胡玉璐，姜百靈，陳 凌，王海崗，曹曉寧，王瑞云，喬治軍

（1.山西農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)業(yè)基因資源研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室/雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點實驗室，山西 太原 030031）

黍稷，又名為黍（Panicum miliaceumL.），是我國傳統(tǒng)的糧食作物，抗旱能力極強，適宜栽種在干旱以及半干旱地區(qū)，在我國的北方尤其在西北地區(qū)非常適宜種植[1-3]。黍稷的栽種在我國旱作農(nóng)業(yè)、鹽堿地的開發(fā)利用和救災補種中，發(fā)揮著十分重要的作用[4]。黍稷具有上萬年的栽培歷史，多篇歷史文獻資料曾記載黍稷栽種在我國發(fā)展上的重要性[5-6]。在當今日益追求健康飲食的社會生活中，雜糧因其膳食纖維豐富等原因倍受追崇，黍稷作為五谷雜糧之一，其營養(yǎng)成分豐富，不僅含有蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和礦物質(zhì)元素等人體基本營養(yǎng)素，且這類營養(yǎng)素含量普遍高于小麥、大米等我們較常食用的谷類[7-8]。在近些年的研究中，人們認識到黍稷具有的營養(yǎng)價值很高，也能達到一定的保健功效，是較為經(jīng)濟、實惠、安全、有療效的食療食品，其開發(fā)的前景十分廣闊[9]。

SSR（Simple sequence repeat，簡單序列重復）分子標記法具有分布均勻、數(shù)量豐富、穩(wěn)定性好、技術相對完善等優(yōu)點，主要在物種的基因型鑒定與品種保護、種子的純度評價和種質(zhì)保存、分子標記輔助選擇育種、資源鑒定等領域中應用。SSR標記也是目前應用較為廣泛的遺傳標記技術[10]，在花生[11]、花椰菜[12]、棉花[13]、高粱[14]等多種作物種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析中應用。SSR標記也能從DNA水平直接鑒定出品種之間的遺傳差異[15]。國際植物新品種保護聯(lián)盟（UPOV）利用SSR和SNP（Single nucleotide polymorphism，單核酸多態(tài)性）作為分子標記構(gòu)建作物品種DNA指紋數(shù)據(jù)庫[16]。SSR標記結(jié)合毛細管電泳技術，具有的高通量、高精度、高效率等優(yōu)點，可用于大量材料的檢測評定，在大豆[17]、玉米[18]、小麥[19]、水稻[20]、柑橘[21]、菜豆[22]等作物品種的DNA指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建中應用。DNA條形碼就是基于在SSR分子標記技術，將種間基因水平差異用數(shù)字轉(zhuǎn)化成條形碼的形式，使品種有一個由特定數(shù)字組成的代碼，對種質(zhì)資源的知識產(chǎn)權(quán)的保護和管理具有重要作用[23-25]。DNA條形碼自2003年首次提出后，已在糧食作物（小麥和玉米等）、水果（蘋果和桃等）和油料作物（芝麻、花生等）中廣泛應用，使資源實現(xiàn)了數(shù)字化和網(wǎng)絡化管理。

我國種質(zhì)資源庫已有黍稷資源9 885份，地方品種占99.4%，育成品種占0.6%，種質(zhì)資源豐富，對黍稷資源的開發(fā)利用具有重大意義[26]。由于黍稷新資源的不斷采集和引進，種質(zhì)資源的交流越來越頻繁，導致農(nóng)產(chǎn)品品種、良種、地方品種和野生品種之間出現(xiàn)大量的同源異義現(xiàn)象，農(nóng)家品種流通不足，無法發(fā)揮出優(yōu)良品種的最大價值，造成種質(zhì)資源嚴重浪費，極大地影響了資源的采集和整理效率[27]。因此，創(chuàng)建準確可靠且操作便捷的資源鑒定系統(tǒng)勢在必行，需為黍稷品種制定一份專屬的DNA分子身份證，以便更好的開發(fā)和利用黍稷種質(zhì)資源[28]。在目前研究中，已有陸徐忠等[29]從48對SSR熒光引物中篩選出12對作為核心引物，構(gòu)建了安徽省水稻品種127個分子指紋圖譜。侯麗媛等[30]從16對熒光SSR引物中篩選出7對引物，構(gòu)建了包括蘋果新品種赤霞在內(nèi)的20個品種的分子識別卡。黍稷作為一種小雜糧，其分子身份證的構(gòu)建報道極少。將條形碼引入黍稷資源管理，編輯黍稷資源信息，使其具有特定的數(shù)字編碼，可以解決目前存在的問題，有助于保護種質(zhì)資源的知識產(chǎn)權(quán)[31-33]。

