魏 欣，王萌皓，云少君，程艷芬，曹謹玲，常明昌，2，馮翠萍

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西省食用菌工程技術(shù)研究中心，山西 太谷 030801）

多糖作為一種生物活性大分子物質(zhì)，在維持人體機能、提高免疫、降血糖、降血脂、抗腫瘤等方面發(fā)揮著重要的作用[1]，多糖生物活性的發(fā)揮與受體對其的識別密切相關(guān)。Toll樣受體（TLRs）、C型凝集素樣受體等免疫識別受體是多糖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵，不僅可以識別多糖，與之結(jié)合觸發(fā)一系列下游信號傳導(dǎo)，還可以促進免疫相關(guān)細胞因子的釋放或基因的表達，激活機體免疫反應(yīng)。TLRs是一類跨膜受體，為介導(dǎo)識別病原體相關(guān)分子模式的Ⅰ型跨膜蛋白，主要在巨噬細胞和樹突狀細胞等吞噬細胞表達，能夠?qū)⒏袘?yīng)到的胞外信號，通過接頭蛋白傳遞到胞內(nèi)，使核內(nèi)相關(guān)基因得到表達，最終激活NF-κB、MAPKs下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[2]。此家族受體能識別多種配體，例如脂多糖、甘露聚糖、肽聚糖、脂肽、酶原、脂質(zhì)體酸、鞭毛蛋白等。不同TLRs的功能和作用不同，導(dǎo)致其在細胞上的表達位置也不同，其中TLR2和TLR4這2個與炎癥及免疫調(diào)節(jié)關(guān)系密切的受體分布于細胞表面，且是多糖的主要受體[3]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)靈芝多糖、豬苓多糖、巴氏蘑菇多糖[4-6]等均可通過TLR4發(fā)揮一定的免疫調(diào)節(jié)作用。TLR2結(jié)構(gòu)組成類似于其他Toll樣家族受體，廣泛存在于多種與免疫作用相關(guān)的細胞以及一些非免疫細胞中，與TLR2結(jié)合的配體較多，主要有脂多糖、肽聚糖、酵母多糖、脂蛋白等，且識別形式為同二聚體或者異二聚體，研究發(fā)現(xiàn)，許多植物或者細菌多糖是通過TLR2來介導(dǎo)的[3]。之前研究表明，猴頭菇多糖與羊肚菌多糖均可以通過TLR2受體提高巨噬細胞的吞噬活性[7-8]。YUE等[9]研究表明，阻斷TLR2表達，會減弱白芨多糖對人腎小球系膜細胞的抗炎作用，說明白芨多糖發(fā)揮抗炎作用與TLR2有關(guān)。閆慧丹[10]研究發(fā)現(xiàn)，TLR2是巨噬細胞RAW 264.7識別香菇多糖的主要受體之一。SU等[11]研究發(fā)現(xiàn)，灰樹花中β-葡聚糖可通過TLR2受體激活巨噬細胞，刺激細胞因子的產(chǎn)生，且其調(diào)節(jié)作用獨立于Dectin-1和CR3。LEE等[12]研究表明，蛹蟲草多糖可通過模式識別受體TLR2，介導(dǎo)MAPK和NF-κB信號通路，促進NO、TNF-α的產(chǎn)生并增強巨噬細胞的吞噬能力。盡管有關(guān)多糖免疫作用調(diào)節(jié)機制的研究已有很多，但不同來源的多糖因結(jié)構(gòu)不同，免疫作用的發(fā)揮機制亦有所不同。

