李密轉(zhuǎn)， 李名立， 陳宏燕， 楊邦海， 李秋萍， 許 潔

(遵義醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院， 貴州 遵義 563003)

0 引言

【研究意義】鳳岡鋅硒茶是貴州省三大名茶之一，是中國(guó)國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品[1]。茶多糖(Tea Polysaccharides，TPS)是綠茶中一種具有生理活性的酸性復(fù)合蛋白，又稱(chēng)茶活性多糖[2-3]。茶多糖及微量元素結(jié)合多糖具有降血糖、防治糖尿病、抗氧化和保肝性、調(diào)節(jié)免疫力與抗腫瘤、防輻射、保護(hù)造血功能、降血壓和抑菌等功能[4-6]。因此，深入研究貴州鳳岡鋅硒茶茶多糖的提取，對(duì)開(kāi)發(fā)貴州綠茶資源具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，用于輔助提取茶多糖的方法主要有水浸法、加酶法、微波法、超聲法等[7]，其中水浸法提取效率低，獲得的茶多糖雜質(zhì)多，易受溫度影響；酶法利用纖維素酶、蛋白酶等破壞植物細(xì)胞，提高多糖提取率，但酶法設(shè)備要求高，實(shí)驗(yàn)條件要求嚴(yán)格，提取茶多糖成本高，不利于擴(kuò)大生產(chǎn)；微波輔助法能利用瞬時(shí)穿透式加熱提高茶多糖提取率，可節(jié)省時(shí)間和節(jié)約能源，但微波提取極難保持恒溫，且存在微波的高能電磁波泄露等問(wèn)題[8]。運(yùn)用超聲輔助提取茶多糖，利用超聲的空化效應(yīng)和機(jī)械作用對(duì)植物的細(xì)胞壁加以破壞，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)殘損，細(xì)胞內(nèi)容物得到更快釋放。此方法不易使茶多糖的化學(xué)性質(zhì)被破壞，且能提高茶多糖的提取率，能耗小、提取時(shí)間短、提取得率高、使用溶劑少[9]?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，對(duì)于貴州鳳岡鋅硒茶茶多糖多采用水提等傳統(tǒng)方法，提取時(shí)間長(zhǎng)，能耗較大，提取率低[10]。且貴州鋅硒茶中多糖運(yùn)用超聲輔助提取的研究未見(jiàn)詳實(shí)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用超聲輔助提取貴州鳳岡鋅硒茶的茶多糖，利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取茶多糖的提取工藝，提高效率、節(jié)約能耗，為貴州鋅硒茶的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 貴州鳳岡鋅硒茶購(gòu)自貴州省鳳岡縣萬(wàn)壺緣茶業(yè)有限公司；D-無(wú)水葡萄糖和L-阿拉伯糖購(gòu)自安徽合肥博美生物科技有限公司。

1.1.2 試劑 濃硫酸、丙酮和無(wú)水乙醚購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠；無(wú)水乙醇、5%苯酚水溶液購(gòu)自北京綠澤森生物技術(shù)有限公司貴州分公司：水為自制蒸餾水。

1.1.3 儀器與設(shè)備 BL13-300H型超聲清洗儀購(gòu)自海比朗儀器有限公司；DGX-8243B型高溫鼓風(fēng)干燥箱購(gòu)自海百典儀器設(shè)備有限公司；B-220型恒溫水浴鍋購(gòu)自亞榮生化儀器廠；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購(gòu)自海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵購(gòu)自廣州長(zhǎng)城工貿(mào)有限公司；cence湘儀L500型臺(tái)式低速離心機(jī)購(gòu)自廣州滬瑞明儀器有限公司；759型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自上海菁華有限公司；FA2004N型分析天平購(gòu)自上海海菁海儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程 鳳岡鋅硒茶粉碎→過(guò)40目篩→超聲(2次)輔助提取(單因素試驗(yàn))→過(guò)濾除渣→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(80℃，蒸發(fā)至原體積1/4)→醇沉→離心(3 000 r/min，15 min)→洗滌沉淀→干燥→茶多糖。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備 10 mg/mL葡萄糖供試液：取D+-葡萄糖對(duì)照品0.010 0 g加蒸餾水溶解并用蒸餾水定容至100 mL。