本研究采用SSR分子標記法，選取中國北方具有代表性的20份黍稷材料，利用14對高基元引物，擬構(gòu)建20份黍稷資源的分子身份證，為黍稷資源的高效分類和應用提供一定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗選用中國北方大部分地區(qū)20份有顯著差異的黍稷材料，山西?。?份）、陜西?。?份）、黑龍江（1份）、內(nèi)蒙古（4份）、河南（1份）、寧夏（3份）、甘肅省（4份）、和青海?。?份）8個省共20份黍稷資源進行種植，于三葉期取葉片0.3 g，液氮速凍保存至-80℃冰箱。20份材料如表1所示。

1.2 試劑和儀器

試劑：氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇瓊脂糖、0.5×TBE電泳緩沖液、6×DNA loading buffer、dd H2O、2×TaqPCR MasterMix含染料、30%的丙烯酰胺、TBE電泳緩沖液、過硫酸銨、TEMED、50 bp Marker、AgNO3、Na OH、甲醛CTAB裂解液。

儀器：離心機、冰箱、BIO-GENER、聚丙烯酰胺凝膠電泳儀、高壓滅菌鍋、高速冷凍離心機、基因擴增儀、渦旋儀、Nanodrop ND-1000核酸濃度檢測儀、微波爐、瓊脂糖凝膠電泳儀、Bio-Rad凝膠成像儀、移液槍。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA提取和檢測 剪取三葉期葉片，采用改良CTAB法[34]提取基因組DNA。利用NanodropND-1000核酸濃度檢測儀檢測DNA的濃度和純度，用瓊脂糖凝膠電泳以檢測DNA的完整性[35]。

表1 20份黍稷試驗材料Tab.1 The detail of 20 broomcorn millet accessions in this experiment

1.3.2 引物篩選、PCR擴增及產(chǎn)物檢測 用14對高基元引物（表2）擴增地理來源差異較大的20份黍稷資源，篩選條帶清晰、擴增穩(wěn)定且多態(tài)性較高的引物用于構(gòu)建分子身份證。20μL PCR體系含10μL 2×MasterMix（中 科 瑞 泰2×Taq PCR MasterMix含染料）、0.8μL正向引物、0.8μL反向引物、7.4μL dd H2O和1μL DNA模板。反應程序為94℃4 min；94℃40 s，退火溫度40 s，72℃1 min，36個循環(huán)；72℃8 min[28]。

表2 SSR引物的序列及退火溫度Tab.2 Sequence of SSR primers and annealing temperature

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)PCR擴增條帶的基因組數(shù)據(jù)，有條帶讀“1”，無條帶讀“0”。用PowerMarker 3.25[36]軟件計算每個引物的多態(tài)性信息含量指數(shù)（PIC），用PopGen 1.32[37]計算不同樣品間的Nei's遺傳距離。利用東北農(nóng)業(yè)大學開發(fā)的ID Analysis 4.0軟件建立分子身份證。輸入相應的字符串并使用聯(lián)機條形碼生成器（http://barcode.cnaidc.com/app/html/bcgcode128.php）產(chǎn)生DNA條形碼；黍稷種質(zhì)基本信息及身份證通過在線二維碼輸入技術（https://cli.im/）產(chǎn)生相應的DNA二維碼。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗SSR的引物篩選結(jié)果

從北方黍稷栽培區(qū)選取黍稷材料共20份，對五、六堿基引物共14對SSR引物篩選，結(jié)果表明，材料相似系數(shù)為0.8，缺失引物占比為50%。其中,有4對引物與其他引物相似系數(shù)過高，被剔除。10對引物能夠擴增出條帶清晰、穩(wěn)定性好、多態(tài)性高的引物，可用于分子身份證的構(gòu)建的核心引物。

2.2 引物多態(tài)性及遺傳參數(shù)分析

用10對引物對20份黍稷種質(zhì)進行了擴增。由表3可知，在20份材料的10個基因座中檢測到30個等位基因，每個基因座中檢測到3個等位基因（平均3.000 0）；有效等位變異（Na）為1.662 3（RYW7）~2.792 3（RYW12），平均為2.455 3；Shannon多樣性指數(shù)（I）為0.702 9（RYW7）~1.088 0（RYW2），平均值為0.958 8；雜合度（Ho）為0.500 0（RYW7）~0.823 5（RYW12），平均值為0.686 6；期望雜合度（He）為0.411 3（RYW7）~0.686 2（RYW2），平均 值為0.602 4；Nei's的基因多樣性指數(shù)（Nei）為0.398 4（RYW7）~0.659 8（RYW2），平均值為0.582 8；多態(tài)信息含量（PIC）在0.488 6（RYW3）~0.776 6（RYW8），平均值為0.629 8。