廣葉繡球菌（Sparassis latifolia）作為珍稀名貴的食藥用菌之一，富含多糖、多酚、甾醇類等活性物質(zhì)，具有多種生物活性調(diào)節(jié)作用[13-16]，尤以多糖含量高達39.3%~43.6%，具有誘導(dǎo)樹突細胞的成熟、增強免疫活性等作用[17]。HARADA等[18]研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠發(fā)生白血病后，腹腔注射繡球菌多糖，可增加小鼠體內(nèi)免疫細胞數(shù)量，降低CD4+和CD8+T淋巴細胞的數(shù)量，提高細胞因子TNF-α、IL-6等的生成。KIM等[19]研究表明，繡球菌多糖能夠通過TLR4介導(dǎo)的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路MAPK和NF-κB，活化樹突細胞，激活機體免疫應(yīng)答。LEE等[20]研究發(fā)現(xiàn)，繡球菌多糖可以通過2種途徑促進NO的產(chǎn)生，其中一種是提高iNOS的分泌，第2種是通過MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品營養(yǎng)與安全課題組前期研究結(jié)果顯示，廣葉繡球菌酸性多糖[21]可通過TLR4受體激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，增加IL-6、TNF-α和IFN-β的分泌量，調(diào)節(jié)RAW 264.7細胞的免疫功能，但有關(guān)廣葉繡球菌中性多糖（Sparassis latifolianeutral Polysaccharides，SNP）的免疫調(diào)節(jié)作用及作用靶點的研究還罕見報道，對于SNP是否通過TLR2來介導(dǎo)發(fā)揮免疫活性目前還未有研究。

鑒于此，本試驗采用傳統(tǒng)水提法經(jīng)過分離純化后得到SNP組分，對其進行結(jié)構(gòu)表征，通過研究SNP處理后巨噬細胞RAW 264.7的增殖活力和巨噬細胞分泌的細胞因子的含量變化，以及經(jīng)TLR2受體的抗體處理巨噬細胞后其細胞因子的變化，對SNP影響巨噬細胞RAW 264.7細胞因子的分泌及TLR2是否介導(dǎo)該過程進行分析，旨在為SNP的進一步開發(fā)利用奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 供試廣葉繡球菌由山西省清徐縣太和食用菌栽培基地提供。

1.1.2 主要試劑及儀器設(shè)備 小鼠巨噬細胞RAW 264.7（中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心）；NO、TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-β試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；脂多糖（LPS）（Sigma公司）；乙醇、丙酮、乙醚、氯仿等均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器設(shè)備為PL3000冷凍干燥機（Thermo公司）、Spectra Max i3x酶標儀（Thermo公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 SNP的純化和分子量測定 采用水提醇沉法提取，并經(jīng)HZ-830大孔樹脂吸附后得到粗多糖，經(jīng)DEAE-52纖維素陰離子交換柱和Sepharose CL-6B凝膠柱的洗脫，分離純化得到SNP[22]。采用高效凝膠色譜法測定SNP的分子量大小。

1.2.2 SNP結(jié)構(gòu)和組成分析 采用FT-IR法測定SNP的紅外光譜特征，設(shè)定的掃描范圍為400~4 000 cm-1。采用IC法對SNP單糖組成進行測定，組分比值用各單糖的相對峰面積比值表示。

1.2.3 SNP對巨噬細胞RAW 264.7增殖活力的影響 參照文獻[21]，通過MTT法進行測定。具體步驟為：取細胞濃度為1.0×105個/mL的細胞接種于96孔板中培養(yǎng)過夜。設(shè)1.95、3.9、7.812 5、15.625、31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000、4 000μg/mL共12個不同質(zhì)量濃度梯度的SNP溶液，吸棄96孔板中舊培養(yǎng)基后加入多糖溶液，同時設(shè)對照組和調(diào)零組，每組設(shè)立6個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。將MTT加入每個反應(yīng)孔中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去MTT溶液，每孔加入DMSO，搖床15 min，酶標儀554 nm處測定吸光值。

1.2.4 SNP對巨噬細胞RAW 264.7細胞因子分泌量的影響 參照文獻[21]進行測定。具體步驟為：選擇細胞濃度為5.0×105個/mL的細胞過夜培養(yǎng)，使其貼壁后棄去舊培養(yǎng)基。將含有終質(zhì)量濃度為1μg/mL LPS、含有不同質(zhì)量濃度（62.5、125、250、500μg/mL）SNP和空白對照組的細胞培養(yǎng)液分別加到細胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)4個復(fù)孔，作用24 h后按照NO、IL-6、TNF-α、IFN-β試劑盒說明書，用ELISA法測定各組上清液中NO、IL-6、TNF-α、IFN-β的含量。

