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(遼寧省經(jīng)濟(jì)作物研究所/遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所,遼寧 遼陽(yáng) 111000)

人參(Panaxginseng)為五加科(Araliaceae)人參屬(Panax)多年生草本植物[1]。根及根莖可入藥,含人參皂苷Rg1(C42H72O14)、人參皂苷Re(C48H82O18)和人參皂苷Rb1(C54H92O23),具有大補(bǔ)元?dú)?復(fù)脈固脫,補(bǔ)脾益肺,生津養(yǎng)血,安神益智之功效[2],被稱為“百草之王”,我國(guó)人參主要分布在吉林、遼寧及黑龍江省,占全國(guó)85%以上[3]。

人參是一種在同一個(gè)地方生長(zhǎng)緩慢的宿根植物,面臨著一系列的環(huán)境脅迫,包括細(xì)菌、真菌、線蟲侵染等。目前,國(guó)內(nèi)外記載的人參病害已有 40 多種,我國(guó)已發(fā)現(xiàn)的人參病害至少有25種以上[4],嚴(yán)重影響了人參產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。人參的主要侵染性病害有銹腐病(Cylindrocarponspp.)、根腐病(Root rot disease)、疫病(PhytophthoracactorumSchroet)、立枯病(RhizoctoniasolaniKuhn)和灰霉病(BotrytiscinereaPers)。由立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKuhn) 引起的人參立枯病又稱抽死病、土掐病,易引起人參幼苗萎蔫及莖基腐爛[5],在低溫多雨的條件下,該病發(fā)展蔓延極為迅速,常年發(fā)病率為8%～32%,嚴(yán)重者可達(dá)40%[6],是人參苗期主要病害之一。目前的防治方法主要是噴灑化學(xué)試劑,但由此易導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性,土壤農(nóng)藥殘留大,土壤微生物生態(tài)失衡等一系列問題,其藥物殘留也直接威脅人類健康[7～8],嚴(yán)重影響了人參產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。通過生物防治措施可減少或抑制人參病害的發(fā)生,因其來(lái)源廣泛,對(duì)人畜安全和對(duì)環(huán)境友好而備受研究者的青睞[6]。目前,國(guó)內(nèi)外已篩選出多種各類中藥材病害的拮抗菌株,例如人參根腐病、黑斑病等病害的拮抗菌株[9～10],但人參立枯絲核菌拮抗菌株尚未見報(bào)道。本研究于2021 年在遼寧省遼陽(yáng)市用常規(guī)PDA培養(yǎng)基,采用平板對(duì)峙法,以31個(gè)菌株為候選拮抗菌株,以立枯絲核菌為靶標(biāo)菌篩選具有拮抗作用的菌株,應(yīng)用rDNA-ITS分析結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定確定拮抗菌株分類地位,同時(shí)設(shè)定不同培養(yǎng)基、碳源、氮源、溫度、光照和pH值條件研究該菌株的生物學(xué)特性,并對(duì)其發(fā)酵液進(jìn)行防病促生盆栽試驗(yàn)研究,為其生物防治和促生菌肥提供潛在的資源菌,促進(jìn)人參產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

在遼寧省撫順市人參種植基地采集具有典型立枯病癥狀的病株,采用常規(guī)組織分離法對(duì)病株進(jìn)行分離、純化,經(jīng)鑒定為立枯絲核菌,作為供試標(biāo)靶病原菌。供試31株拮抗菌由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所提供,是從哈巴湖荒漠和新疆及騰格里沙漠等地分離出的植物內(nèi)生真菌,4 ℃斜面培養(yǎng)保存。

1.2 方法

1.2.1 拮抗真菌與立枯絲核菌平板對(duì)峙培養(yǎng)

采用四點(diǎn)平板對(duì)峙法測(cè)定31株生防菌對(duì)病原菌的拮抗效果,以不接拮抗菌為對(duì)照,接種后25 ℃暗培養(yǎng),3次重復(fù),用十字交叉法測(cè)量對(duì)照組和處理組病原菌菌落直徑,計(jì)算抑菌率。

抑菌率=(對(duì)照組菌落直徑–處理組菌落直徑)/(對(duì)照組菌落直徑–菌餅直徑)×100%

1.2.2 拮抗菌鑒定

1.2.2.1 形態(tài)鑒定

將篩選出的拮抗效果好的純菌株接種在PDA平板上(PDA培養(yǎng)基臨用前加入適量鏈霉素以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)),25 ℃暗培養(yǎng)3～5 d進(jìn)行觀察,按照《真菌鑒定手冊(cè)》鑒定到屬[11]。

