，ABCE1在食管癌組織中呈高表達(dá)，其陽(yáng)性表達(dá)率為83.64%（46/55），高于正常食管黏膜的23.64%（13/55），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；KAT3b蛋白在食管癌組織和正常黏膜組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為78.18%（43/55）和25.45%（14/55），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 食管癌和正常食管粘膜組織中ABCE1和KAT3b蛋白表達(dá)Fig.1 Protein expression of ABCE1 and KAT3b in esophageal cancer and normal esophageal mucosal tissues

2.2 食管癌和正常食管黏膜組織中ABCE1和KAT3b蛋白表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，ABCE1在55例食管癌組織中的表達(dá)量為（72.64±2.14）%，高于正常食管黏膜組織中的（18.78±1.86）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。55例食管癌組織中KAT3b表達(dá)量為（60.43±1.76）%，高于正常黏膜組織的（10.34±1.62）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

圖2 食管癌和正常食管黏膜組織中ABCE1和KAT3b蛋白表達(dá)Fig.2 ABCE1 and KAT3b protein expression in esophageal cancer and normal esophageal mucosal tissues

2.3 食管癌和食管正常黏膜組織中KAT3b及ABCE1蛋白乙?；?/h3>

免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在55例食管癌組織中KAT3b蛋白表達(dá)量為（60.43±1.76）%，高于正常黏膜組織的（10.34±1.62）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。ABCE1蛋白發(fā)生了乙酰化，其在癌組織中的乙酰化率為（67.18±3.16）%，顯著高于正常食管黏膜組織的（17.87±1.13）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

圖3 食管癌和正常食管粘膜組織中KAT3b蛋白和ABCE1蛋白乙?；?Fig.3 The expression levels of KAT3b and ABCE1 protein acetylation in oesophageal cancer and normal esophageal mucosal tissues

2.4 乙酰基轉(zhuǎn)移酶KAT3b以ABCE1為底物催化其發(fā)生乙?；念A(yù)測(cè)

生物信息學(xué)軟件Acetylation Set Enrichment Based (ASEB)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，乙?；D(zhuǎn)移酶KAT3b可以將ABCE1蛋白作為底物催化其發(fā)生乙酰化，其可能發(fā)生乙?；馁?lài)氨酸（K）為19和397號(hào)位點(diǎn)（表1）。

表1 乙酰基轉(zhuǎn)移酶KAT3b以ABCE1為底物發(fā)生乙?；念A(yù)測(cè) Tab.1 The predict of acetyltransferase KAT3b catalyzed ABCE1 for substrate acetylation

2.5 食管癌組織中ABCE1和KAT3b蛋白表達(dá)

熒光免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，ABCE1和KAT3b蛋白在食管癌組織中同時(shí)呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，二者主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，部分表達(dá)于細(xì)胞核中（圖4）。

圖4 免疫熒光組化檢測(cè)ABCE1和KAT3b蛋白在食管癌組織中表達(dá)Fig.4 Immunofluorescence histochemistry detected the ABCE1 and KAT3b protein expression in esophageal cancer tissues

2.6 食管癌組織中ABCE1乙?；蚄AT3b的相關(guān)性

食管癌組織中ABCE1蛋白乙?；蚄AT3b蛋白的表達(dá)具有相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)r=0.414，二者呈正相關(guān)（P＜0.05，表2）。

表2 食管癌組織中ABCE1乙?；cKAT3b表達(dá)的相關(guān)性 Tab.2 Correlation of ABCE1 acetylation and KAT3b expression in oesophageal cancer tissues

2.7 食管癌組織中ABCE1乙?；癒AT3b與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性

ABCE1乙?；c食管癌TNM分期、組織分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），與性別及年齡無(wú)關(guān)（P＞0.05)。KAT3b陽(yáng)性表達(dá)與TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＜0.05），與性別及年齡無(wú)相關(guān)性（P＞0.05，表3）。

表3 食管癌組織中ABCE1乙?；?、KAT3b與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 Tab.3 Relationship between ABCE1 acetylation and KAT3b and clinicopathological features in esophageal cancer tissue

2.8 si-RNA干擾下調(diào)KAT3b效果

合成的si-RNA-KAT3b含有綠色熒光標(biāo)記的標(biāo)簽，轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞成功后熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光表達(dá)（圖5）。RTFQPCR檢測(cè)3組細(xì)胞KAT3b mRNA相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示，si-K組KAT3b mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.23±0.03，si-N組及NC組表達(dá)量分別為1.34±0.12和1.31±0.16。si-K組的mRNA表達(dá)量明顯低于si-N組及NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05，圖6）。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，si-K組KAT3b蛋白表達(dá)量顯著低于si-N組及NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖7），說(shuō)明合成干擾下調(diào)KAT3b的RNA序列有效。

