伏秋月， 方向林， 趙 毅， 邱 訓(xùn)， 王 鵬， 李紹新*

1. 廣東醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院生物醫(yī)學(xué)光子學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 東莞 523808

2. 廣東省分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 東莞 523808

引 言

細(xì)菌耐藥已經(jīng)成為臨床抗感染治療中一個(gè)非常棘手的問(wèn)題， 全球每年因細(xì)菌感染造成的死亡高達(dá)670萬(wàn)人， 消耗的治療費(fèi)用在數(shù)百億美元以上[1]。 隨著抗菌藥物的大量使用， 這使得致病菌及其耐藥性的快速檢測(cè)變得迫切需要， 及時(shí)選擇合適的抗生素治療， 從而改善患者的預(yù)后， 同時(shí)避免不適當(dāng)?shù)闹委煟?以及不必要的廣譜抗生素的使用[2]。 基于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的檢測(cè)是臨床檢測(cè)中細(xì)菌以及耐藥性鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)。 傳統(tǒng)的致病菌檢測(cè)方法是將分離培養(yǎng)后的可疑菌落做涂片染色實(shí)驗(yàn)(革蘭染色)、 生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)、 溶血實(shí)驗(yàn)、 協(xié)同溶血實(shí)驗(yàn)、 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及典型運(yùn)動(dòng)等鑒定方法， 例如利用顯色培養(yǎng)基檢測(cè)大腸桿菌。 這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力， 而且一般一次實(shí)驗(yàn)只能檢測(cè)單一細(xì)菌， 不能滿足臨床需要[3]。

為了克服傳統(tǒng)檢測(cè)方法的局限性， 人們對(duì)其進(jìn)行了改進(jìn)。 目前臨床檢驗(yàn)最廣泛使用的方法有紙片擴(kuò)散法、 梯度擴(kuò)散法、 肉湯稀釋法或商用半自動(dòng)系統(tǒng)。 雖然這些方法既經(jīng)濟(jì)又準(zhǔn)確， 但是細(xì)菌培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)至少要24小時(shí)才能得出結(jié)果， 不能滿足臨床快速檢測(cè)的需求[4]。 近年來(lái)， 隨著分子生物學(xué)、 微生物生理學(xué)等學(xué)科的飛速發(fā)展， 一些新型的藥敏檢測(cè)技術(shù)不斷涌現(xiàn)， 如聚合酶鏈反應(yīng)， 分子雜交技術(shù)、 流式細(xì)胞熒光法[5]、 質(zhì)譜、 表面等離子體共振、 拉曼光譜、 激光鑷子、 和阻抗方法等， 這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)， 有的不能檢測(cè)多重耐藥菌， 有的需要昂貴的試劑， 有的樣品預(yù)處理復(fù)雜耗時(shí)等[6]。 雖然總體上這些方法加快了檢測(cè)速度， 一般能在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)得到結(jié)果， 但在穩(wěn)定性及可操作性上還需繼續(xù)研究。

