袁先鈴，袁玉梅，雷鳴

(1.四川輕化工大學 生物工程學院，四川 自貢 643000；2.四川天味家園食品有限公司，成都 610000；3.四川省遠達集團富順縣美樂食品有限公司，四川 自貢 643000)

HACCP技術(shù)英文全稱為Hazard Analysis and Critical Control Point，中文名為危害分析和關(guān)鍵控制點。HACCP是一種食品安全管理技術(shù)，是一個世界范圍內(nèi)指導食源性危害安全控制的方針，是國際上公認的食品安全體系[1]，HACCP體系是科學、高效、簡單、合理、高度專業(yè)的食品安全管理體系，是控制食品安全風險的預防體系[2]。其目的是識別食品生產(chǎn)加工過程中可能發(fā)生的安全危害，并建立相應(yīng)的控制程序[3-5]，從而降低食品危害發(fā)生的概率。目前關(guān)于辣椒醬的研究主要集中于發(fā)酵辣椒醬的生產(chǎn)工藝、貨架期及安全分析[6-9]，而對于非發(fā)酵辣椒醬的研究主要集中于生產(chǎn)工藝方面[10-12]，未見食源性致病細菌及HACCP方面的研究。

因此，在香辣醬生產(chǎn)加工企業(yè)建立和應(yīng)用HACCP體系，是保證產(chǎn)品質(zhì)量安全的必然選擇。結(jié)合HACCP原理對香辣醬生產(chǎn)過程各個環(huán)節(jié)的影響，進行危害分析，確定關(guān)鍵控制點并建立HACCP體系，為產(chǎn)品質(zhì)量安全提供有效保障。

1 香辣醬生產(chǎn)工藝

原料預處理→原輔料加工→醬體調(diào)配→殺菌→罐裝→包裝。

2 香辣醬生產(chǎn)過程中腸桿菌科菌鑒定

2.1 試驗方法

2.1.1 采樣時間

以每班次生產(chǎn)為周期，在生產(chǎn)前、生產(chǎn)過程中每隔2 h/次，生產(chǎn)結(jié)束時分別采樣，檢測生產(chǎn)過程中菌落總數(shù)和腸桿菌變化趨勢。

2.1.2 采樣方法

采樣方法見表1。

表1 采樣方法表Table 1 Sampling methods

2.1.2.1 空氣取樣

將營養(yǎng)瓊脂(NA)平板和結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂(VRBGA)平板放到采樣點，打開皿蓋，暴露5 min。

2.1.2.2 涂抹取樣

用經(jīng)殺菌后蘸有無菌生理鹽水的棉球擦拭取樣框內(nèi)表面(框內(nèi)面積為50 cm2)，擦完后將棉球放入盛有10 mL無菌生理鹽水的試管中，此試管中溶液每1 mL代表5 cm2，密封帶回微生物室備用[13]。

2.2 實驗方法

2.2.1 環(huán)境監(jiān)控試驗方法

2.2.1.1 菌落總數(shù)

將采集細菌后的營養(yǎng)瓊脂平皿置于35～37 ℃培養(yǎng)48 h，菌落計數(shù)[14]。

2.2.1.2 腸桿菌科

將采集細菌后的結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂平皿置于35～37 ℃培養(yǎng)24 h，菌落計數(shù)[15]。

2.2.2 生理生化鑒定

2.2.2.1 革蘭氏染色鏡檢

腸桿菌科為革蘭氏陰性桿菌，無芽孢。

2.2.2.2 氧化酶試驗

用鉑/銥接種環(huán)或玻璃棒(不要用鎳鉻接種環(huán))挑取單個菌落涂于浸濕氧化酶試劑的濾紙上，濾紙的顏色在10 s內(nèi)變成藍紫色，判為陽性反應(yīng)。

2.2.2.3 葡萄糖試驗

用接種針挑取少許氧化酶試驗結(jié)果為陰性的同一個菌落，穿刺于葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基內(nèi),于(36±1) ℃培養(yǎng)(24±2) h后，若試管內(nèi)的內(nèi)容物變?yōu)辄S色，判為陽性反應(yīng)。

2.2.3 菌種鑒定

將檢測出的腸桿菌科菌種分離純化后進行16S rDNA測序。

2.3 結(jié)果與分析

2.3.1 檢測結(jié)果

2.3.1.1 各生產(chǎn)車間腸桿菌科菌及菌落總數(shù)情況

生產(chǎn)過程中，對原料庫房、粉碎車間、調(diào)配車間、罐裝車間菌落總數(shù)和腸桿菌科菌菌落數(shù)量變化進行監(jiān)測，各車間環(huán)境中生產(chǎn)過程中腸桿菌科菌數(shù)量變化以及菌落總數(shù)變化見表2和表3。

表2 生產(chǎn)過程環(huán)境中菌落總數(shù)變化情況Table 2 Changes in the total number of colonies in environment during production

表3 生產(chǎn)過程環(huán)境中腸桿菌科菌數(shù)量變化情況Table 3 Changes in the number of Enterobacteriaceae in the environment during production

