查燕， 牛天新， 湯婕

(1.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024； 2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，安徽 合肥 230061)

酸雨通常是指pH值小于5.6的雨、雪、霧、雹等大氣降水，其給陸地生態(tài)系統(tǒng)帶來不利影響。研究表明，我國已成為繼歐洲、北美之后的世界第三大酸雨區(qū)[1]，在中國南方地區(qū)觀測到大量酸雨[2]。作為農(nóng)業(yè)大國，我國農(nóng)作物生長體系的自然環(huán)境相對脆弱，酸雨對農(nóng)作物的影響已成為關(guān)注熱點和難點[3-4]。值得注意的是，農(nóng)作物葉片不僅是酸雨最直接的危害對象，同時也是植物器官中對環(huán)境脅迫響應(yīng)較為敏感的器官。因此，葉菜類蔬菜相比其他植物更易受到酸雨的影響[5]，且pH越低，其對農(nóng)作物的傷害程度越大。研究發(fā)現(xiàn)，酸雨會影響種子萌發(fā)，破壞葉肉組織的結(jié)構(gòu)和功能[6-7]，打破其內(nèi)部的酸堿平衡，導(dǎo)致植物生理機能損傷[8]。Biswojit等[9]研究發(fā)現(xiàn)，當酸雨脅迫強度為2.5時，番茄幼苗生長、光合作用和氧化損傷即達到嚴重程度。鐘嘉文等[10]研究發(fā)現(xiàn)，pH 3.0的模擬酸雨對生菜的光合系統(tǒng)及其地上部產(chǎn)量影響顯著。此外，不同類型農(nóng)作物的抗氧化系統(tǒng)對酸雨脅迫響應(yīng)有所不同。pH值3.0、4.0和5.0的模擬酸雨均能提高生菜超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量[10]；水稻抗氧化系統(tǒng)對酸雨脅迫響應(yīng)的敏感程度由強到弱依次為SOD、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸(AsA)[11]。隨著酸雨強度的增加，SOD、CAT和過氧化物酶(POD)的活性呈先升高后降低的趨勢[12]。

作為綠色植物，蔬菜不僅是連接大氣和土壤的主要環(huán)境介質(zhì)，而且在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本研究以上海青為研究材料，探究不同pH梯度的模擬酸雨對上海青的生長、葉綠素相對含量及抗氧化系統(tǒng)的影響，以期為上海青在酸雨頻發(fā)地區(qū)的栽培管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料為上海青德高508青梗菜(河南省大禹種業(yè)公司)。試驗地位于杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院科研基地，年均氣溫15.7 ℃。試驗土壤為杭州市臨安區(qū)亞仙家庭農(nóng)場的優(yōu)良黃土。經(jīng)測定，土壤pH值為5.47，有機質(zhì)為17.71 g·kg-1，有效磷、速效鉀、交換性鈣、交換性鎂分別為11.60、240.41、2 639.98和686.60 mg·kg-1。土壤經(jīng)暴曬、打細后過2 mm篩，剔除殘茬、石塊、枯葉、砂礫等雜質(zhì)后備用。為保證上海青正常生長，搭建試驗大棚以避免自然降雨的干擾。種植盆為內(nèi)徑15 cm的塑料花盆，期間給予正常水肥管理。

1.2 處理設(shè)計

本研究采用密度1.4 g·mL-1的98%H2SO4和密度1.84 g·mL-1的65%H2NO3配制體積比為4∶1的模擬酸雨。試驗設(shè)3個酸雨梯度，pH 7.0(CK)、pH 5.5(輕度酸雨)和pH 3.5(重度酸雨)。每處理重復(fù)6次。根據(jù)當?shù)亟邓?，將每月酸雨噴淋量設(shè)為85 mm，噴霧裝置以5 mm·h-1的速率對幼苗進行噴淋，噴淋方式為全淋，即在植株上方60 cm處均勻噴淋酸雨。每次噴1 h，在1 d內(nèi)重復(fù)3次，每次重復(fù)間隔4 h以上，確保1 d內(nèi)降雨量達到15 mm。當上海青地上部分長出第三片真葉時開始進模擬試驗。從模擬酸雨沉降當天開始，每隔3 d進行1次模擬。模擬噴淋后分別在第5、10和15天進行試驗采樣。取健康葉片分別裝入自封袋，并帶回實驗室于-80 ℃超低溫冰箱中保存，備用。

1.3 測定方法

葉綠素相對含量。采用柯尼卡美能達SPAD-502 Plus便攜式葉綠素儀器來測定，每片葉取3次測定平均值。每次采樣時，從3個不同模擬酸雨pH值的試驗大棚里分別隨機選取3株上海青，根土分離后用超純水洗凈表面污泥，并吸干水分待用。