在以上新型檢測(cè)方法中， 拉曼光譜技術(shù)顯示出了快速鑒定致病菌及其耐藥性的巨大潛力。 拉曼光譜是基于拉曼散射效應(yīng)的分子振動(dòng)光譜[7]， 它能夠提供關(guān)于分子結(jié)構(gòu)和構(gòu)型的“指紋”信息。 其譜峰窄， 分辨率高， 可以靈敏顯示致病菌間的細(xì)微差別[8]。 普通拉曼散射的拉曼散射信號(hào)弱、 效率低， 難以有效測(cè)量生物材料的拉曼光譜[9]， 往往需要高光譜受激拉曼[10-11]進(jìn)行檢測(cè)或者借助標(biāo)記手段來(lái)檢測(cè)， 例如重水標(biāo)記[12]。 普通拉曼檢測(cè)方法提供了微生物細(xì)胞的可重復(fù)拉曼光譜。 這種光譜再現(xiàn)性對(duì)于在不同實(shí)驗(yàn)室使用拉曼光譜進(jìn)行微生物鑒定非常重要。 當(dāng)樣品與某些金屬如銀、 金等粗糙表面接觸時(shí)， 其拉曼散射信號(hào)會(huì)急劇增強(qiáng)， 最高可達(dá)10個(gè)數(shù)量級(jí)以上[13]， 這種現(xiàn)象稱為表面增強(qiáng)拉曼散射相應(yīng)的光譜稱為表面增強(qiáng)拉曼光譜(surface enhanced Raman scattering, SERS)。 SERS檢測(cè)致病菌所需樣品量少， 可以實(shí)現(xiàn)無(wú)標(biāo)記、 非接觸、 它不需要任何有毒的免疫化學(xué)染色[10]。 免標(biāo)記檢測(cè)直接反應(yīng)病原菌本身的信息， 免去了繁瑣耗時(shí)的標(biāo)記程序， SERS可以提供更精細(xì)更豐富的致病菌生化特征和對(duì)抗生素的生化反應(yīng)[14]。 但是， 利用SERS技術(shù)檢測(cè)致病菌還存在不足。 第一， 由于SERS“熱點(diǎn)”難以控制， SERS信號(hào)重復(fù)性欠佳。 第二， 致病菌體積小、 在溶液中處于運(yùn)動(dòng)狀態(tài)、 難以聚焦測(cè)量。 第三， SERS光譜維度高且致病菌間光譜輪廓高度相似， 普通的數(shù)據(jù)分析方法不易區(qū)分。 針對(duì)上述SERS檢測(cè)中面臨的一系列困難， 各研究團(tuán)隊(duì)從SERS基底的設(shè)計(jì)、 致病菌的捕獲技術(shù)以及數(shù)據(jù)分析方法三個(gè)方面提出了各種解決辦法。

1 SERS基底的設(shè)計(jì)

SERS基底的材料和結(jié)構(gòu)對(duì)于致病菌檢測(cè)至關(guān)重要， 不同的合成方法、 形貌和表面結(jié)構(gòu)直接影響分析結(jié)果。 SERS基底的材料主要有銀和金。 銀的增強(qiáng)效果優(yōu)于金， 但是銀在空氣中極易氧化。 SERS基底的結(jié)構(gòu)直接影響基底的整體性能[15]。 SERS基底結(jié)構(gòu)主要分為粒子型和平面陣列型。 平面陣列型SERS基底一般采用周期性點(diǎn)陣結(jié)構(gòu)， 其SERS“熱點(diǎn)”分布均勻， SERS光譜重復(fù)性較好且方便直接測(cè)量。 粒子型種類繁多， 主要有球形、 桿狀以及復(fù)合粒子。 銀納米粒子制備過(guò)程中粒子大小不一， 均勻性不佳， 在空氣中極易氧化， 而金納米粒子尺寸均一， 穩(wěn)定性優(yōu)于銀納米粒子。 因此， 采用先制備金納米粒子再包裹一層銀的方法制備的Au@AgNPs復(fù)合粒子， 粒子大小可控、 形狀均勻、 穩(wěn)定性極佳[16]。 粒子型SERS基底制備簡(jiǎn)便， 對(duì)其加以修飾可方便其附著在細(xì)菌表面。

Liu等[17]用電化學(xué)鍍銀的方法產(chǎn)生平均長(zhǎng)度為60 nm的銀納米粒子陣列。 對(duì)甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌和野生型大腸桿菌以及臨床分離株的抗生素敏感性試驗(yàn)(antibiotic susceptibility testing, AST)和最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)快速檢測(cè)， 其SERS光譜中的特定生物標(biāo)記物的強(qiáng)度在兩小時(shí)內(nèi)明顯下降。 表明其在補(bǔ)充現(xiàn)有耗時(shí)的方法以及幫助緩解臨床細(xì)菌耐藥方面具有很高的潛力。 Yuan等[18]研發(fā)了一種基于大小可調(diào)的Au@Ag納米粒子包覆貽貝殼的復(fù)合SERS陣列基底[圖1(a)—(d)]快速鑒別大腸埃希菌、 金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。 貽貝殼中CaCO3的高含量導(dǎo)致了分析物的超高疏水性， 交叉的納米板和納米通道提供了豐富的SERS熱點(diǎn)。 對(duì)羅丹明的SERS檢出限可低至10-9mol·L-1。 這種新穎的Au@Ag自組裝貽貝殼基底在基于SERS的生物傳感器中作為低成本、 耐用和可復(fù)制的基底中具有相當(dāng)大的應(yīng)用前景。

