孫彩霞， 劉玉紅， 楊艷， 賀文員， 潘志彥

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，浙江 杭州 310032； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所，浙江 杭州 310021；3.浙江豐瑜生態(tài)科技有限公司，浙江 金華 321000)

連作障礙是指連續(xù)在同一土壤上栽培同種作物或近緣作物引起的作物生長(zhǎng)發(fā)育異常、產(chǎn)量下降、土壤健康狀況惡化及土傳病害積累等現(xiàn)象[1]。連作障礙的發(fā)生有多種原因，包括養(yǎng)分過(guò)度消耗、土壤理化性質(zhì)惡化、土壤有害微生物集聚、土壤微生物區(qū)系劣變和有毒物質(zhì)(包括化感物質(zhì)等)累積等[2-3]。土壤微生物在土壤養(yǎng)分循環(huán)及病蟲(chóng)害防治中起重要作用，被認(rèn)為是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的關(guān)鍵生物指標(biāo)之一[4]，然而有研究表明，有些微生物會(huì)以病原菌的形式出現(xiàn)，入侵作物根部，引起作物病害[5]。土壤微生物群落受多種因素的影響，在連作土壤中，土壤微生物的群落組成和多樣性主要受作物的根系分泌物和脫落物的影響[6]，連作土壤環(huán)境的改變也會(huì)對(duì)農(nóng)作物品質(zhì)產(chǎn)生一定的影響[7]。

設(shè)施番茄連作的栽培模式在中國(guó)較為普遍，而長(zhǎng)期的單一作物連作會(huì)導(dǎo)致土壤微生物多樣性下降，病原菌數(shù)量增加，有益微生物數(shù)量減少[8]。有研究表明，番茄連作4年后，會(huì)導(dǎo)致番茄品質(zhì)下降，土壤養(yǎng)分失衡，微生物量碳氮下降，土壤由細(xì)菌型向真菌型轉(zhuǎn)變，出現(xiàn)地力衰竭等嚴(yán)重的連作障礙現(xiàn)象[9-11]。目前，利用有機(jī)肥對(duì)設(shè)施連作土壤進(jìn)行改良具有很高的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)還可替代化肥，減少設(shè)施農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中化肥的施用量[12]。有研究表明，通過(guò)施加有機(jī)肥可增加連作土壤中的有益微生物，如根際促生菌(plant growth promoting rhinoacteria，PGPR)的豐度[13]。本研究利用Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)施加不同肥料的番茄連作土壤進(jìn)行高通量測(cè)序，分析不同的施肥量對(duì)番茄連作土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，比較不同的肥料種類(lèi)及施肥量在設(shè)施農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展中的可行性，為設(shè)施農(nóng)業(yè)的合理施肥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)位于浙江省紹興市馬山鎮(zhèn)金碩農(nóng)業(yè)科技有限公司，供試作物為金珠櫻桃番茄。

1.2 處理設(shè)計(jì)

供試作物分別在2個(gè)大棚中種植，每個(gè)大棚均包含7個(gè)處理。其中，T1為施用300 g·m-2農(nóng)家肥，T2為施用300 g·m-2商品肥，T3～T6分別為施用150、300、450、600 g·m-2的腐植酸調(diào)理劑，以不施肥為空白對(duì)照(CK)，每塊樣地大小為60 m2。上述肥料均由浙江豐瑜生態(tài)科技有限公司提供。

1.3 土壤樣品的采集

2020年8月，采用五點(diǎn)取樣法采集土壤樣品，每個(gè)樣點(diǎn)去除表面雜草，利用土鉆采集0～10 cm的表層土。共采集7個(gè)土壤樣本，將采集的土壤過(guò)2 mm篩，去除雜草后保存于-80 ℃冰箱，用于土壤基因組的提取及高通量測(cè)序。

1.4 試驗(yàn)方法

有關(guān)番茄養(yǎng)分的4個(gè)指標(biāo)委托農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品及加工品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(杭州)依照相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定。

土壤細(xì)菌DNA基因組提取采用試劑盒E.Z.N.A.?soil DNA kit (Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.)法提取。以50 ng DNA為模版，采用通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGC AG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對(duì)16Sr DNA高變區(qū)V3～V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min，27個(gè)循環(huán)(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)，然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在4 ℃進(jìn)行保存(PCR儀為ABI GeneAmp? 9700型)。PCR反應(yīng)體系為：5×TransStartFastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，上游引物(5 μmol·L-1)0.8 μL，下游引物(5 μmol·L-1)0.8 μL，TransStartFastPfuDNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，補(bǔ)足至20 μL。