1.2.5 SNP對TLR2抗體作用后巨噬細胞RAW 264.7細胞因子分泌量的影響 參照文獻[21]進行測定。選擇細胞濃度為5.0×105個/mL過夜培養(yǎng)，使其貼壁后棄去舊培養(yǎng)基。用20μg/mL的TLR2抗體作用巨噬細胞1 h后棄去，將含有終質(zhì)量濃度為1μg/mL LPS、含有終質(zhì)量濃度為250μg/mL的SNP和空白對照組的細胞培養(yǎng)液，分別加入到細胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)4個復(fù)孔，作用24 h后收集細胞上清液。按照NO、IL-6、TNF-α、IFN-β試劑盒說明書，用ELISA法測定上清液中NO、IL-6、TNF-α、IFN-β的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

結(jié)果以平均值±標準差表示。通過Graphpad Prism 5.0軟件作圖；采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和鄧肯多重比較，以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的判定標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP的分離純化及分子量的測定

SNP的分離純化結(jié)果及分子量大小如圖1所示。

由圖1-A可知，繡球菌多糖經(jīng)DEAE-52分離得到的水相多糖組分再經(jīng)Sepharose CL-6B分子篩作用后，獲得1個吸收峰，收集并冷凍干燥得到中性多糖組分，SNP呈現(xiàn)單一對稱峰型，分離效果良好，為均一多糖；而高效凝膠色譜結(jié)果表明（圖1-B），得到的SNP純度較高，分子質(zhì)量（Mw）為3.2×105u。

2.2 SNP結(jié)構(gòu)和組成分析

由圖2-A可知，SNP在3 405.76 cm-1附近出現(xiàn)又寬又鈍吸收峰，是由于多糖分子之間或者分子內(nèi)部氫鍵O-H與N-H的伸縮振動造成的；2 929.8 cm-1附近出現(xiàn)峰是亞甲基-CH2-中C-H的伸縮振動；官能團COO-中的C=O的非對稱伸縮振動使得在1 631.67 cm-1處有強吸收峰；1 383.3、1 350 cm-1處的吸收峰是由于C-H的彎曲振動；醚鍵C-O-C和C-O-H中C-O的伸縮振動使吸收峰出現(xiàn)在1 200~1 000 cm-1，吡喃糖苷吸收峰出現(xiàn)在1 100~1 010 cm-1，SNP吸收峰出現(xiàn)在1 154.55、1 078.03、1 019.26 cm-1以及761 cm-1附近的吸收峰主要是通過C=C伸縮振動而引起的。1 730 cm-1附近沒有吸收峰表明SNP組成中不存在糖醛酸；在882、1 799 cm-1附近沒有吸收峰，表明SNP組成中不存在呋喃糖。如圖2-B所示，SNP的單糖組成為阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖，摩爾比為6∶ 12∶63∶10∶5。

2.3 SNP對巨噬細胞RAW 264.7增殖活力的影響

從圖3可以看出，SNP質(zhì)量濃度除在所設(shè)置的4 000μg/mL外，其他設(shè)定濃度均可促進巨噬細胞RAW 264.7的增殖，且SNP質(zhì)量濃度升高的條件下，增殖活力呈先升高后降低的趨勢；當SNP質(zhì)量濃度為250μg/mL時，巨噬細胞增殖活力最強。

2.4 SNP對巨噬細胞RAW 264.7細胞因子分泌量的影響

由圖4可知，與對照組相比，SNP組及LPS組中NO、IL-6、TNF-α、IFN-β等細胞因子分泌量均顯著或極顯著升高（P<0.05或P<0.01)；SNP質(zhì)量濃度為250μg/mL時分泌量最高，但各SNP組均弱于LPS的作用（P<0.05或P<0.01)。

2.5 TLR2抗體對SNP作用巨噬細胞RAW 264.7分泌細胞因子的影響

由圖5可知，無論巨噬細胞RAW 264.7是否經(jīng)TLR2抗體作用，與空白對照相比，SNP和LPS處理均極顯著增加了NO、IL-6、TNF-α和IFN-β細胞因子的分泌量（P<0.01）。值得注意的是，與未加TLR2抗體組相比，LPS處理后各細胞因子分泌量極顯著降低（P＜0.01）；而SNP處理盡管降低了各細胞因子分泌量，但除IL-6外差異均不顯著；空白對照在抗體處理前后的吞噬細胞的細胞因子分泌量無顯著差異。說明TLR2不是SNP的受體，SNP對巨噬細胞RAW 264.7細胞因子分泌量的影響不是通過TLR2受體調(diào)節(jié)的。