圖1 (a)—(d)Au@AgNPs的高倍透射電鏡圖， Ag殼層厚度分別為1， 3， 5和7 nm[18]； (e) Au@AgNR的透射電鏡圖[16]； (f) B-g-PAMDAC的透射電鏡圖[20]

Wei等[19]以銀納米粒子為基底， 利用SERS檢測(cè)5種食源性致病菌， 在10 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌O157∶H7、 鼠傷寒沙門(mén)菌、 福氏志賀菌、 布魯菌S2株以及金黃色葡萄球菌的快速鑒別， 且金屬基底增強(qiáng)穩(wěn)定性高， 重復(fù)性較好。 Bi等[16]開(kāi)發(fā)了一個(gè)具有SERS活性的Au@Ag核殼納米棒[圖1(e)]用于超敏感細(xì)菌檢測(cè)和抗生素敏感性試驗(yàn)(AST)。 納米棒和細(xì)菌之間的等離子體效應(yīng)提高了SERS檢測(cè)限。 大腸桿菌的檢測(cè)范圍為107～102CFU·mL-1。 通過(guò)分析細(xì)菌拉曼強(qiáng)度變化可以獲得快速的抗生素耐藥性檢測(cè)(<3.5 h)， 該方法可以實(shí)現(xiàn)致病菌及耐藥性的快速檢測(cè)。 Zhang等[20]合成了氧化石墨烯(GO)和4-巰基苯基硼酸(4-MPBA)修飾的Au@AgNPs[圖1(f)]。 細(xì)菌聚集在其周?chē)鷮?dǎo)致大量的“熱點(diǎn)”并產(chǎn)生強(qiáng)烈的拉曼信號(hào)。 即使在低細(xì)菌濃度為103CFU·mL-1時(shí)， 也具有較高的靈敏度、 準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

2 致病菌捕獲技術(shù)

在溶液中直接檢測(cè)致病菌， 可以實(shí)時(shí)觀測(cè)藥物分子與致病菌的作用過(guò)程， 有利于進(jìn)一步理解細(xì)菌與藥物的相互作用， 是實(shí)現(xiàn)快速AST檢測(cè)的有效途徑。 但是， 致病菌在溶液中處于布朗運(yùn)動(dòng)狀態(tài)， 不易對(duì)其直接測(cè)量。 目前， 人們采用了各種捕獲并固定致病菌的方法： 核酸適配體、 免疫磁性分離、 微流控、 靜電吸引等。

2.1 核酸適體結(jié)合

適體是一組單鏈DNA或RNA分子， 可以通過(guò)范德華力、 氫鍵、 疏水和靜電相互作用結(jié)合到靶向細(xì)菌的表面。 適體的體積小， 易于合成和標(biāo)記， 缺乏免疫原性， 以及靶標(biāo)結(jié)合親和力和特異性高。 一種細(xì)菌可以結(jié)合多種適體， SERS信號(hào)在原位被放大， 可實(shí)現(xiàn)高靈敏度的檢測(cè)。 研究人員已經(jīng)通過(guò)基于SERS的適體和拉曼標(biāo)記成功檢測(cè)出金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌。 Zhang[21]、 Pang等[22]合成了適體-Fe3O4@Au磁性納米粒子(圖2)作為特異性細(xì)菌富集和SERS活化底物， 萬(wàn)古霉素-SERS標(biāo)簽用于致病菌的靈敏定量。 在50 min內(nèi)可以達(dá)到3個(gè)細(xì)胞/毫升的檢測(cè)限。 然而， 這些策略需要繁瑣的修改過(guò)程或依賴于拉曼標(biāo)記。 Gao等[23]依靠適體在細(xì)菌表面原位合成了細(xì)菌適體@AgNPs， 細(xì)菌SERS信號(hào)被其特異性識(shí)別的適體顯著增強(qiáng)。 該方法無(wú)須標(biāo)記， 檢測(cè)限低至1.5 CFU·mL-1。

