鄭若菲， 劉子嘉， 努爾尼薩·喀斯木， 王冬梅

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院;陜西省經(jīng)濟(jì)植物開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100)

植物飲料營(yíng)養(yǎng)豐富、安全性高且具有保健效果，已成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。復(fù)合植物飲料是以多種植物或植物抽提物為原料，混合復(fù)配后，經(jīng)加工或發(fā)酵制成的飲料，其可顯著提高植物飲料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與生物活性[1]。復(fù)合植物飲料的制備也可以有效改善某些植物飲料中存在的可溶性固體含量高、酸度高、苦味強(qiáng)與滋味差的問(wèn)題[2]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究者以植物提取物為原料制備復(fù)合飲料。黃杰等[3]制備了一種香蕉胡蘿卜復(fù)合果蔬汁，口感良好，具有一定的抗氧化活性。李大成等[4]采用響應(yīng)面法優(yōu)化桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料制備工藝，獲得了具有強(qiáng)抗氧化活性的復(fù)合飲料。許多植物飲料中存在獨(dú)特的抗氧化成分，單一成分的抗氧化活性往往比混合物小，某些抗氧化成分復(fù)配后的活性并不是簡(jiǎn)單的相加關(guān)系，而是表現(xiàn)出減毒、增效甚至產(chǎn)生單一活性成分不具備的藥理活性，說(shuō)明成分間存在著抗氧化協(xié)同效應(yīng)，復(fù)配有助于提高抗氧化活性[5]。因此可通過(guò)幾種低劑量的植物提取物復(fù)配來(lái)獲得較強(qiáng)的抗氧化活性，以防止因使用大量單一提取物而產(chǎn)生的副作用[6]。

花椒(Zanthoxylumbungeanum)為蕓香科花椒屬植物，已有140多種化合物從花椒中分離出來(lái)，包括生物堿、萜類、黃酮等物質(zhì)[7-9]。其中，花椒葉黃酮提取物中的槲皮苷、金絲桃苷、阿福豆苷和蘆丁的含量較高，且為花椒葉抗氧化活性的主要貢獻(xiàn)成分，具有極高的開(kāi)發(fā)潛力[10]。花椒葉常被用作調(diào)料或炒制成椒茶飲用，也可用于制作麻味休閑食品或抗氧化口服液[11-13]。同時(shí)，花椒葉可被用作疏散劑、止疼藥和祛風(fēng)藥物等，具有一定醫(yī)學(xué)價(jià)值[14]?；ń啡~作為花椒種植中的副產(chǎn)物，資源豐富。但迄今為止，大部分花椒葉，特別是花椒老葉常被進(jìn)行丟棄處理，沒(méi)有得到合理的資源化利用，直接降低了花椒的綜合利用價(jià)值。金露梅(Potentillafruticosa)又名藥王茶，其葉常作為茶應(yīng)用，具有清熱解暑、調(diào)經(jīng)健脾、益腦清心等功效。此外，金露梅葉含有豐富的黃酮、多糖、鞣質(zhì)和醌類等活性物質(zhì)[15]，具有顯著的抗氧化、降血糖、抗炎和抗?jié)兓钚裕情_(kāi)發(fā)保健飲料的優(yōu)良原料[16-18]。同時(shí)，金露梅葉與銀杏提取物復(fù)配具有顯著的抗氧化協(xié)同效應(yīng)[18]，但其與花椒葉的抗氧化協(xié)同作用還未見(jiàn)報(bào)道且無(wú)深度應(yīng)用。本研究以花椒葉、金露梅葉為原料，旨在制備一種原料新穎、口感良好、風(fēng)味獨(dú)特、有效成分明確且具有一定抗氧化活性的復(fù)合飲料，不但可拓展花椒葉和金露梅葉的綜合利用領(lǐng)域，還可開(kāi)發(fā)高附加值產(chǎn)品，增加可再生資源的利用，以期促進(jìn)花椒與金露梅產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)葉和金露梅(PotentillafruticosaL.)葉于2020年9月采集自陜西鳳州和青海互助，由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物標(biāo)本室鑒定。采摘后選擇潔凈無(wú)病蟲害的葉片陰干，粉碎，經(jīng)篩分取粒徑為360 μm以下的部分，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