1.2.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1) 全波長(zhǎng)掃描。設(shè)置掃描波長(zhǎng)為200～800 nm，選擇ABS掃描模式，設(shè)置1 nm為掃描間距，以空白樣做掃描基線，掃描待測(cè)樣品溶液的吸光值。

2) 葡萄糖溶液掃描。分別用移液管移取葡萄糖溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL置于已編號(hào)試管中，用移液管移取蒸餾水稀釋葡萄糖溶液至2.0 mL，在室溫下向試管中加入1.0 mL的5%苯酚溶液和5.0 mL濃硫酸，振蕩搖勻。將水浴鍋溫度設(shè)置為40℃，將試管放入水浴鍋中水浴30 min取出，室溫放置10 min。以0 mL葡萄糖溶液為空白對(duì)照組。在全波長(zhǎng)掃描的結(jié)果波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線縱坐標(biāo)為吸光度，橫坐標(biāo)為葡萄糖質(zhì)量濃度[11]。

1.2.4 換算因子的測(cè)定 用分析天平精確稱(chēng)取20 mg已干燥至恒重的茶多糖至燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，將燒杯中溶液移入100 mL容量瓶定容，質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL。用移液管移取1 mL該水溶液于試管加水稀釋至2 mL，后續(xù)步驟按照1.2.3中2)方法測(cè)定該水溶液中茶多糖吸光值。按照所得的葡萄糖回歸方程計(jì)算提取液中葡萄糖含量C，換算因子按公式(1)計(jì)算。

f=m/(C×D)

(1)[11]

式中，m為稱(chēng)取的多糖質(zhì)量(mg)，C為稱(chēng)取多糖中葡萄糖的含量(mg)，D為茶多糖稀釋倍數(shù)(此處為2×100)。

1.2.5 提取液中茶多糖含量測(cè)定 移取0.1 mL茶多糖提取液于已編號(hào)的試管，加水至2 mL，后續(xù)步驟按照1.2.3方法測(cè)定提取液中茶多糖吸光值。計(jì)算鳳岡鋅硒茶中茶多糖提取率[11]。

茶多糖提取率=CD×f/m×100%

(2)[11]

式中，C為茶葉多糖中葡萄糖的含量(mg)，D為多糖的稀釋倍數(shù)，f為換算因子，m為稱(chēng)取的茶葉粉質(zhì)量(mg)。

1.2.6 單因素試驗(yàn) 按照超聲時(shí)間(30 min、45 min、60 min、75 min、90 min)、超聲功率(120 W、150 W、180 W、210 W、240 W)、超聲溫度(65℃、70℃、75℃、80℃、85℃)、料液比(1︰10、1︰15、1︰20、1︰25、1︰30)分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.2.7 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 利用Design-expert 8.0.6中Box-Behnken法，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定茶水溶劑比1︰25，確定超聲溫度(A)、超聲時(shí)間(B)和超聲功率(C) 3個(gè)因素(表1)，以提取液中茶多糖得率為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平試驗(yàn)，對(duì)超聲輔助提取鋅硒茶中茶多糖的提取工藝加以?xún)?yōu)化。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Design-expert 8.0.6分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線與換算因子的計(jì)算

2.1.1 全波長(zhǎng)掃描 在紫外吸收波長(zhǎng)200～800 nm，葡萄糖溶液的最大吸光值于490 nm處出現(xiàn)。

2.1.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 如圖1所示，回歸方程為y= 14.707x+ 0.007 8，R2= 0.995 7，線性關(guān)系良好。單因素試驗(yàn)中，選擇490 nm吸光值。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.3 換算因子 根據(jù)公式(1)計(jì)算得到f=3.87。