圖2 細(xì)菌適體-AgNPs原位形成示意圖[23]

2.2 免疫磁性分離

免疫磁性分離技術(shù)采用初級(jí)抗體修飾的磁性納米結(jié)構(gòu)來(lái)濃縮細(xì)菌， 其將夾心型測(cè)定與磁分離相結(jié)合。 磁性納米材料的表面積與體積比具有較高的捕獲效率。 采用鏈霉素-親和素級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)大大提高了致病菌的檢測(cè)限， 致病菌與磁性納米粒子采用抗原抗體特異性結(jié)合所需樣品量少、 檢測(cè)時(shí)間短。 使用大腸桿菌抗體結(jié)合磁性金納米粒子(Fe3O4@Au)對(duì)大腸桿菌進(jìn)行選擇性分離和富集[24]以及計(jì)數(shù)， 該方法快速、 靈敏， 總分析時(shí)間少于70 min。 Kearns等[25]使用凝集素功能化的磁性納米顆粒捕獲細(xì)菌[圖3(a)]， 然后使用菌株特異性抗體功能化SERS活性納米顆粒特異性檢測(cè)細(xì)菌[圖3(b)和(c)]。 成功分離并檢測(cè)出三種致病菌： 大腸桿菌、 鼠傷寒沙門(mén)氏菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌[圖3(d)]， 每種菌株的最低檢測(cè)濃度僅為101CFU·mL-1。 Yuan等[26]利用抗菌肽功能化的磁性納米粒子以及4-巰基苯硼酸標(biāo)記的Au@Ag-GO納米復(fù)合材料成功分離大腸桿菌、 金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌[圖3(e)—(f)]。 此外腺苷酸修飾的Fe3O4納米粒子具有高抗菌活性， 可以同時(shí)分離、 識(shí)別和殺死細(xì)菌。

圖3 (a)凝集素(Con A)功能化的鍍銀磁性納米顆粒(Ag@MNPs)與細(xì)菌結(jié)合， 磁體的存在下從樣品基質(zhì)中分離細(xì)菌; (b)抗體和SERS標(biāo)簽添加； (c)將3個(gè)AgNP綴合物與3種細(xì)菌病原體和Con A(結(jié)合所有三種細(xì)菌)一起加入， 利用532 nm激光進(jìn)行分析[25]； (d)腺苷酸修飾的與樣品基質(zhì)(包括細(xì)菌、 血細(xì)胞或其他干擾物)一起培養(yǎng)； (e)Fe3O4NPs @細(xì)菌復(fù)合物與樣品基質(zhì)磁性分離； (f)4-巰基苯硼酸修飾的Au@Ag-GO與Fe3O4NPs @細(xì)菌復(fù)合物一起培養(yǎng)以形成夾層結(jié)構(gòu)[26]

2.3 微流控-SERS檢測(cè)系統(tǒng)