D101型大孔吸附樹(shù)脂，滄州寶恩吸附材料科技有限公司；Agilent HPLC 1260高效液相色譜儀；澳柯瑪(AUCMA)BC/BD 217V低溫冷藏冰柜；上超F(xiàn)S-1200N超聲輔助提取器；上博BSG-300光照培養(yǎng)箱；國(guó)美HH- 6數(shù)顯恒溫水浴鍋；上博YXQ-LS-50G立式壓力蒸汽滅菌鍋；遠(yuǎn)紅外干燥箱等。

甲醇、乙腈，色譜純，美國(guó)Tedia公司；福林酚、氨芐青霉素、氯霉素、四環(huán)素、DPPH、TPTZ、ABTS、Trolox、無(wú)水乙醇、丙酮、沒(méi)食子酸、NaOH、NaBH4、NaCl、KCl、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、FeCl3·6H2O、AlCl3、Na2CO3、CH3COOH、HCl、甲醇、石油醚、香蘭素、四氯苯醌、四氫呋喃，均為市售分析純。

1.2 花椒葉提取物與金露梅葉提取物的制備

稱取50.00 g花椒葉粉加入1 250 mL體積分?jǐn)?shù)60%乙醇水溶液，50 ℃下超聲波輔助提取15 min，超聲波功率400 W，重復(fù)2次。提取液濃縮后，過(guò)D101樹(shù)脂柱，以30%、 70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，濃縮至干，制得花椒葉提取物(ZBE)，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取50.00 g金露梅葉粉加入750 mL體積分?jǐn)?shù)50%乙醇水溶液，60 ℃超聲波輔助提取30 min，超聲波功率400 W，重復(fù)2次。提取液濃縮后，過(guò)D101樹(shù)脂柱，以30%、 70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，濃縮至干，制得金露梅葉提取物(PFE)，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 確定花椒葉和金露梅葉提取物最佳復(fù)配比

1.3.1復(fù)配物的制備 花椒葉提取物和金露梅葉提取物質(zhì)量濃度均為1.0 g/L，二者混合后的復(fù)配物質(zhì)量比分別為2 ∶1、 3 ∶1、 4 ∶1和5 ∶1。將每個(gè)混合后的樣液倍半稀釋，各得10個(gè)不同濃度梯度的樣品溶液，并測(cè)定其DPPH自由基(DPPH·)清除能力，測(cè)定結(jié)果以清除50%DPPH·時(shí)所需樣品濃度(IC50)表示。以復(fù)配物中兩種樣品濃度之和為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)作圖，計(jì)算復(fù)配物的DPPH·清除率。

1.3.2等輻射分析法 采用等輻射分析法探討ZBE和PFE的復(fù)配效果，根據(jù)花椒葉提取物(A)和金露梅葉提取物(B)復(fù)配物的抗氧化活性判斷兩種物質(zhì)的相互作用類型[19]。等輻射分析法是利用等輻射分析圖來(lái)分析兩種提取物之間的協(xié)同、相加或拮抗等相互作用，其具體做法是將兩種提取物單獨(dú)作用下的抗氧化活性值標(biāo)繪在X、Y軸上，兩點(diǎn)相連成相加線，并于相加線兩側(cè)繪制95%置信區(qū)間，若復(fù)配后抗氧化活性值落在該線上，則表示作用相加；若在相加線左側(cè)，則為協(xié)同；若在相加線右側(cè)，則為拮抗，較低的抗氧化活性值表明其具有較高的DPPH·清除活性。通過(guò)計(jì)算可得到等輻射分析法的理論值(E)，即A、B復(fù)配后的理論DPPH·清除活性，計(jì)算方法如式(1)所示：

(1)