圖5 RNA干擾KAT3b轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞熒光顯微鏡觀(guān)察結(jié)果 Fig.5 Fluorescent microscopy observations of R N A interfering KAT3b transfected EC109 cells

圖6 RNA干擾KAT3b轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞后KAT3b mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative KAT3b mRNA expression after KAT3b transfection with EC109 cells

圖7 RNA干擾KAT3b轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞后KAT3b蛋白表達(dá)量 Fig.7 KAT3b protein expression after RNA interfering with KAT3b transfection of EC109 cells

2.9 下調(diào)KAT3b對(duì)ABCE1蛋白乙?；挠绊?/h3>

免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RNA干擾下調(diào)KAT3b 后，si-K組ABCE1乙?；斤@著下降（P＞0.05），而si-N和NC組乙酰化水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖8），提示抑制KAT3b的表達(dá)可以明顯降低EC109細(xì)胞中ABCE1乙?；?。Si-K: KAT3b si-RNA group; Si-N: Negative control group; NC: Blank control group.

圖8 RNA干擾KAT3b轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞后ABCE1乙?；?Fig.8 Acetylation levels of ABCE1 after RNA interfering with KAT3b transfection of EC109 cells

3 討 論

食管癌發(fā)病隱匿，發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已進(jìn)展至中晚期，故食管癌患者的總體預(yù)后不理想。目前食管癌的治療主要以手術(shù)和放化療為主，然而，放化療對(duì)晚期食管癌患者的緩解率較低，往往會(huì)導(dǎo)致多種不良反應(yīng)［7］。隨著對(duì)癌基因的深入研究，靶向治療為食管癌患者提供了更好的選擇。

表觀(guān)遺傳學(xué)中的乙?；揎椏梢赃z傳性地調(diào)控基因的表達(dá)，并參與大多數(shù)細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程［8］。研究［9-10］證實(shí)，蛋白質(zhì)乙?；揎椩诨虮磉_(dá)、調(diào)控及癌癥啟動(dòng)等過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。ABCE1作為一種高度保守的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在多種腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演癌基因的角色。研究［3］表明，腫瘤組織中高表達(dá)的ABCE1與非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌及多種腫瘤的細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移及腫瘤耐藥等關(guān)系密切。前期研究［11］發(fā)現(xiàn)，ABCE1在肺腺癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，且發(fā)生了乙?；揎棧⑴c肺腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌組織中ABCE1蛋白呈高表達(dá)，而在正常食管黏膜內(nèi)則呈低表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，ABCE1在食管癌組織中也發(fā)生了乙?；揎?，且其乙?；脚c食管癌的TNM分期、腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有明顯的相關(guān)性，說(shuō)明ABCE1是一種乙?；鞍?，而且其乙?；揎椏赡軈⑴c了食管癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

KAT3b是乙?；D(zhuǎn)移酶家族中的代表性成員之一，不僅可以催化組蛋白發(fā)生乙?；?，可以催化多種非組蛋白底物發(fā)生乙?；⑴c多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展。本研究證實(shí)，食管癌組織中KAT3b蛋白呈高表達(dá)，且與腫瘤分期、分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。但在食管癌中KAT3b作為乙?；D(zhuǎn)移酶能否催化ABCE1的乙?；揎椷M(jìn)而調(diào)控食管癌的發(fā)生、發(fā)展需要進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，KAT3b可以將ABCE1蛋白作為底物催化其發(fā)生乙?；?，其可能發(fā)生乙?；馁?lài)氨酸（K）為19和397號(hào)位點(diǎn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌組織中ABCE1和KAT3b蛋白共表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，且二者呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，說(shuō)明在食管癌中KAT3b可以與ABCE1相互作用，KAT3b作為乙?；D(zhuǎn)移酶可能參與ABCE1蛋白的乙酰化修飾過(guò)程。進(jìn)一步通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析了KAT3b和ABCE1乙?；降南嚓P(guān)性，結(jié)果表明在食管癌組織中，KAT3b的陽(yáng)性表達(dá)與ABCE1高乙?；收嚓P(guān)，提示KAT3b作為乙?；D(zhuǎn)移酶可能參與ABCE1的乙?；揎?，從而促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

研究［12-13］證實(shí)，在不同的腫瘤細(xì)胞中通過(guò)抑制乙?；D(zhuǎn)移酶途徑抑制腫瘤細(xì)胞的作用亦不相同。本研究結(jié)果提示食管癌細(xì)胞內(nèi)KAT3b作為乙?；D(zhuǎn)移酶催化了非組蛋白ABCE1的乙酰化修飾，進(jìn)而調(diào)控食管癌的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，在食管癌中KAT3b的表達(dá)與ABCE1乙?；矫芮邢嚓P(guān)，KAT3b的高表達(dá)可能促進(jìn)了ABCE1的高乙?；癄顟B(tài)，這可能是促進(jìn)食管癌發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。