微流控是在微米尺度下對(duì)微量的流體進(jìn)行精準(zhǔn)操控的一種技術(shù)， 多種微流控芯片可實(shí)現(xiàn)致病菌分離。 電泳可以通過(guò)施加電場(chǎng)使微通道中的分子和粒子產(chǎn)生偏移從而達(dá)到富集或分離的目的。 多電極微流控芯片施加電流時(shí)， 不同的電極組合方式會(huì)產(chǎn)生不同的電場(chǎng)分布， 實(shí)現(xiàn)致病菌分離。 該技術(shù)具有低成本、 便攜性、 易控制、 低劑量、 響應(yīng)時(shí)間短、 精度和靈敏度高等優(yōu)異的特征。 Chang等[27]開(kāi)發(fā)了一種集成膜過(guò)濾和SERS 檢測(cè)的微流體裝置[圖4(a)]， 用于細(xì)菌富集、 代謝物提取和原位SERS測(cè)量。 封閉的微環(huán)境可以保證代謝物在SERS底物上穩(wěn)定、 均勻的吸附。 通過(guò)比較抗生素處理前后細(xì)菌分泌的代謝物的特征拉曼信號(hào)變化可以在2 h內(nèi)準(zhǔn)確確定最低抑菌濃度， 并且不會(huì)受到細(xì)菌聚集和不均勻分布問(wèn)題的影響。 Madiyar等[28]報(bào)告了通過(guò)在微流控芯片的底部嵌入垂直排列的碳納米纖維制成的納米電極陣列[圖4(b)和(c)]， 用于有效地捕獲和濃縮大腸桿菌。 然而， 這些器件存在限制了吞吐量和分離效率， 電極污染， 以及無(wú)法處理樣品碎片等不足。 Honson等[29]發(fā)明了一種非接觸的介電泳-SERS器件[圖4(d)]， 電極通過(guò)絕緣屏障與樣品通道隔離， 防止電極污染， 該器件集成了阻抗分析可以分離和捕捉細(xì)菌， 并且識(shí)別碎片。 該裝置已成功地從3 μm聚苯乙烯微球中分離出了分枝桿菌， 準(zhǔn)確率為100%。

圖4 (a)微流控系統(tǒng)及器件原理圖[27]； (b) 在4倍放大下拍攝的光學(xué)顯微鏡圖像， 顯示微流體通道和中心的活性正方形[28]； (c)四個(gè)具有多項(xiàng)式邊界的電極對(duì)稱排列以及電勢(shì)場(chǎng)分布和電泳力的曲線圖[30]； (d)介電泳-SERS裝置的示意圖[29]

2.4 靜電結(jié)合檢測(cè)

革蘭陽(yáng)性菌表面的肽聚糖和革蘭陰性菌表面的脂多糖都帶負(fù)電荷， 負(fù)電荷脂多糖是幾種革蘭氏陰性細(xì)菌的主要內(nèi)毒素和外膜成分， 帶負(fù)電荷的細(xì)菌表面物質(zhì)成為致病菌SERS檢測(cè)的生物標(biāo)志物。 因此， 帶正電荷的納米粒子和帶負(fù)電荷的細(xì)菌結(jié)合后， 納米粒子在致病菌表面形成大量的SERS “熱點(diǎn)”， 這種檢測(cè)方法大大增加了致病菌及其耐藥性的檢測(cè)限。 Fang等[31]發(fā)現(xiàn)帶正電荷的銀納米粒子通過(guò)靜電聚集在細(xì)菌壁表面， 增強(qiáng)的SERS信號(hào)優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)基底負(fù)電荷銀納米粒子。 Chen等[32]使用帶正電的銀納米粒子鑒定耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(圖5)。 為了進(jìn)一步證明其在臨床樣本鑒定中的適用性， 檢測(cè)52株金黃色葡萄球菌和215株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌， 該方法成功檢測(cè)出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。 Tadesse[33]使用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)合成了帶正電的金納米棒并表征了水中革蘭氏陰性大腸桿菌和粘質(zhì)沙雷氏菌以及革蘭氏陽(yáng)性金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的SERS特征。 金納米棒和細(xì)菌之間的等離子體和靜電相互作用使SERS均勻增強(qiáng)。 具有較高表面電荷密度的細(xì)菌表現(xiàn)出明顯較高的SERS信號(hào)。 Qiu等[34]制備的巰基-聚乙二醇-NH2功能化的Au@Ag納米棒柱狀陣列可以有效地捕獲帶負(fù)電的致病菌。 實(shí)現(xiàn)了三種代表性食源性革蘭氏陽(yáng)性菌， 即木糖葡萄球菌、 單核細(xì)胞增生李斯特菌和屎腸球菌的高靈敏度檢測(cè)。