式中： IC50，A—A單獨(dú)使用時(shí)的IC50值；R—A、B單獨(dú)使用時(shí)的效價(jià)比，即R=IC50，A/IC50，B；P1—A的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；P2—B的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，P2=1-P1。

引入相互作用指數(shù)(γ)進(jìn)一步衡量不同配比的影響，公式如式(2)所示：

(2)

式中：α，β—分別為配伍達(dá)到一定效果時(shí)A、B的IC50；a，b—分別為A、B單獨(dú)作用達(dá)到一定效果時(shí)的抗氧化活性值。

若γ=1，說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)中，A物質(zhì)和B物質(zhì)的抗氧化活性具有相加作用；若γ<1，說(shuō)明具有協(xié)同作用，γ值越小協(xié)同作用越強(qiáng)；若γ>1，說(shuō)明具有拮抗作用，即較小的γ表明具有較強(qiáng)的協(xié)同作用。

1.4 花椒葉-金露梅葉復(fù)合飲料加工工藝

1.4.1復(fù)配物添加量 由于提取物添加量超過(guò)1%時(shí)，會(huì)產(chǎn)生沉淀。因此，采用單因素試驗(yàn)研究復(fù)配物添加量分別為0.05%、 0.1%、 0.15%和0.2%(以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，下同)時(shí)飲料的總酚(TFC)、總黃酮(TPC)含量及其抗氧化活性，以確定復(fù)配物的最佳添加量。

1.4.2增稠劑添加量 采用3因素3水平正交試驗(yàn)研究飲料中增稠劑的添加量。分別加入不同量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)(0.20%、 0.25%、 0.30%)、黃原膠(0.02%、 0.03%、 0.04%)和β-環(huán)糊精(0.40%、 0.50%、 0.60%)進(jìn)行調(diào)配。以沉降率為評(píng)價(jià)指標(biāo)(沉降率=沉淀物質(zhì)量/樣品質(zhì)量×100%)，確定增稠劑的最佳添加量。

1.4.3甜味劑添加量 采用3因素3水平正交試驗(yàn)研究飲料中甜味劑的添加量。分別加入不同量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的木糖醇(6.00%、 7.00%、 8.00%)、阿斯巴甜(0.005%、 0.010%、 0.015%)和檸檬酸(0.050%、 0.010%、 0.150%)進(jìn)行調(diào)配。采用模糊綜合評(píng)價(jià)法進(jìn)行感官評(píng)價(jià)[20]，以確定甜味劑的最佳添加量。

1.4.4最終配方與加工工藝 按照正交試驗(yàn)確定的最佳配方對(duì)飲料進(jìn)行調(diào)配，于水中70 ℃超聲波加速溶解10 min，超聲波功率為400 W，冷藏12 h，4 000 r/min離心5 min，取上層清液，加入0.05%的山梨酸鉀。采用模糊綜合評(píng)價(jià)法再次進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，驗(yàn)證最終配方可行性并確定加工工藝。

1.4.5滅菌工藝的確定 花椒葉-金露梅葉復(fù)合飲料無(wú)菌包裝后，分別采用微波滅菌(30、 60、 90 s)、高壓蒸汽滅菌(15 min、 121 ℃)或煮沸滅菌(15、 20、 25、 30 min)對(duì)其進(jìn)行滅菌，滅菌后冷卻儲(chǔ)存在 4 ℃下。比較不同滅菌工藝對(duì)滅菌效果、飲料性狀、活性成分含量的影響，確定最佳滅菌工藝。

1.5 花椒葉-金露梅葉復(fù)合飲料化學(xué)穩(wěn)定性試驗(yàn)

根據(jù)中國(guó)藥典委員會(huì)的規(guī)定[21]，通過(guò)高溫試驗(yàn)、強(qiáng)光試驗(yàn)和加速試驗(yàn)測(cè)定煮沸滅菌后花椒葉-金露梅葉復(fù)合飲料的化學(xué)穩(wěn)定性。試驗(yàn)數(shù)據(jù)的浮動(dòng)范圍不超過(guò)5%，即可視為穩(wěn)定性試驗(yàn)合格。