1.2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

采用單孢分離法對(duì)菌株進(jìn)行純化,CTAB法(Saghaietal.,1984)提取基因組DNA,應(yīng)用真菌通用引物ITS1和ITS4對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增, PCR產(chǎn)物交由北京鼎國(guó)生物工程技術(shù)公司測(cè)序。得到的ITS序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)序列進(jìn)行比較,應(yīng)用DNAStar構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,獲得最相近菌株ITS-rDNA序列作為參比菌株。

1.2.3 拮抗菌生物學(xué)特性研究

根據(jù)傅本重等方法對(duì)入選菌株進(jìn)行生物學(xué)特性研究[12]。

1.2.3.1 最佳培養(yǎng)基

將菌齡一致的菌餅(直徑5 mm),分別接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)、水瓊脂(WA)、胡蘿卜培養(yǎng)基(CM)、改良馬丁氏(MA)、查氏培養(yǎng)基(CA)、麥芽浸粉培養(yǎng)基(MEA)、玉米粉培養(yǎng)基(CMM)8種供試培養(yǎng)基平板中央,3 d后開始采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,連續(xù)測(cè)量7 d,3次重復(fù)。

1.2.3.2 最佳碳源

以查氏培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,以不加碳源作對(duì)照,用甘露醇、蔗糖、果糖、麥芽糖、木糖、葡萄糖和乳糖中等量的碳源替換蔗糖,配制成不同碳源的固體培養(yǎng)基。將菌齡一致的菌餅接種到平板中央,3次重復(fù),測(cè)量方法及培養(yǎng)條件同上。

1.2.3.3 最佳氮源

以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,以不加氮源作對(duì)照,用尿素、硫酸銨、硝酸鉀、牛肉膏和硝酸銨中等量的氮源替換查氏培養(yǎng)基中的硝酸鈉,將菌齡一致的菌餅接種到平板中央,測(cè)量菌落直徑方法及培養(yǎng)條件同上。

1.2.3.4 最適溫度

設(shè)置5 ℃、14 ℃、20 ℃、27 ℃、34 ℃共5個(gè)處理,測(cè)量菌落直徑,根據(jù)菌落直徑大小分析菌株最適溫度。

致死溫度:設(shè)置50 ℃、55 ℃、60 ℃共3個(gè)處理,根據(jù)菌落是否擴(kuò)展分析生防菌致死溫度。

1.2.3.5 最適酸堿度

用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH將PDA培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)至3、4、5、6、7、8、9、10、11、12共10個(gè)梯度,分析pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。

1.2.3.6 光照

將菌餅接種到PDA平板中央,分別置于24 h全光照、12 h光暗交替和24 h全黑暗培養(yǎng),培養(yǎng)溫度25 ℃,3次重復(fù)。

1.2.4 室外盆栽防病促生試驗(yàn)

1.2.4.1 菌株發(fā)酵液的制備

將入選菌株接入葡萄糖馬鈴薯液體培養(yǎng)基中(PDB),170 r/min振蕩5 d,菌量約為108cfu/ml。

1.2.4.2 盆栽防病促生試驗(yàn)

采用盆缽種植方式,供試土壤為林地土:草炭土按照2∶1混勻。供試參苗為一年生人參苗,根系消毒后進(jìn)行移栽,每盆3株,3盆1組,每組3次重復(fù)。

防效作用測(cè)定:先接種立枯絲核菌菌懸液,24 h后再灌注300 ml菌株發(fā)酵液,藥劑對(duì)照組施用多菌靈可濕性粉劑500倍液,空白對(duì)照為清水。

促生作用測(cè)定:在人參苗根部灌注300 ml 396拮抗菌發(fā)酵液,對(duì)照組澆灌等量清水,放置在冷棚中常規(guī)管理。

45 d后測(cè)其株高、鮮莖、葉、根質(zhì)量等指標(biāo),而后于180 ℃烘干至恒重,測(cè)其莖葉干質(zhì)量、根干重等指標(biāo)。

人參立枯病發(fā)病程度參考羅燕娜方法分為5級(jí)[13]:

0 級(jí),健苗;

1 級(jí),莖基、根部局部有病斑;