表3 10個SSR的遺傳多樣性參數(shù)Tab.3 Genetic diversity parameters of 10 SSR markers

2.3 北方栽培區(qū)黍稷的DNA分子身份證構(gòu)建

本試驗采用多個引物的等位基因組合來劃分品種，獲得分子身份證的引物為RYW10、RYW6、RYW7、RYW5、RYW1、RYW2、RYW8和RYW3共8對引物可將全部黍稷材料區(qū)分開來。將10對引物用排列組合方式構(gòu)建DNA分子身份證的即字符串DNA分子身份證。各品種詳細編碼如表4所示，最終獲得各品種的二維碼和條形碼表示其DNA分子身份證（圖1）。以表4中編號1材料為例，其字符串DNA分子身份證為10111110，表示在上述引物順序下材料1中在引物RYW10顯示有條帶、RYW6顯示無條帶、RYW7顯示有條帶，依次類推，到引物RYW3無條帶，即黍稷材料1的字符串DNA分子身份。

表4 20份黍稷資源的分子身份證編碼Tab.4 Code of molecular ID of 20 broomcorn millet resources

3 討論

3.1 SSR遺傳多樣性衡量參數(shù)

黍稷是一種遺傳變異多樣的古老作物，已有大量相關研究。前人研究表明，黍稷基因多樣性指數(shù)分別為0.736 0、0.768 6、0.628 4、0.841 5、0.847 8和0.859 9，多態(tài)性信息含量分別為0.554 4、0.457 3、0.427 9、0.587 4、0.471 4和0.566 7[25-26，35，38-40]。本研究對8個省的黍稷材料進行了分析，數(shù)據(jù)在其范圍中。

3.2 DNA指紋圖譜和分子身份證編碼

DNA指紋是一種通過比較電泳指紋的差異來區(qū)分生物個體差異的方法。然而，由于DNA指紋圖譜條帶多，人工比對和解釋費時費力，統(tǒng)計分析繁瑣，限制了大規(guī)模物種鑒定的應用。DNA分子身份證是以前者為基礎，采用不同的編碼方法對電泳圖進行數(shù)字化，得到字符串結(jié)果，并輔以條形碼、二維碼等科學的表示方法，使品種比對更加高效、方便、準確，克服了手工比對指紋繁瑣、效率低下的缺點，廣泛應用于品種鑒定。以往的研究利用SSR標記構(gòu)建品種的分子識別卡，常用的編碼方法有以下3種：0/1編碼型，根據(jù)電泳條帶有無，賦值1或0，形成0和1串[41]。等位基因分配編碼型，編碼擴增的等位基因[42]?；蛐捅恢付榫幋a類型，引物擴增的條帶被編碼[24]。本研究采用第1種凝膠電泳法進行編碼，具有編寫簡單、統(tǒng)計方便、字長適中、檢索方便等優(yōu)點。

3.3 PAGE銀染法構(gòu)建DNA分子身份證的可行性研究

到目前為止，檢測SSR標記的方法主要有2種，即PAGE銀染法和熒光毛細管電泳法。楊文娟等[43]用這2種方法檢測了131份應用核心種質(zhì)，PAGE銀染法所得數(shù)據(jù)與毛細管電泳結(jié)果基本一致。另外，許多研究者對此進行了研究，試驗結(jié)果對PAGE方法是肯定的。另外，常規(guī)變性PAGE銀染法不需要昂貴的實驗儀器，試劑成本低，適合于少量物質(zhì)的分析。普通引物可以保存3~5 a，而熒光標記引物只能保存1~2 a，因此后者的合成成本遠高于前者。因此，在引物質(zhì)量可靠、試驗材料少、經(jīng)濟條件有限的前提下，采用PAGE銀染法構(gòu)建DNA分子身份證是可行的。

3.4 用高堿度引物構(gòu)建分子身份證

過去，低基元的SSR被用來構(gòu)建資源的分子身份證。張嘉等[44]從111對引物中篩選出29對SSR核心引物，最終用4對雙堿基引物構(gòu)建了66個中國芍藥分子識別卡。郭艷春等[45]結(jié)合高、低堿基引物構(gòu)建分子身份證，用12對熒光SSR引物組合（1、4、4、1、2對單堿基、二堿基、三堿基、四堿基和五堿基）構(gòu)建了61張黃麻核心種質(zhì)分子身份證。本研究用8對高堿基（4堿基重復基序）引物檢測了2個遺傳多樣性參數(shù)指標，即基因多樣性指數(shù)1.043 7和多態(tài)性信息含量0.690 5，均高于低堿基[25，46]。

4 結(jié)論

本試驗在14對SSR引物中篩選出10對適宜堿基引物對北方地區(qū)的20份黍稷種質(zhì)進行鑒定，將北方地區(qū)的黍稷種質(zhì)品種及其近緣野生種和育成品種的信息資料進行分類匯總，構(gòu)建了20份糜子種質(zhì)的條形碼DNA分子身份證和二維碼DNA分子身份證。