飲料密封放于潔凈的無(wú)菌包裝罐中，在(60±2) ℃的高溫下儲(chǔ)存10 d，在第5、 10天測(cè)定飲料活性成分含量、抗氧化活性、微生物含量和感官指標(biāo)。

飲料密封放于潔凈的無(wú)菌包裝罐中，在(4 500±500) lx的強(qiáng)光照度下密封儲(chǔ)存于25 ℃下10 d，在第5、 10天測(cè)定飲料活性成分含量、抗氧化活性、微生物含量和感官指標(biāo)。

加速試驗(yàn)是在特定條件下進(jìn)行的質(zhì)量破壞性試驗(yàn)，其目的是在較短的時(shí)間內(nèi)了解飲料的物理、化學(xué)和生物學(xué)方面的變化，為飲料配方設(shè)計(jì)、質(zhì)量評(píng)價(jià)和包裝、運(yùn)輸、貯存條件等提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并初步預(yù)測(cè)樣品的穩(wěn)定性。飲料密封放于潔凈的無(wú)菌包裝罐中，在溫度(40±2) ℃，相對(duì)濕度(75±5)%下儲(chǔ)存180 d。在第30、 60、 90和180 d測(cè)定飲料活性成分含量、抗氧化活性、微生物含量和感官指標(biāo)。

1.6 花椒葉-金露梅葉復(fù)合飲料保質(zhì)期的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證

1.6.1保質(zhì)期的預(yù)測(cè) 飲料中含有多種微生物，可產(chǎn)生各種各樣的生物化學(xué)反應(yīng)。微生物受溫度影響較大，據(jù)此，可利用阿倫尼烏斯公式來(lái)預(yù)測(cè)溫度對(duì)飲料保質(zhì)期長(zhǎng)短的影響，反應(yīng)速率常數(shù)比值(Q10)是保質(zhì)期時(shí)間比。準(zhǔn)備4批滅菌后的飲料樣品分別儲(chǔ)存在35、 45、 55和65 ℃下，每5天測(cè)定一次飲料的活性成分含量、抗氧化活性、微生物含量和感官指標(biāo)，各檢測(cè)項(xiàng)目的數(shù)據(jù)浮動(dòng)范疇不超過(guò)數(shù)據(jù)的5%即可認(rèn)定為合格[22]。通過(guò)測(cè)量不同溫度條件下飲料保質(zhì)期的長(zhǎng)短，按式(3)計(jì)算出Q10，則可根據(jù)35 ℃時(shí)的保質(zhì)期預(yù)測(cè)該飲料在常溫(25 ℃)條件下的保質(zhì)期。

(3)

式中：f1—T1℃的保質(zhì)期；f2—(T1+10 ℃)的保質(zhì)期。

1.6.2保質(zhì)期的驗(yàn)證 花椒葉-金露梅葉復(fù)合飲料需要投放市場(chǎng)進(jìn)行長(zhǎng)期售賣，所以應(yīng)對(duì)其成品進(jìn)行長(zhǎng)期放置試驗(yàn)，避免因長(zhǎng)期售賣、放置影響口感。飲料在室溫(25±2) ℃下儲(chǔ)存6個(gè)月，每2個(gè)月測(cè)定一次飲料的活性成分含量、抗氧化活性、微生物含量和感官指標(biāo)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)的浮動(dòng)范圍不超過(guò)5%，即可視為合格。

1.7 花椒葉-金露梅葉復(fù)合飲料質(zhì)量指標(biāo)的測(cè)定

1.7.1總酚(TFC)、總黃酮(TPC)含量的測(cè)定 總酚含量以沒(méi)食子酸計(jì)，采用硼氫化鈉/氯醌(SBC)比色法測(cè)定[23]。標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.471x+0.184 6，R2=0.999 4，其中x為沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度，y為吸光度。總酚含量按式(4)計(jì)算：