2.2 不同處理的提取率

由圖2可知，在一定范圍內(nèi)，提取率著超聲功率的增加而提高，超聲功率為150 W時(shí)，提取率最高，之后增大超聲功率，提取率降低。超聲時(shí)間和超聲溫度為45 min和70℃時(shí)提取率最高，之后隨著時(shí)間和溫度的增加，提取率反而降低。料液比在1︰(20～25)時(shí)，提取較高。因此，貴州鋅硒茶茶多糖提取的最佳超聲提取功率為150 W、超聲時(shí)間為45 min、超聲溫度為70℃、料液比為1︰25。

圖2 不同超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度和料液比的提取率

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1 回歸方程 由表2和表3可見(jiàn)，利用設(shè)定17個(gè)點(diǎn)計(jì)算不同條件下鋅硒茶中茶多糖的提取率，分析得到茶多糖提取率的回歸方程為Y=7.61+0.0025A-0.092B+0.23C-0.41AB-0.075AC-0.23BC-0.021A2+0.17B2-0.35C2。

由表2可知，該回歸方程顯著(F=4.04，P<0.05)；相關(guān)系數(shù)R2=0.840 8，說(shuō)明有超過(guò)84%的真實(shí)值可以用該模型來(lái)反映。失擬項(xiàng)不顯著(F=0.85，P>0.05)，說(shuō)明該模型能較好反映實(shí)際試驗(yàn)情況。由表2中各參數(shù)的P值可知，超聲功率(C)對(duì)提取得率有顯著影響，超聲溫度(A)和超聲時(shí)間(B)對(duì)提取率無(wú)明顯影響。AB的交互作用對(duì)提取率影響顯著，AC、BC的交互作用對(duì)提取率無(wú)顯著影響。因素C顯著影響提取率，而其他2個(gè)因素的二次方對(duì)結(jié)果無(wú)顯著影響。3個(gè)因素對(duì)提取率的影響程度為C>B>A，A、B、C兩兩間的交互作用對(duì)提取率影響程度為AB>BC>AC。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)回歸方程參數(shù)值

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)下茶多糖的提取率

2.3.2 響應(yīng)面與等高線 由圖3可知，AB之間的交互作用顯著影響提取率，AC、BC兩兩間的交互作用對(duì)提取率無(wú)顯著影響。

圖3 AB、AC、BC交互作用下茶多糖的提取率

2.3.3 驗(yàn)證 因圖4與圖5殘差曲線沿直線近似，因此滿足正態(tài)性假設(shè)。圖5中殘差與方程預(yù)測(cè)值的對(duì)應(yīng)圖，殘差表現(xiàn)出隨機(jī)散射，表明原始觀察的方差對(duì)于所有值都是恒定的。圖4和圖5比較符合模型。因此，預(yù)測(cè)模型可以描述響應(yīng)面的提取率。

圖4 殘差的正態(tài)概率

圖5 殘差與預(yù)測(cè)響應(yīng)的關(guān)系

響應(yīng)面分析獲得的最優(yōu)提取條件：超聲溫度71.68℃、超聲時(shí)間37.73 min、超聲功率139.05 W。在此條件下預(yù)測(cè)鋅硒茶茶多糖提取率最大值為7.42%。為檢驗(yàn)該方法的可靠性，結(jié)合實(shí)際操作的便利性，將工藝修正為超聲溫度70℃、超聲時(shí)間40 min、超聲功率150 W。對(duì)修正后工藝進(jìn)行3次試驗(yàn)，得到鋅硒茶茶多糖的實(shí)際平均提取率為7.05%，與優(yōu)化的預(yù)測(cè)值(7.42%)相對(duì)誤差為0.37%。

2.4 超聲輔助工藝與未超聲工藝茶多糖提取率的比較

選擇響應(yīng)面優(yōu)化的超聲輔助工藝條件：溫度70℃、時(shí)間40 min、功率150 W，選擇料液比為1︰25，進(jìn)行鋅硒茶中茶多糖的提取試驗(yàn)，選擇不經(jīng)超聲處理的茶葉樣品為空白組，超聲處理的茶多糖提取率(7.58%)明顯高于不經(jīng)超聲處理的茶多糖提取率(5.42%)。經(jīng)超聲處理后，茶多糖的提取率可提高42.50%。