由表2和表3可知，各車間整體清潔度由低到高分別為：原料庫房<粉碎車間<調(diào)配車間<罐裝車間。各個車間加工過程中清潔度由生產(chǎn)前較高到生產(chǎn)過程中低再隨著生產(chǎn)結(jié)束逐漸增高。而腸桿菌科菌疑似菌數(shù)量均遠小于菌落總數(shù)，原料庫房空氣中最多，數(shù)量隨著生產(chǎn)開始逐漸增加，隨著生產(chǎn)結(jié)束而減少。

潔凈程度呈動態(tài)變化，由粉碎車間潔凈等級變化可以說明粉碎車間開始生產(chǎn)后可能由于人員活動和機器運轉(zhuǎn)導致原輔料和地面上微生物浮游在空氣中，導致空氣潔凈度降低，生產(chǎn)完成后空氣中的微生物逐漸減少，空氣潔凈度提高；調(diào)配車間由于機械化程度高，管道較多，無鼓風設(shè)備，操作人員較少，故空氣中微生物較少，潔凈度一直處于較高狀態(tài)；罐裝車間由于為生產(chǎn)最后環(huán)節(jié)，人員進入車間前需要經(jīng)過清潔間、風淋室等以達到盡量減少人員帶入菌的可能性，且罐裝車間為一個比較封閉獨立的空間，故罐裝車間空氣中腸桿菌科菌和菌總量均較少，潔凈度一直處于較高狀態(tài)。

2.3.1.2 設(shè)備腸桿菌科菌情況

由表4可知，罐裝車間設(shè)備表面及設(shè)備與食品接觸面均未檢出腸桿菌科菌，這可能是因為人員進入罐裝車間需經(jīng)過清潔間、風淋室，罐裝車間空間相對封閉獨立且人員管理良好，故罐裝車間空氣潔凈等級比較高，微生物含量少。

表4 罐裝車間設(shè)備腸桿菌科菌測定結(jié)果Table 4 Detection results of Enterobacteriaceae in equipment of canned workshop

2.3.1.3 操作人員腸桿菌科菌情況

由表5可知，罐裝車間操作人員在清潔前，只有2號操作人員帶有腸桿菌科菌，但清潔后，檢測結(jié)果為0，說明清潔方法能有效殺菌。罐裝人員在完成清潔后人員手部均未攜帶腸桿菌科菌，生產(chǎn)過程中檢測結(jié)果顯示人員均未攜帶腸桿菌科菌，說明生產(chǎn)過程中清潔頻率合適，工作5 h后有1人攜帶了腸桿菌科菌，其余2人均未攜帶腸桿菌科菌，這可能與個人習慣有關(guān)。

表5 罐裝車間操作人員腸桿菌科菌測定結(jié)果Table 5 Detection results of Enterobacteriaceae of production personnel in canned workshop

2.3.2 腸桿菌科菌鑒定結(jié)果

2.3.2.1 生理生化鑒定結(jié)果

腸桿菌科菌疑似菌鑒定結(jié)果見表6。

表6 腸桿菌科菌疑似菌鑒定結(jié)果Table 6 Identification results of suspected Enterobacteriaceae bacteria

2.3.2.2 分子生物學鑒定結(jié)果

部分腸桿菌科菌疑似菌16S rRNA序列PCR擴增電泳圖見圖1。

圖1 部分腸桿菌科菌疑似菌16S rRNA序列PCR擴增電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR amplification with 16S rRNA sequence of some suspected Enterobacteriaceae bacteria

將條帶清晰的PCR擴增產(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果經(jīng)NCBI比對，確定各菌株的分類地位，結(jié)果見表7。

表7 腸桿菌科菌疑似菌16S rDNA測序結(jié)果Table 7 16S rDNA sequencing results of suspected Enterobacteriaceae bacteria

由表7可知，對香辣醬各生產(chǎn)車間、生產(chǎn)人員主要原輔料辣椒、花椒檢測出的菌種進行分離純化經(jīng)16S rDNA測序結(jié)果可知，分離出14株菌株，其中致病菌13株。具體為腸桿菌科致病細菌斯氏普羅威登斯菌(Providenciastuartii)、奧斯陸莫拉氏菌(Moraxellaosloensis)、香坊腸桿菌(Enterobacterxiangfangensis)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)；2株不動桿菌屬(Acinetobactersp.)、2株鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)、阿爾塔米拉金色單胞菌(Aureimonasaltamirensis)、棲麥假單胞菌(Pseudomonasoryzihabitans)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)均為致病細菌；紅綬曲霉(Aspergillusnomius)為致病菌；根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)為非致病菌。

3 香辣醬生產(chǎn)過程中HACCP體系建立

3.1 香辣醬生產(chǎn)過程中腸桿菌科菌的危害分析

根據(jù)各生產(chǎn)車間及生產(chǎn)環(huán)節(jié)的腸桿菌科菌數(shù)量變化，在腸桿菌科菌溯源分析和表8香辣醬生產(chǎn)過程中腸桿菌科菌危害分析表基礎(chǔ)上，結(jié)合關(guān)鍵控制點(CCP)判斷樹(見圖2)，對辣醬生產(chǎn)過程進行危害分析(見表8)。