圖5 (a)金黃色葡萄球菌與AgNPs-(左)、 AgNPs+(右)混合的SEM圖像(b)AgNPs-或AgNPs+的金黃色葡萄球菌的SERS光譜[32]

3 數(shù)據(jù)分析方法

拉曼信號(hào)由細(xì)菌的多種成分產(chǎn)生， 且光譜維度高、 光譜復(fù)雜[35]； 不同種類細(xì)菌的基本成分非常相似， 導(dǎo)致相似的SERS信號(hào)。 因此， 需要高效的數(shù)據(jù)分析方法來(lái)處理致病菌的拉曼光譜。 經(jīng)典的數(shù)據(jù)分析方法為多變量統(tǒng)計(jì)分析如： 主成分分析、 聚類分析、 判別分析等。 機(jī)器學(xué)習(xí)方法有支持向量機(jī)、 深度學(xué)習(xí)等等。 在這些方法中， 深度學(xué)習(xí)技術(shù)表現(xiàn)出了優(yōu)于傳統(tǒng)方法的光譜分類和識(shí)別能力。

3.1 多變量統(tǒng)計(jì)分析方法

多變量統(tǒng)計(jì)分析方法是一種傳統(tǒng)的分析高維數(shù)據(jù)的方法， 一般通過(guò)特定的算法提取原始數(shù)據(jù)中的有效信息降低數(shù)據(jù)維度， 從而有利于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。 主成分分析(principal component analysis, PCA)是最常用的多變量分析方法。 主成分分析通過(guò)正交變換將原始變量轉(zhuǎn)換成一系列不相關(guān)的變量， 轉(zhuǎn)換后的一系列變量稱為主成分。 由于少量頭部主成分包含了絕大部分原始數(shù)據(jù)的有效信息， 一般在分析時(shí)只截取前幾個(gè)主成分， 從而降低數(shù)據(jù)維度。 Hadjigorgiou等[36]使用SERS對(duì)肺炎克雷伯氏菌、 變形桿菌和大腸桿菌進(jìn)行AST， 使用PCA結(jié)合線性判別分析和留一交叉驗(yàn)證區(qū)分耐藥菌、 中間菌和敏感菌， 分類正確率達(dá)94%。 Premasiri等[37]用SERS研究了兩株細(xì)菌， 通過(guò)偏最小二乘判別分析區(qū)分耐藥菌和敏感菌。 判別的敏感性>95%， 特異性>99%。 Ayala等[38]利用SERS結(jié)合PCA和判別分析用于區(qū)分不同的種類的致病菌。 Lin等[39]建立了一種基于SERS和層次聚類分析的大腸桿菌、 鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌耐藥性快速檢測(cè)方法。 對(duì)123株臨床分離菌(42株大腸桿菌、 41株鮑曼不動(dòng)桿菌和40株銅綠假單胞菌)進(jìn)行了檢測(cè)。 與微量肉湯稀釋法相比， 檢測(cè)靈敏度和特異性分別為90.9%和91.1%。 篩查易于進(jìn)行， 可在1.5 h內(nèi)完成。