生長指標。將上海青的食用部分和根部分離，用直尺測量單株的莖葉長度和根長(測其最長部位)，并測定食用部分質(zhì)量。

抗氧化酶活性。稱取0.1 g新鮮葉片放入離心管中，并置入數(shù)粒玻璃珠，加入1 mL試劑盒內(nèi)提取液，在高通量組織研磨儀中勻漿研磨，取出玻璃珠后在8 000g、4 ℃條件下離心10 min。用移液槍取上清液為樣本溶液，置冰上，在特定吸光度下用紫外分光光度計測定上述指標。整個試驗在4 ℃下進行，上述指標均采用生物試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與多重比較分析，用Origin 9.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬酸雨對上海青葉綠素相對含量的影響

由圖1可知，相比CK(pH 7.0)，第5天的pH 5.5的模擬酸雨處理增加了葉綠素相對含量，為CK的1.03倍，但兩者間差異不顯著；第10和15天的pH 5.5的模擬酸雨處理的葉綠素相對含量均低于CK處理，但其間差異不顯著。整個試驗期內(nèi)，pH 3.5的模擬酸雨處理顯著降低了葉綠素相對含量。在酸雨的持續(xù)脅迫下，pH 3.5的模擬酸雨處理對葉綠素相對含量的影響越發(fā)明顯，其中第15天的pH 3.5的模擬酸雨處理的葉綠素相對含量較CK下降11.24%。

葉綠素是植物進行光合作用的重要物質(zhì)，葉綠素含量在一定程度上與植物光合作用呈正相關(guān)。其中，葉綠素相對含量是評價植物光合作用的關(guān)鍵指標[13]。本研究中，第5天的pH 5.5的模擬酸雨處理對上海青葉綠素合成起到促進作用，而第5天的pH 3.5的酸雨處理則顯著降低了上海青葉綠素相對含量，說明酸雨抑制了上海青葉綠素的合成，導(dǎo)致其光合作用下降。張利霞等[14]研究發(fā)現(xiàn)，隨著營養(yǎng)液pH的降低，夏枯草葉片葉綠素含量呈下降趨勢。王春燕[15]研究發(fā)現(xiàn)，隨著酸雨pH的降低，華重樓葉片葉綠素含量及比值均有所下降，上述研究結(jié)果均與本研究結(jié)論一致。

2.2 模擬酸雨對上海青幼苗生長的影響

由圖2可知，不同模擬酸雨處理對上海青第5天鮮重和莖葉長的影響未達顯著差異。在第5和第10天，pH 5.5的模擬酸雨處理的鮮重與CK(pH 7.0)間差異不顯著；在第10和第15天，pH 3.5的模擬酸雨處理的鮮重和莖葉長分別較CK顯著降低。綜上可知，在整個試驗期內(nèi)，pH 5.5的模擬酸雨處理的鮮重和莖葉長均與CK幾乎相同，而pH 3.5的模擬酸雨處理對上海青的鮮重和莖葉長的抑制強度隨著酸雨脅迫時間的增加而增加。陳佳月等[16]研究發(fā)現(xiàn)，與其各自空白對照(pH=6.5)相比，隨著酸雨強度的增大，玉米植株的鮮重呈先促后抑的趨勢；易曉芹等[17]研究發(fā)現(xiàn)，pH 4.5模擬酸雨處理對茶樹植株表型無明顯傷害，而pH 3.5模擬酸雨處理下茶樹生長受到抑制，這都與本研究結(jié)論一致。

圖2 模擬酸雨對上海青生長的影響

隨著酸雨脅迫時間的增加，pH 5.5和3.5的模擬酸雨處理對上海青根長的影響與CK無顯著差異。究其原因，可能是本研究在模擬酸雨沉降的過程中采用塑料薄膜隔離土壤，與植株地下部分未受到酸雨的影響有關(guān)。

2.3 模擬酸雨對上海青葉片中MDA含量的影響

由圖3可知，相比CK，不同濃度酸雨處理顯著提高了上海青MDA的含量。在第5天和第10天，pH 5.5和3.5的模擬酸雨處理的葉片MDA含量均顯著高于CK，且在第10天，pH 3.5的葉片MDA含量顯著高于pH 5.5；第15天，pH 5.5模擬酸雨處理下的葉片MDA活性與CK無顯著差異，但顯著低于pH 3.5處理。

圖3 模擬酸雨對上海青MDA含量的影響

MDA在植物體內(nèi)的含量是膜系統(tǒng)受到傷害程度的重要指標[17]。研究表明，酸雨處理會增加植物MDA含量[18]。王春燕[15]研究表明，不同pH的酸雨可對華重樓葉片造成不同程度的傷害，且隨著酸雨pH值的降低，MDA含量明顯增加。本研究中，pH 5.5和3.5的模擬酸雨對MDA含量的主效應(yīng)均有顯著影響，表明弱酸雨會對上海青細胞膜造成損害，這與鐘嘉文等[10]的研究結(jié)論一致。