將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合，使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences，Union City，CA，USA)進(jìn)行回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用QuantusTMFluorometer (Promega，USA) 對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫(kù)：(1)接頭鏈接；(2)使用磁珠篩選去除接頭自連片段；(3)利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集；(4)磁珠回收PCR產(chǎn)物得到最終的文庫(kù)。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。

使用Trimmomatic軟件對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用FLASH (V1.2.11，https：//ccb.jhu.edu/software/FLASH/index.shtml)進(jìn)行每個(gè)樣品的reads拼接，然后通過(guò)Qiime(V1.9.1，http：//qiime.org/install/index.html)對(duì)序列進(jìn)行去重過(guò)濾，將上述得到的有效序列利用Uparse (V7.0.1090，http：//www.drive5.com/uparse/) 在97%的相似度水平中進(jìn)行OTU(Operational Taxonomic Units)聚類(lèi)并剔除嵌合體，以出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列。采用RDP classifier (V2.11，https：//sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類(lèi)注釋?zhuān)葘?duì)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)(SSU128)，設(shè)置比對(duì)閾值為70%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Excel 2016及美吉生物云平臺(tái)進(jìn)行相關(guān)圖表的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)番茄產(chǎn)量的影響

在收獲期將各處理的產(chǎn)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，空白、施用農(nóng)家肥、施用商品肥這3個(gè)處理的產(chǎn)量遠(yuǎn)低于施用腐植酸調(diào)理劑的4個(gè)處理。腐植酸調(diào)理劑可能更加適合連作番茄的種植，有助于改善連作土壤的肥力，提高番茄產(chǎn)量。

2.2 不同處理對(duì)番茄品質(zhì)指標(biāo)的影響

表1顯示，各處理中，T6處理的可溶性固形物、VC及總糖含量最高，可滴定酸含量最低，表明此處理的番茄品質(zhì)最好。T3處理的可溶性固形物、VC及總糖含量較低而可滴定酸含量較高?？梢?jiàn)，施加600 g·m-2的腐植酸調(diào)理劑會(huì)最大程度的提高番茄的養(yǎng)分含量。腐植酸調(diào)理劑用量偏少的情況下對(duì)番茄品質(zhì)的改善效果不明顯。

表1 不同處理對(duì)番茄品質(zhì)指標(biāo)的影響

2.3 不同處理對(duì)番茄連作土壤的α多樣性指數(shù)的影響

表2顯示，各處理中，Ace、Chao指數(shù)在T1處理最低，T5處理最高。Shannon指數(shù)在T5和T6處理有最大值和最小值，Simpson指數(shù)在T6和T1處理中有最大值和最小值。相比CK，施肥會(huì)使土壤微生物的菌落結(jié)構(gòu)更加集中。但施用農(nóng)家肥和商品肥會(huì)降低土壤的Chao、Ace、Shannon和Simpson指數(shù)，會(huì)降低番茄連作土壤細(xì)菌的豐富度，而施加450 g·m-2的腐植酸調(diào)理劑會(huì)使土壤中細(xì)菌的豐富度達(dá)到最優(yōu)。

表2 不同處理下番茄連作土壤的α多樣性指數(shù)

2.4 不同處理對(duì)番茄連作土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

將經(jīng)過(guò)高通量測(cè)序的下機(jī)序列通過(guò)優(yōu)化過(guò)濾低質(zhì)量序列后得到有效序列354 629條，有效序列平均長(zhǎng)度為415.5 bp，供試土壤樣品序列經(jīng)拆分、去冗余后，在97%相似度下進(jìn)行OTU聚類(lèi)，共得到2 854個(gè)OTUs。利用測(cè)序獲得的序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣，將抽到的序列數(shù)所代表的OTU數(shù)目構(gòu)建稀釋性曲線(圖1)，不同處理的土壤樣品稀釋性曲線均趨向平緩，趨于飽和，這說(shuō)明供試樣品取樣合理，測(cè)試數(shù)據(jù)量合理，實(shí)際土壤環(huán)境細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)置信度較高，能真實(shí)反映土壤樣本的細(xì)菌群落，增加測(cè)序數(shù)量對(duì)發(fā)現(xiàn)新的OTU貢獻(xiàn)率較小。

圖1 不同處理下番茄連作土壤的稀釋曲線

將聚類(lèi)產(chǎn)生的OTUs進(jìn)行分類(lèi)，可劃分為34門(mén)89綱218目363科682屬1 260種。表3顯示，CK的各分類(lèi)水平的數(shù)量要大于6個(gè)肥料處理，表明施加不同肥料均會(huì)降低番茄連作土壤中的物種數(shù)量。