圖2 香辣醬生產(chǎn)過程中腸桿菌科菌的CCP判斷樹Fig.2 CCP judgement tree of Enterobacteriaceae in the production process of spicy sauce

表8 香辣醬生產(chǎn)過程中腸桿菌科菌危害分析Table 8 Hazard analysis of Enterobacteriaceae in the production process of spicy sauce

續(xù) 表

3.1.1 原輔料驗收

原輔料初始微生物含量會很大程度上影響原輔料在儲存過程中微生物的基數(shù)，直接影響原輔料質(zhì)量，進而影響產(chǎn)品質(zhì)量?？刂圃o料驗收時微生物含量，有利于原輔料后期儲存和產(chǎn)品質(zhì)量的提高，故將原輔料驗收確定為關(guān)鍵控制點之一。

3.1.2 原料儲存

儲存環(huán)境對原輔料在儲存過程中腸桿菌科菌的生長增殖有很大影響，從原料儲存環(huán)境的溫度、濕度及原輔料本身水分含量等方面優(yōu)化儲存環(huán)境可以有效控制原輔料在儲存過程中腸桿菌科菌的生長繁殖，提高原輔料質(zhì)量，故將原料儲存確定為關(guān)鍵控制點之一。

3.1.3 醬體調(diào)配

香辣醬在生產(chǎn)調(diào)配過程中，為提高產(chǎn)品口感和質(zhì)量會適量添加食品添加劑，食品添加劑的使用不規(guī)范會直接影響食品安全，食品添加劑使用應(yīng)嚴格按照GB 2760-2014[16]標準。故將香辣醬調(diào)配確定為關(guān)鍵控制點之一。

3.1.4 香辣醬罐裝

香辣醬罐裝是暴露在空氣中進行的，因此產(chǎn)品質(zhì)量與產(chǎn)品在罐裝過程中生產(chǎn)環(huán)境質(zhì)量密切相關(guān)。生產(chǎn)環(huán)境中的微生物含量直接影響生產(chǎn)過程中半成品中微生物含量，進而影響產(chǎn)品質(zhì)量?？刂品鬯檐囬g生產(chǎn)環(huán)境中微生物含量對產(chǎn)品質(zhì)量尤為重要。故將香辣醬粉碎確定為關(guān)鍵控制點之一。

3.1.5 操作人員

香辣醬生產(chǎn)為半自動化生產(chǎn)，從生產(chǎn)開始到生產(chǎn)完成過程中某些環(huán)節(jié)需要操作人員完成，需要接觸到半成品、成品，操作人員攜帶的微生物含量也會影響產(chǎn)品質(zhì)量。給操作人員定時進行殺菌清潔，有利于產(chǎn)品質(zhì)量。故將操作人員作為關(guān)鍵控制點之一。

3.2 香辣醬生產(chǎn)腸桿菌科菌的HACCP計劃表建立

在表8的危害分析及關(guān)鍵控制點和糾偏措施的基礎(chǔ)上建立HACCP計劃表，必須高度重視糾偏措施和驗證程序的設(shè)置，及時完整各檔案記錄，驗證程序是為了考察HACCP體系中CCP點是否保持在受控狀態(tài)[17]，出現(xiàn)偏差時及時采取恰當糾偏措施，嚴格按照HACCP計劃表操作，最終達到提高產(chǎn)品質(zhì)量安全和降低食品危害的目的。香辣醬生產(chǎn)過程中的HACCP計劃表見表9。

表9 富順香辣醬生產(chǎn)過程中針對腸桿菌科菌的HACCP計劃表Table 9 HACCP schedule for Enterobacteriaceae in production of Fushun spicy sauce

4 小結(jié)

HACCP體系是國際上共同認可和接受的食品安全保證體系，可通過控制食品生產(chǎn)過程中關(guān)鍵點有效保護食品免受可能發(fā)生的危害[18-19]，是適用于各類食品企業(yè)的簡便、易行、合理、有效的控制體系[20]。HACCP體系能通過控制食品生產(chǎn)環(huán)節(jié)，達到提高最終產(chǎn)品質(zhì)量的目的，是能控制潛在危害的有效的預防性方法，是食品生產(chǎn)更為安全、成本更低的質(zhì)量控制方法。對富順香辣醬生產(chǎn)過程中的各個環(huán)節(jié)的腸桿菌科菌污染情況調(diào)查分析，對腸桿菌科菌危害來源以及危害程度，依據(jù)CCP 判斷樹，確定其生產(chǎn)關(guān)鍵控制點分別為：原輔料驗收、原料儲存、香辣醬粉碎、香辣醬調(diào)配和操作人員，并對關(guān)鍵控制點設(shè)定控制措施，建立HACCP體系，為富順香辣醬的食品安全奠定基礎(chǔ)。