2 級(jí),1/3～1/2 的莖基、根部出現(xiàn)病斑;

3 級(jí),1/2～2/3 的莖基、根部出現(xiàn)病斑;

4 級(jí),枯死。病情指數(shù)和防效分別按照下列公式計(jì)算[14]

病情指數(shù)=[∑(病級(jí)株數(shù)×代表值)/(總株數(shù)×最高病級(jí)代表值)]×100;

防效=(對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對(duì)照病情指數(shù)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,并用DPS 2005軟件進(jìn)行單因素方差分析,應(yīng)用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株室內(nèi)拮抗活性

對(duì)31株菌株進(jìn)行平板對(duì)峙法篩選,結(jié)果顯示菌株396對(duì)人參立枯絲核菌有拮抗效果,抑菌帶清晰,寬度為2.78±0.05 mm,抑制率為79.4%。

圖1 菌株396與供試病原菌在PDA平板對(duì)峙培養(yǎng)中的菌落擴(kuò)展情況Figure 1 Colony extension of strain 396 tested pathogenic fungi on dual-culture PDA plates

2.2 拮抗真菌種類鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

菌株396在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)生長(zhǎng)速度較快,5 d可長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿;菌落淺褐色,邊緣常呈不整齊波裂狀,菌絲有格、白色半透明,具二叉狀分枝。后期平板中部上方產(chǎn)生大量燒瓶形或卵形黑色子囊殼,子囊殼內(nèi)有大量圓形或近圓形棕色子囊,每個(gè)子囊內(nèi)有8個(gè)子囊孢子,子囊孢子為單胞。依據(jù)菌落和子囊殼等特征,與《真菌鑒定手冊(cè)》中相應(yīng)屬進(jìn)行對(duì)照,初步鑒定為球毛殼(Chaetomiumglobosum)。

2.2.2 分子鑒定

采用CTAB法(Saghaietal.,1984)提取菌株396基因組DNA,應(yīng)用真菌通用引物ITS1和ITS4對(duì)其rDNA-ITS基因片段進(jìn)行擴(kuò)增,得到1條約600 bp的片段。將測(cè)序結(jié)果提交NCBI,在GenBank上進(jìn)行Blast比對(duì),對(duì)菌株396構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2),結(jié)果表明,菌株396與Chaetomiumglobosum(MN341340、 MN592971、MN700107、MT341778、MT341778)同源性最高,聚在同一組,相似達(dá)到100%;菌株396與層生鐮刀菌(Fusariumproliferatum)尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)等屬中種類均不在同一組中,親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。從分子生物學(xué)層面證明菌株396為球毛殼。

圖2 球毛殼,a,b,子囊果;c,子囊孢子Figure 2 C. globosum, a, b, Perithecium; c, Ascospore

圖3 基于拮抗菌396 ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 Phylogenetic tree of antagonistic fungi strain 396 based on ITS-rDNA sequence

2.3 人參立枯絲核菌拮抗真菌的生物學(xué)特性

2.3.1 不同培養(yǎng)基對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響

由表1可見不同培養(yǎng)基對(duì)菌株396菌落生長(zhǎng)量有顯著的影響,在MA、MEA和CMM培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快,10 d均長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿,與其他培養(yǎng)基相比差異顯著,在MA和MEA培養(yǎng)基上菌絲短、致密,是培養(yǎng)396良好培養(yǎng)基,在CMM培養(yǎng)基上長(zhǎng)得快,但菌絲稀疏,不適合做396的培養(yǎng)基。在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較好,菌落直徑為55.97 mm,在PSA和CM培養(yǎng)基上生長(zhǎng)明顯受到抑制,生長(zhǎng)緩慢,菌落直徑僅為30.86 mm和31.26 mm。因此,該菌適宜的培養(yǎng)基為MA和MEA培養(yǎng)基。

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)拮抗菌株396菌絲生長(zhǎng)的影響Table 1 Effect of different culture media on mycelial growth of antagonistic fungus strain 396

2.3.2 不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

如表2可見,不同氮源對(duì)菌株396的生長(zhǎng)量有顯著影響,菌株396對(duì)牛肉膏和硝酸鉀利用最好,培養(yǎng)第9 d菌落長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿,達(dá)到75 mm;在尿素和對(duì)照的查氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較慢,菌落直徑為45.37 mm和45.68 mm,以硝酸銨為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢。因此,硝酸鉀和牛肉膏是菌株396良好的氮源。