3 結(jié)論與討論

許多研究表明，食用菌多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性，是一種較好的天然免疫調(diào)節(jié)佐劑[23]。多糖的相對分子質(zhì)量是其發(fā)揮免疫活性的重要條件[21]，本試驗得到的SNP的分子質(zhì)量為3.2×105u，屬于活性多糖，具有免疫活性。食用菌多糖的免疫活性與其組成結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)，SNP的單糖是以摩爾比為6∶12∶63∶10∶5的阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖組成，高比例的葡萄糖和半乳糖使其能發(fā)揮較強免疫活性；紅外光譜表明，SNP分子中含有的大量醇羥基等活性基團可以降低其在水中的黏度，增強其溶解性，增大其與作用基團的接觸面積，從而使中性多糖的免疫效果增強。

巨噬細胞是免疫調(diào)節(jié)過程中對抗炎癥的重要效應(yīng)細胞，本研究發(fā)現(xiàn)，SNP在一定的濃度范圍內(nèi)可促進巨噬細胞增殖，當SNP質(zhì)量濃度為250μg/mL時，巨噬細胞增殖活力最強，NO、IL-6、TNF-α、IFN-β的分泌量最高，與空白對照差異極顯著（P＜0.01），但低于LPS處理的細胞因子分泌量，這與丁航等[24]發(fā)現(xiàn)的香菇多糖能刺激小鼠腹腔巨噬細胞活化，并使i NOS活性增加，釋放大量NO；劉用國等[25]發(fā)現(xiàn)的250、500μg/mL短葶山多糖可不同程度地提高腹腔巨噬細胞吞噬能力、趨化作用和分泌IL-6、TNF-α；張琳[26]研究發(fā)現(xiàn)，瑣瑣葡萄多糖可激活巨噬細胞，促進TNF-α、IFN-β的釋放的試驗結(jié)果一致。說明當機體受到刺激時，可通過分泌多種細胞因子或者趨化因子發(fā)揮免疫作用，但是當SNP濃度過高時，產(chǎn)生了與較低濃度下不同的免疫調(diào)節(jié)活性，表明SNP呈現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)的雙向作用，這可能是因為適量多糖的免疫調(diào)節(jié)活性較強，而過量的多糖會刺激巨噬細胞失控性地釋放多種炎性介質(zhì)，抑制其免疫活性的發(fā)揮，從而導(dǎo)致其免疫功能的下降[22]。

TLR2可介導(dǎo)多糖作用于巨噬細胞分泌NO、IL-6、TNF-α、IFN-β等物質(zhì)進行免疫調(diào)節(jié)[21]。本研究表明，SNP作用于TLR2抗體處理后的巨噬細胞RAW 264.7，其NO、TNF-α、IFN-β等細胞因子的分泌降低未呈現(xiàn)顯著性，推測TLR2可能不是識別SNP的免疫受體，可能由于多糖是以多環(huán)節(jié)、多靶點的方式發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的[27]，當多糖的某一結(jié)構(gòu)與不同的受體結(jié)合或某一受體與多糖的不同位點相結(jié)合時，其發(fā)揮的免疫作用不同；多糖不僅可以通過與受體結(jié)合促進巨噬細胞分泌細胞因子，還可以通過其他受體的介導(dǎo)促進巨噬細胞的清除功能，從而抑制細胞因子的產(chǎn)生[28]。此外，有研究表明，半乳糖呋喃?；鶄?cè)鏈在識別TLR2過程中顯示潛在作用[28-29]，而SNP不存在呋喃糖結(jié)構(gòu)，TLR2也可能作為配體輔助其他TLRs受體聯(lián)合作用，從而發(fā)揮免疫功能，究竟SNP與哪個TLRs結(jié)合發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用及具體的調(diào)節(jié)機制還有待進一步探討。

綜上所述，對廣葉繡球菌經(jīng)分離純化得到的SNP由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖構(gòu)成，摩爾比為6∶12∶63∶10∶5，分子質(zhì)量為3.2×105u。SNP可通過調(diào)節(jié)NO、IL-6、TNF-α、IFN-β等細胞因子的分泌來促進巨噬細胞RAW 264.7的增殖，但這一作用不是通過TLR2受體介導(dǎo)。SNP發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的機制還有待進一步深入研究。