(4)

式中：YTFC—總酚的量，μmol/g;C2—(y-0.184 6)/(0.471×170.12)， mmol/L；C1—樣液質(zhì)量濃度，g/L。

總黃酮含量以槲皮素計(jì)，采用福林酚(Folin-Ciocalteu)比色法測(cè)定[24]。標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.002 3x+0.088 9,R2=0.997 9，其中x為槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度，y為吸光度?？傸S酮含量按式(5)計(jì)算：

(5)

式中：YTPC—總黃酮的量，μmol/g;C′2—(y-0.088 9)/(0.002 3×302.23)，mmol/L。

1.7.2HPLC法測(cè)定活性成分含量 采用HPLC測(cè)定活性成分蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷和阿福豆苷。高效液相色譜儀(Agilent HPLC 1260)，Zobax Eclipse Plus C18色譜柱，流動(dòng)相為水與乙腈，流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣時(shí)間為30 min。流動(dòng)相：0～30 min，乙腈15%～35%。進(jìn)樣量為20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm[25]。

HPLC測(cè)定兒茶素和阿魏酸。高效液相色譜儀(Agilent HPLC 1260)，Zobax Eclipse Plus C18色譜柱，流動(dòng)相為水與甲醇，流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣時(shí)間為30 min。流動(dòng)相：0～10 min，甲醇5%～25%；10～30 min，甲醇25%～35%。進(jìn)樣量為20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm[25]。

1.7.3抗氧化活性的測(cè)定 樣品ABTS+自由基(ABTS+·)清除能力的測(cè)定參見(jiàn)文獻(xiàn)[26] 。樣液對(duì)ABTS+·的清除能力以Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度來(lái)表示，若樣液與某個(gè)濃度的Trolox溶液對(duì)ABTS+·的清除率相同，則該樣液的ABTS+·清除能力以該Trolox溶液濃度表示。相應(yīng)的樣品的ABTS+·清除能力則通過(guò)樣液濃度與Trolox濃度換算得到。Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液清除ABTS+·的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.106 3x+0.757 8，R2=0.999 3，其中x為Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液的物質(zhì)的量濃度，y為清除率。

(6)

式中：RABTS+·—樣品的ABTS+·清除能力，μmol/g;C3—(y-0.0.757 8)/0.106 3，mmol/L。

樣品的三價(jià)鐵還原(FRAP)能力[27]計(jì)算及表示方法同ABTS+·。Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液還原三價(jià)鐵的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.004 3x+0.214 3，R2=0.999 9，其中x為Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液的物質(zhì)的量濃度，y為吸光值。

(7)

式中：RFRAP—樣品的三價(jià)鐵還原能力，μmol/g;C′3—(y-0.214 3)/0.004 3，mmol/L。

DPPH·清除能力的測(cè)定參見(jiàn)文獻(xiàn)[28]。由樣品濃度和清除率擬合出對(duì)數(shù)函數(shù)回歸方程即可求得IC50，即清除50% DPPH·時(shí)所需樣品的質(zhì)量濃度。

圖1 DPPH·清除活性等輻射分析圖Fig.1 Isoradiation analysis chart of DPPH· scavenging activities

1.7.4模糊綜合評(píng)價(jià)法 根據(jù)感官評(píng)價(jià)表，組織了不同性別比、不同年齡段的50人進(jìn)行評(píng)分。在極壞、壞、一般、好、完美的五級(jí)模糊尺度上，對(duì)色澤、性狀、氣味和滋味4個(gè)方面進(jìn)行研究和評(píng)價(jià)，結(jié)果采用百分制，以1～100分表示[20]。

1.7.5微生物檢測(cè)方法 菌落總數(shù)按照GB 4789.2—2016規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定[29]；霉菌和酵母按照GB 4789.15—2016規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定[30]；大腸菌群按照GB 4789.3—2016規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定[31]；食源性致病菌按照GB 4789.10—2016規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定[32]。