3 討論

茶多糖類(lèi)化合物的提取若采用超臨界流體技術(shù)等新興技術(shù)，雖提取效果較好，但其成本高昂，對(duì)設(shè)備要求高，不利于工業(yè)化提取。選擇微波、超聲波等方法提取可以很好地克服以上缺點(diǎn)，在綠色環(huán)保的基礎(chǔ)上保證較高的茶多糖提取率。荊晶等[10]采用水提醇沉法提取貴州綠茶中茶多糖，其3個(gè)不同產(chǎn)地的綠茶中茶多糖得率為4.73%～5.75%。該研究不采用超聲提取的茶多糖得率為5.42%，與荊晶等[10]的研究結(jié)果相當(dāng)。響應(yīng)面和等高線圖是考察因素之間兩兩交互作用的關(guān)系及顯著性[9,12]。該研究利用單因素和響應(yīng)面優(yōu)化兩者結(jié)合的試驗(yàn)方法，采用超聲輔助水提法提取貴州鋅硒茶中的茶多糖，其茶多糖的提取率可以達(dá)到7.58%，明顯高于不經(jīng)超聲處理的茶多糖得率(5.42%)，與陳義勇等[13]的研究結(jié)果基本一致，其傳統(tǒng)水溶提取法茶多糖的提取率明顯低于超聲-微波提取法；但與緱鴻達(dá)等[14]的研究結(jié)果相悖，可能與提取溫度有關(guān)。緱鴻達(dá)等[14]在水提時(shí)水溫為80℃，超聲處理時(shí)僅為55℃，熱水提取效果好于超聲效果。

浸提條件對(duì)茶多糖提取率的影響有直接關(guān)系，超聲波提取法主要是利用超聲波空化產(chǎn)生的極大壓力造成被破碎物細(xì)胞壁及整個(gè)生物體破裂，而且整個(gè)破裂過(guò)程在瞬間完成；同時(shí)超聲波產(chǎn)生的振動(dòng)作用加強(qiáng)了胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散及溶解，加速植物中的有效成分進(jìn)入溶劑，使其進(jìn)一步增大有效成分溶出[15]。陳仕學(xué)等[16]采用超聲波法提取石阡苔茶中的茶多糖，比常規(guī)提取法所得茶多糖含量高出55%。黃永春等[17]比較了傳統(tǒng)水提法和超聲提取粗老綠茶多糖的差異，與傳統(tǒng)的水提法相比，提取率由4.21%提至5.15%。而在該研究中，超聲輔助提取鋅硒茶多糖所得的提取率，與傳統(tǒng)水提法提取鋅硒茶茶多糖相比，提取率由5.42%提至7.58%，與陳仕學(xué)等[16-17]的研究結(jié)論基本一致。表明，超聲波法在茶多糖的提取方面具有操作方便、高效、綠色環(huán)保等特點(diǎn)。

4 結(jié)論

以貴州鳳岡鋅硒茶為原料，利用單因素和響應(yīng)面Box-Behnken分析法對(duì)影響貴州鋅硒茶茶多糖提取率的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，建立的回歸方程：Y=7.61+0.0025A-0.092B+0.23C-0.41AB-0.075AC-0.23BC-0.021A2+0.17B2-0.35C2。超聲輔助提取鋅硒茶的最佳工藝：超聲溫度(A)70℃、超聲時(shí)間(B)40 min、超聲功率(C)150 W、料液最佳配比1︰25。在該條件下，超聲處理茶多糖的提取率可達(dá)7.58%，比未經(jīng)超聲處理的空白組提取率提高42.50%。采用該輔助工藝可為鋅硒茶茶多糖的提取、分離和純化以及鋅硒茶的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。