2.4 模擬酸雨對上海青葉片中SOD、POD、CAT活性的影響

2.4.1 模擬酸雨對上海青葉片中SOD活性的影響

由圖4可知，在第5天，不同濃度模擬酸雨處理的葉片SOD活性與CK均無顯著差異；在第10和第15天，pH 5.5和3.5的模擬酸雨處理均顯著提高了葉片SOD活性。由此可知，在第10和15天，pH 5.5和pH 3.5模擬酸雨處理下的上海青葉片SOD活性顯著提高，說明酸雨對上海青的抗氧化系統(tǒng)有激活作用，這與鐘嘉文[10]和陶巧靜[19]的研究結(jié)果一致。但鐘嘉文等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在第40天時，pH 3.0的模擬酸雨處理下生菜葉片SOD活性反而顯著下降，可能是由于長時間的極強酸雨脅迫的累積效應(yīng)導(dǎo)致酶失活。在本研究中，上海青在受酸雨脅迫20 d內(nèi)未出現(xiàn)SOD活性下降的現(xiàn)象，說明在此期間上海青對酸雨脅迫的抵抗性較好。

2.4.2 模擬酸雨對上海青葉片中POD活性的影響

由圖5可知，在第5天，不同濃度模擬酸雨處理的葉片POD活性與CK均無顯著性差異。在第10天，pH 5.5和3.5的模擬酸雨處理均顯著提高了葉片POD活性，分別較CK提高9.84%和22.71%。在第15天，pH 3.5的模擬酸雨處理下的POD活性顯著高于pH 5.5和CK，較CK提高30.39%；pH 5.5的模擬酸雨處理提高了葉片POD活性，較CK提高6.39%，但其間差異不顯著。

2.4.3 模擬酸雨對上海青葉片中CAT活性的影響

由圖6可知，在整個試驗期內(nèi)，不同濃度酸雨處理均顯著提高了葉片CAT活性。在第5天，pH 3.5和5.5模擬酸雨處理的葉片CAT活性均顯著高于CK，分別比CK提高19.06%和23.09%。在第10天，pH 5.5和3.5模擬酸雨處理下的葉片CAT活性均顯著高于CK，分別比CK提高12.58%和28.74%。在第15天，pH 5.5和3.5的模擬酸雨處理下的葉片CAT活性均顯著高于CK，分別比CK提高14.34%和23.54%。

圖6 模擬酸雨對上海青CAT活性的影響

CAT和POD是自由基清除過程中2個重要的酶，在pH 5.5和3.5的模擬酸雨處理下，兩者活性均高于對照。本研究結(jié)果顯示，在pH 3.5和5.5模擬酸雨處理下，POD和CAT的活性隨著酸雨強度的增大而上升，這表明上海青幼苗受到外界酸雨脅迫后，機體內(nèi)累積的過多的H2O2被CAT轉(zhuǎn)化成H2O和O2，使得體內(nèi)過多的H2O2得到清除[20]。俞飛等[21]研究發(fā)現(xiàn)，不同酸雨濃度梯度處理均顯著增加了禿瓣杜英幼苗POD和CAT活性，其中以pH 2.5酸雨濃度影響最為顯著，這與本研究結(jié)論一致。

2.5 酸雨及時間處理的上海青生長及生理指標的雙因素分析

由表1可知，不同酸雨處理對上海青葉綠素相對含量、莖葉長、根長、MDA含量及SOD、POD和CAT的活性的主效應(yīng)均具有十分顯著的影響(P<0.001)，但對上海青鮮重的主效應(yīng)無顯著性影響(P=0.061)。處理時間對上海青葉綠素含量、莖葉長的主效應(yīng)無顯著影響，對上海青鮮重、根長、MDA、SOD、POD和CAT的主效應(yīng)具有十分顯著的影響(P<0.001)。不同強度的酸雨處理和處理時間的交互作用對上海青根長、POD和CAT活性具有顯著影響(P<0.05)，對MDA含量和SOD活性具有十分顯著的影響(P<0.001)，但對上海青葉綠素相對含量、鮮重、莖葉長均無顯著影響(P>0.05)。

表1 酸雨與時間對上海青幼苗生長及生理指標的影響

3 小結(jié)

在整個試驗期內(nèi)，pH 5.5模擬酸雨處理對上海青葉綠素相對含量、鮮重、莖葉長和根長均無顯著影響，但會激活上海青的抗氧化系統(tǒng)，提高POD、SOD和CAT抵御酸雨帶來的脅迫。pH 3.5模擬酸雨處理的上海青葉片MDA含量均顯著高于pH 7.0，造成細胞膜系統(tǒng)損傷，使上海青葉綠素相對含量、鮮重和莖葉長均顯著下降。總體上，盡管酸雨脅迫顯著抑制了上海青生長，但其對酸雨具有一定的耐受性，主要通過提高抗氧化酶活性緩解酸雨脅迫。