2 結(jié)果與討論

2.1 花椒葉和金露梅葉最佳配比的確定

花椒葉提取物(ZBE)和金露梅葉提取物(PFE)復(fù)配后的抗氧化相互作用的等輻射分析圖如圖1所示，理論值和測(cè)量值如表1所示，各配比下復(fù)配物總黃酮、總酚、活性成分含量如表2所示。表2結(jié)果表明：ZBE中金絲桃苷(HYD)、蘆丁(RUT)、槲皮苷(QUE)和阿福豆苷(AFZ)含量較高，PFE中兒茶素(CAT)和阿魏酸(FER)含量較高。復(fù)配后，6種活性物質(zhì)含量均發(fā)生變化且在DPPH體系中均表現(xiàn)出了協(xié)同作用。在ZBE/PFE 3 ∶1時(shí)二者協(xié)同作用最強(qiáng)，此時(shí)復(fù)配物相互作用指數(shù)(γ)為0.68，含總酚(1.843 2±0.014 4) μmoL/g，含總黃酮(2.288 1±0.014 5) μmoL/g，兒茶素、阿槐酸、金絲桃苷、蘆丁、槲皮苷和阿福豆苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為(36.23±1.91)、(15.34±0.34)、(75.21±1.30)、(25.43±0.51)、(75.77±2.25)和(21.52±0.49) mg/g。

表1 不同比例復(fù)配物抗氧化能力(DPPH·)Table 1 Anti-oxidant ability of the mixtures with different proportions(DPPH·)

由表2數(shù)據(jù)可知，花椒葉提取物中金絲桃苷、蘆丁、槲皮苷和阿福豆苷含量較高，金露梅葉提取物中兒茶素和阿魏酸含量較高。復(fù)配后，6種活性物質(zhì)含量發(fā)生變化，所有復(fù)配物均表現(xiàn)出良好的抗氧化協(xié)同效應(yīng)。當(dāng)花椒葉提取物與金露梅葉提取物復(fù)配比為3 ∶1時(shí)，復(fù)配物的抗氧化協(xié)同效應(yīng)最好(γABTS+·=1.20；γFRAP=1.14；γDPPH·=0.68)。因此，花椒葉提取物和金露梅葉提取物的最佳復(fù)配比為3 ∶1。

表2 不同比例復(fù)配物中活性成分含量1)Table 2 The content of activity components in the mixtures with different mixting proportions

2.2 花椒葉-金露梅葉復(fù)合飲料配方與工藝

2.2.1復(fù)配物添加量的確定 不同添加量花椒葉和金露梅葉(復(fù)配比3 ∶1)的復(fù)合飲料中總酚含量、總黃酮含量與抗氧化活性見(jiàn)表3。

表3 ZBE和PFE復(fù)配物添加量的確定Table 3 Determination of the addition of ZBE and PFE mixture

復(fù)配物添加量由0.05%上升至0.20%，總酚、總黃酮的量、ABTS+·清除能力和FRAP呈上升趨勢(shì)，分別增加了118.63%、 97.39%、 48.21%和148.24%。IC50，DPPH·變化不大，分別為(3.54±0.05)、(3.22±0.07)、(3.15±0.08)、(3.54±0.08) mg/L。但是復(fù)配物添加量提高至0.1%后，飲料中沉淀物會(huì)逐漸增多，滋味由微麻變?yōu)槁詭Э辔?，影響飲料的視覺(jué)效果和口感。同時(shí)，考慮到每天每人攝入黃酮類化合物的上限，選擇0.1%為最佳添加量。

2.2.2增稠劑添加量的確定 增稠劑添加量正交試驗(yàn)的極差分析見(jiàn)表4。各因素對(duì)飲料不溶物的沉淀率影響排序?yàn)椋狐S原膠(B)>CMC-Na(A)>β-環(huán)狀糊精(C)，極差分析表明最優(yōu)組合為A3B1C1，即CMC-Na、黃原膠、β-環(huán)狀糊精的添加量分別為0.30%、 0.02%及0.40%。在此最優(yōu)條件下，飲料平均沉淀率為0.70%，低于正交試驗(yàn)各試驗(yàn)結(jié)果，與理論相符。