表3 不同處理下番茄連作土壤細(xì)菌群落組成中各分類(lèi)單元的數(shù)量

在門(mén)水平中(圖2)，變形菌門(mén)(Proteobacteria)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、綠灣菌門(mén)(Chloroflexi)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)是優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)，相對(duì)豐度均大于10%，其豐度總和占細(xì)菌總豐度的75.5%。相比CK，6個(gè)施肥處理均會(huì)增加土壤中變形菌門(mén)和放線菌門(mén)的相對(duì)豐度，降低酸桿菌門(mén)和芽單胞菌門(mén) (Gemmatimonadetes)的相對(duì)豐度。

圖2 不同處理下番茄連作土壤細(xì)菌在門(mén)水平的相對(duì)豐度

在屬水平中(圖3)，7個(gè)處理共鑒定出682個(gè)屬，其中CK中鑒定出557個(gè)屬。

圖3 不同處理下番茄連作土壤細(xì)菌在屬水平的相對(duì)豐度

相比CK，6個(gè)肥料處理鑒定出的屬分別減少20.47%、9.52%、8.44%、4.85%、2.51%、6.64%。

經(jīng)過(guò)在Silva數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，大部分的細(xì)菌無(wú)法鑒定到屬，且無(wú)法純培養(yǎng)，可鑒定到的主要有Rhodanobacter、芽孢桿菌屬(Bacillus)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、FCPS473、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、嗜酸棲熱菌屬(Acidothermus)、Bryobacter、Devosia、硝化螺菌屬(Nitrospira)、Pseudolabrys、Chujaibacter、Burkholderia-Caballer-onia-Paraburkholderia、Candidatus_Solibacter、鏈霉菌屬(Streptomyces)、Acidibacter、MND1、Jatrophi-habitans。

PCoA分析發(fā)現(xiàn)，7個(gè)處理解釋了細(xì)菌群落總變異的67%，其中PC1軸解釋了細(xì)菌群落總變異的45.41%，PC2軸解釋了細(xì)菌群落總變異的21.59%(圖4)。此外，PC1軸顯著將CK處理與其他6個(gè)處理分開(kāi)，表明施肥會(huì)顯著改變番茄連作土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)；PC2軸顯著將施用腐植酸調(diào)理劑的4個(gè)處理與其他3個(gè)處理分開(kāi)，表明施用腐植酸調(diào)理劑會(huì)顯著改變番茄連作土壤的細(xì)菌群落，造成細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與其他3個(gè)處理的不同。

圖4 不同處理下番茄連作土壤細(xì)菌群落的PCoA分析

2.5 不同處理下番茄連作土壤細(xì)菌群落的功能預(yù)測(cè)

通過(guò)PICRUSt對(duì)OTU豐度表進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，然后OTU進(jìn)行COG和KEGG功能注釋?zhuān)@得OTU在COG、KEGG各功能水平的注釋信息及各功能在不同樣本中的豐度信息。圖5顯示，7個(gè)處理的細(xì)菌群落共涉及24種功能，除了功能未知和僅通用功能預(yù)測(cè)外，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝相關(guān)的OTU序列最多，與細(xì)胞外結(jié)構(gòu)和細(xì)胞骨架相關(guān)的OTU序列最少。

3 小結(jié)與討論

在本研究中，施加600 g·m-2的腐殖酸調(diào)理劑會(huì)提高連作番茄的品質(zhì)，很可能是該劑量下的腐植酸調(diào)理劑改善了連作番茄土壤的根際微環(huán)境。相較于不施肥、施用農(nóng)家肥及商品肥，腐植酸調(diào)理劑對(duì)于連作番茄土壤的改良更多的是通過(guò)影響土壤中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行的，未來(lái)對(duì)于腐植酸調(diào)理劑對(duì)土壤的改良機(jī)理的研究，更多的要集中于土壤的細(xì)菌和真菌生物量，以及根際土壤是向細(xì)菌型還是真菌型轉(zhuǎn)化[14-15]。研究顯示，當(dāng)土壤由細(xì)菌型向真菌型轉(zhuǎn)化時(shí)，土壤正在酸化，且養(yǎng)分含量降低，不利于作物生長(zhǎng)。在實(shí)際生產(chǎn)中，為保證番茄品質(zhì)并保護(hù)土壤，應(yīng)當(dāng)更多的施用腐植酸調(diào)理劑。