表2 不同氮源對(duì)拮抗菌株396菌落生長(zhǎng)的影響Table 2 Effect of different nitrogen sources on mycelial growth of antagonistic fungi strain 396

2.3.3 不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

如表3可見,不同碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)量有顯著差異,菌株396對(duì)木糖和葡萄糖利用最好,菌落長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿,達(dá)到75 mm;在果糖和乳糖上生長(zhǎng)較快,菌落直徑為57～59 mm;在甘露醇和蔗糖上生長(zhǎng)較慢,菌落直徑為43～44 mm,麥芽糖生長(zhǎng)也很慢,僅為39.09 mm,在無(wú)糖的查氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢,10 d菌落直徑僅達(dá)到31.88 mm。

表3 不同碳源對(duì)拮抗菌株396菌落生長(zhǎng)的影響Table 3 Effect of different carbon source on mycelial growth of antagonistic fungus strain 396

2.3.4 溫度對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響

從圖4可見,不同溫度對(duì)菌株的生長(zhǎng)量有顯著影響,最適宜生長(zhǎng)溫度為27 ℃,菌落直徑為54.58 mm,溫度為20 ℃時(shí),菌落直徑可達(dá)40.91 mm,低溫5 ℃時(shí)幾乎不生長(zhǎng),10 d培養(yǎng)后菌落直徑僅增加1.12 mm,溫度34 ℃菌落直徑生長(zhǎng)較緩慢,達(dá)到18.99 mm。

圖4 溫度對(duì)拮抗菌株396菌落生長(zhǎng)的影響Figure 4 Growth of antagonistic fungus strain 396 under different temperatures

2.3.5 致死溫度

菌株經(jīng)過50 ℃、55 ℃、60 ℃水浴處理后菌絲生長(zhǎng)緩慢,培養(yǎng)5 d后,在60 ℃水浴處理后菌絲不再生長(zhǎng),菌株的致死溫度為60 ℃。

2.3.6 pH值對(duì)生防真菌菌絲生長(zhǎng)的影響

由圖5可見,菌株396在pH為5～11均能生長(zhǎng),pH為7～8時(shí)生長(zhǎng)較好,菌落直徑受pH影響較大,pH為3、4和12時(shí)菌落直徑基本不增加。結(jié)果表明:該菌株最適宜pH值為7～8。

圖5 不同pH條件下菌株396的生長(zhǎng)情況Figure 5 Growth of fungus strain 396 under different pH conditions

2.3.7 光照對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響

由圖6可見,菌株396對(duì)光周期不敏感,在12 h光暗交替、全光照、全黑暗條件培養(yǎng)下,菌落直徑差異不顯著。

圖6 不同光照條件下菌株396的生長(zhǎng)情況Figure 6 Growth of strain 396 under different light conditions

2.4 拮抗菌株396對(duì)人參立枯病盆栽防效試驗(yàn)結(jié)果

盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明,菌株396發(fā)酵液可以使人參立枯病病情指數(shù)降低,治療作用效果為54.74%,與農(nóng)藥組持平,表現(xiàn)出較好的防病能力。

2.5 拮抗菌株396對(duì)人參苗期生長(zhǎng)的影響

在盆栽試驗(yàn)中,菌株發(fā)酵液處理后的人參,在株高、莖葉鮮質(zhì)量、莖葉干質(zhì)量、根鮮質(zhì)量、根長(zhǎng)和根粗與對(duì)照相比有顯著差異。由表5、表6可見,株高與對(duì)照相比增加51.21%,莖葉鮮質(zhì)量與對(duì)照相比增加115.02%,莖葉干質(zhì)量增加47.37%,根鮮質(zhì)量與對(duì)照相比增加28.74%,根長(zhǎng)增加41.78%,根粗增加30.59%,根干質(zhì)量與對(duì)照相比增加不明顯。由此可見,拮抗菌株396對(duì)人參生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。

表4 拮抗真菌396對(duì)人參立枯病防效試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Control effect of antagonistic fungus strain 396 on Rhizoctonia solani in Panax ginseng

表5 拮抗真菌396對(duì)人參地下生物量的影響Table 5 Effect of antagonistic fungus strain 396 on underground biomass of Panax ginseng