2.2.3甜味劑添加量的確定 甜味劑添加量正交試驗(yàn)的極差分析見(jiàn)表4。各因素對(duì)飲料感官的影響排序依次為：阿斯巴甜(A)>木糖醇(B)>檸檬酸(C)，極差分析表明最優(yōu)組合為A3B3C2，即檸檬酸、木糖醇、阿斯巴甜的添加量分別為0.10%、 0.015%及8.00%。在此最優(yōu)條件下，飲料感官評(píng)價(jià)得分為81.05，高于正交試驗(yàn)各試驗(yàn)結(jié)果，與理論相符。

2.2.4最終配方與加工工藝 綜上，飲料最佳配方與加工工藝為：將花椒葉提取物和金露梅葉提取物按3 ∶1復(fù)配，復(fù)配物添加量為0.10%、木糖醇0.015%、阿斯巴甜8.00%、檸檬酸0.10%、CMC-Na 0.30%、黃原膠0.02%、β-環(huán)狀糊精0.40%溶解于136 mL水中，70 ℃超聲波加速溶解10 min，超聲波功率為400 W，冷藏12 h，4 000 r/min離心5 min，取上層清液，加入0.05%的山梨酸鉀。再次對(duì)飲料進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，評(píng)分為79分，接近預(yù)測(cè)值。

表4 正交試驗(yàn)的極差分析Table 4 Range analysis of orthogonal experiments

2.3 花椒葉-金露梅葉復(fù)合飲料滅菌工藝的確定

2.3.1不同滅菌工藝的微生物檢測(cè) 不同滅菌工藝的滅菌效果見(jiàn)表5。微波滅菌時(shí)間達(dá)到90 s時(shí)，樣品的菌落總數(shù)100 CFU/mL、霉菌和酵母菌20 CFU/mL、大腸菌群數(shù)0.1 MPN/mL,均未達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求，僅食源性致病菌檢測(cè)達(dá)到國(guó)標(biāo)要求[33]，故微波滅菌結(jié)果不符合國(guó)標(biāo)要求；只有高壓蒸汽滅菌(<10，未檢出，陰性，陰性)和煮沸滅菌30 min(全陰性)的結(jié)果符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。值得一提的是，這3種滅菌方法的食源性致病菌檢測(cè)均為陰性。因此，選則高壓蒸汽滅菌和煮沸滅菌30 min這兩種滅菌工藝進(jìn)行后續(xù)研究。

表5 不同滅菌工藝的滅菌效果1)Table 5 Sterilization effects of different sterilization process

2.3.2不同滅菌工藝對(duì)飲料成分與活性的影響 不同滅菌工藝飲料對(duì)有效成分含量與抗氧化活性的影響見(jiàn)表6。煮沸滅菌30 min與高壓蒸汽滅菌均可達(dá)到良好的滅菌效果，飲料中活性物質(zhì)含量及抗氧化活性也變化較小，且煮沸滅菌效果更好，除了金絲桃苷的保留率為95.47%，低于高壓蒸汽滅菌法的98.25%之外，其余物質(zhì)的含量及抗氧化活性均高于后者，且保留率超過(guò)95%。與此前制備的花椒葉飲料相比[34]，花椒葉-金露梅葉復(fù)合飲料的ABTS+·清除能力和FRAP分別提高了1.43、 1.28倍，IC50，DPPH·降低了1.75倍，其抗氧化活性顯著提高。因此，采取煮沸滅菌30 min為飲料的最佳滅菌工藝。

表6 不同滅菌工藝對(duì)有效成分含量與抗氧化活性的影響Table 6 Effects of sterilization process on content of bioactive compounds and antioxidant activity