表6 拮抗真菌396對(duì)人參地上生物量的影響Table 6 Effect of antagonistic fungus strain 396 on aboveground biomass of Panax ginseng

3 討論與結(jié)論

人參立枯病是人參苗期的主要病害之一,發(fā)生普遍且分布廣泛,近年來(lái)在非林地農(nóng)田栽參育苗床上發(fā)生率很高嚴(yán)重時(shí)可達(dá)到40%,造成參苗成片死亡,直接影響人參產(chǎn)量[15]。目前,防治仍以多菌靈等化學(xué)藥劑防治為主,但研究表明病原菌對(duì)農(nóng)藥能逐漸產(chǎn)生抗藥性,并出現(xiàn)用藥量與病害發(fā)生程度相互遞增的惡性循環(huán)[16],為降低人參農(nóng)藥殘留問題,減少化學(xué)農(nóng)藥對(duì)生態(tài)環(huán)境等影響,需加大對(duì)生物農(nóng)藥研發(fā)。利用豐富的微生物資源進(jìn)行生物防治是未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)。內(nèi)生菌生存在植物體內(nèi),有穩(wěn)定的生存空間,可以長(zhǎng)期定殖于植物體內(nèi),不易受外界環(huán)境條件影響,與病原菌可以直接互作,是一類重要的生防菌資源[17]。球毛殼菌是毛殼菌中研究最早的生防菌[18],具有產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的能力[19],廣泛應(yīng)用于病害的防治。1954年Martin和Moore經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)毛殼菌可使大麥、燕麥、谷物幼苗免受鐮孢屬病原菌侵染,廣泛應(yīng)用于病害的防治[20]。國(guó)內(nèi)研究毛殼菌較晚,目前主要為實(shí)驗(yàn)室研究階段,劉曉光等研究發(fā)現(xiàn),毛殼菌可以重寄生于立枯絲核菌和小核菌菌絲內(nèi),在顯微鏡下可觀察到病原菌菌絲被纏繞、穿透等現(xiàn)象[21]。印敬明等研究表明球毛殼ND35能夠較好定殖于番茄、黃瓜和菜豆植株內(nèi),并能較好地促進(jìn)番茄生長(zhǎng),對(duì)黃瓜苗期猝倒病的防治效果達(dá)80.7%[22]。孫卓等從多年生人參根際土壤中篩選出一株對(duì)人參立枯絲核菌有較強(qiáng)拮抗能力內(nèi)生芽孢桿菌(Bacillusendophyticus) SZ-56[23]。

本研究采用平板對(duì)峙法,以立枯絲核菌為靶標(biāo)菌,供試的31種菌株均為從新疆騰格里沙漠、哈巴湖荒漠野生植物中分離出的內(nèi)生真菌,從中篩選出一株對(duì)人參立枯絲核菌病原菌有較強(qiáng)拮抗作用的菌株396,結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和ITS序列分析將其鑒定為球毛殼,采用單因素試驗(yàn)對(duì)菌株進(jìn)行生物學(xué)特性和盆栽防病促生試驗(yàn)研究。初步明確了該菌株最適宜培養(yǎng)基為改良馬丁氏和麥芽浸粉培養(yǎng)基,最適宜氮源為牛肉膏和硝酸鉀,最適宜碳源為木糖和葡萄糖。適宜溫度均為27 ℃,致死溫度為60 ℃,適宜pH為7～8,對(duì)光周期不敏感,24 h光照、24 h黑暗與12 h光暗交替培養(yǎng)菌落均能正常生長(zhǎng)。菌株發(fā)酵液對(duì)人參立枯病防治效果與500倍多菌靈持平。與清水對(duì)照相比,菌株發(fā)酵液對(duì)一年生人參苗有顯著的促生作用,其中株高與對(duì)照相比增加51.21%,莖葉鮮質(zhì)量與對(duì)照相比增加115.02%,莖葉干質(zhì)量增加47.37%,根長(zhǎng)增加41.78%,根粗增加30.59%,這與孫卓等的研究結(jié)果一致,也展現(xiàn)出396在人參促生中有較好的應(yīng)用前景[23]。本研究根干質(zhì)量增加不顯著,可能與試驗(yàn)時(shí)間較短,根部干物質(zhì)積累較少有關(guān),針對(duì)這一問題,可進(jìn)一步進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證,本研究為人參立枯病生物防治和微生物菌肥的開發(fā)提供理論依據(jù)。