2.4 花椒葉-金露梅葉復(fù)合飲料的化學(xué)穩(wěn)定性

化學(xué)穩(wěn)定性試驗(yàn)以第0天的結(jié)果作為100%的保留率，較高的保留率表示化學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng)。由表7可知，煮沸滅菌放置10天后，高溫試驗(yàn)在溫度(60±2) ℃中的不同指標(biāo)保留率均在95.04%以上，強(qiáng)光試驗(yàn)在照度(4 500±500) lx的保留率則均在95.39%以上。在持續(xù)180天的加速試驗(yàn)中，保留率隨著時(shí)間的推移緩慢下降，但均在95.19%以上。同時(shí)，飲料的色澤、性狀、氣味和滋味無(wú)明顯變化；微生物檢測(cè)中，微生物含量也未超出國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。綜上所述，該飲料在高溫、強(qiáng)光、長(zhǎng)時(shí)間的貯存環(huán)境下表現(xiàn)出較強(qiáng)的化學(xué)穩(wěn)定性。

表7 化學(xué)穩(wěn)定性試驗(yàn)中該飲料的活性成分含量及抗氧化活性Table 7 The content of bioactive compounds and antioxidant activity of this beverage in the chemical stability tests

2.5 花椒葉-金露梅葉復(fù)合飲料保質(zhì)期的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證

保質(zhì)期的預(yù)測(cè)試驗(yàn)中，花椒葉-金露梅葉復(fù)合飲料在35、 45、 55和65 ℃下的各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)分別在129、 63、 33和16天浮動(dòng)超過(guò)5%，檢測(cè)不合格，故Q10=2.0。因此，室溫下(25 ℃)復(fù)合飲料的預(yù)測(cè)保質(zhì)期為258天(129 d×2.0=258 d)。

保質(zhì)期驗(yàn)證試驗(yàn)中該飲料的活性成分含量及抗氧化活性見(jiàn)表8。

表8 保質(zhì)期驗(yàn)證試驗(yàn)中該飲料的活性成分含量及抗氧化活性Table 8 The content of bioactive compounds and antioxidant activity of this beverage in verification tests of the shelf life

由表中數(shù)據(jù)可知，復(fù)合飲料在室溫下(25 ℃)保存6個(gè)月后，其活性成分與抗氧化活性的保留率均超過(guò)95%，飲料外觀均勻一致，呈淺棕色，澄清透明，有光澤，組織狀態(tài)均勻穩(wěn)定，無(wú)分層、沉淀現(xiàn)象，無(wú)雜質(zhì)及其懸浮物，口感微麻，甜度適中，具有淡淡的清香氣味，與6個(gè)月前差異不明顯。微生物檢測(cè)中，微生物含量未超出國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。因此，該飲料的保質(zhì)期為6個(gè)月。

3 結(jié) 論

以花椒葉提取物(ZBE)與金露梅葉提取物(PFE)為原料，采用等輻射分析法研究其抗氧化協(xié)同效應(yīng)，確定最佳復(fù)配比；采用單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)確定花椒葉-金露梅葉復(fù)合飲料的生產(chǎn)配方與制備工藝。研究結(jié)果表明：ZBE與PFE復(fù)配比為3 ∶1(質(zhì)量比)顯示出最佳的抗氧化協(xié)同效應(yīng)；復(fù)配飲料最佳配方與加工工藝為花椒葉-金露梅葉提取物復(fù)配物0.10%、木糖醇0.015%、阿斯巴甜8.00%、檸檬酸0.10%、CMC-Na 0.30%、黃原膠0.04%、β-環(huán)狀糊精0.40%溶解于136 mL水中，70 ℃超聲波加速溶解10 min，冷藏12 h，4 000 r/min離心5 min，取上層清液，加入0.05%的山梨酸鉀，煮沸滅菌30 min。滅菌后該飲料中的兒茶素、阿魏酸、金絲桃苷、蘆丁、槲皮苷和阿福豆苷的含量較高，且具有強(qiáng)抗氧化活性，其微生物學(xué)檢測(cè)符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，(25±2) ℃時(shí)保質(zhì)期可達(dá)6個(gè)月。