3.2 機(jī)器學(xué)習(xí)數(shù)據(jù)分析方法

機(jī)器學(xué)習(xí)通過(guò)大規(guī)模的學(xué)習(xí)訓(xùn)練數(shù)據(jù)集， 從而提取數(shù)據(jù)的有效特征， 建立預(yù)測(cè)模型實(shí)現(xiàn)高靈敏度判別分析。 傳統(tǒng)的機(jī)器學(xué)習(xí)方法有支持向量機(jī)、 決策樹(shù)、 K近鄰分類算法等。 Cheong等[15]采用多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法PCA和支持向量機(jī)來(lái)快速鑒定喹諾酮類耐藥肺炎克雷伯菌(ATCC70063， ST11和ST15)。 該方法具有高重現(xiàn)性(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.4%)和靈敏的檢測(cè)限(100 pmol·L-1， R6G)， 相關(guān)系數(shù)為0.98。 Walter等[40]比較了支持向量機(jī)和線性判別分析區(qū)分兩種不同激發(fā)波長(zhǎng)(532和244 nm)的致病菌SERS光譜的能力。 分別實(shí)現(xiàn)了大約92%和90%的識(shí)別率。 Ciloglu等[41]使用SERS結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)快速鑒定耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和嗜肺軍團(tuán)菌。 K近鄰分析方法在支持向量機(jī)、 決策樹(shù)和樸素貝葉斯等傳統(tǒng)分類器中具有97.8%的分類準(zhǔn)確率。 SERS和機(jī)器學(xué)習(xí)為抗生素耐藥菌的鑒別提供了一個(gè)可靠的工具。

深度學(xué)習(xí)是最先進(jìn)的機(jī)器學(xué)習(xí)算法， 它從大規(guī)模的原始數(shù)據(jù)集中學(xué)習(xí)特征并直接構(gòu)建預(yù)測(cè)模型。 深度學(xué)習(xí)算法有很多， 包括卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)， 完全連接的網(wǎng)絡(luò)， 殘差神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等。 其在挖掘數(shù)據(jù)的局部特征和提取全局訓(xùn)練特征方面具有良好的性能[42]， 數(shù)據(jù)分類識(shí)別的能力遠(yuǎn)超傳統(tǒng)多變量統(tǒng)計(jì)分析算法[43]。 Ho等[44]通過(guò)訓(xùn)練一個(gè)卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)準(zhǔn)確識(shí)別30種常見(jiàn)的細(xì)菌病原體, 即使在低信噪比譜上， 也能達(dá)到超過(guò)82%的準(zhǔn)確率并且抗生素治療識(shí)別準(zhǔn)確率高達(dá)97.0%±0.3%。 對(duì)50名患者的臨床分離株進(jìn)行了驗(yàn)證， 僅使用來(lái)自每個(gè)患者分離物的10個(gè)細(xì)菌譜， 實(shí)現(xiàn)了99.7%的抗生素治療識(shí)別準(zhǔn)確率。 Thrift等[45]利用卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)聯(lián)合SERS技術(shù)在抗生素暴露后10 min內(nèi)將大腸桿菌和銅綠假單胞菌對(duì)抗生素的反應(yīng)與未處理的細(xì)菌分離， 準(zhǔn)確率大于99%。 這種無(wú)需對(duì)細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)的方法顯著提高了分類精度， 可在30 min內(nèi)選擇有效的抗生素治療， 這極大地減少了用常規(guī)生長(zhǎng)試驗(yàn)驗(yàn)證表型AST所需的時(shí)間。

4 總結(jié)和展望

表面增強(qiáng)拉曼光譜是一種分子檢測(cè)技術(shù)， 它能夠無(wú)損害、 快速、 高靈敏度地提供致病菌與藥物相互作用的信息[46]。 通過(guò)人們的不斷努力, 基于SERS的致病菌及其耐藥性檢測(cè)的準(zhǔn)確性已大幅提高， 檢測(cè)時(shí)間也縮短為兩小時(shí)以內(nèi)， 但是要實(shí)現(xiàn)該方法在臨床上的全面應(yīng)用尚有許多工作需要完善。 首先, SERS基底的重復(fù)性有待提高。 其次， 需要探索操作簡(jiǎn)單、 特異性高的致病菌捕獲方式。 希望未來(lái)的研究能提高SERS檢測(cè)致病菌的易用性， 縮短從樣本收集到檢出結(jié)果的周轉(zhuǎn)時(shí)間， 構(gòu)建一個(gè)高靈敏低成本的測(cè)試平臺(tái)， 并建立和完善細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)SERS圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)。 使 SERS細(xì)菌鑒別技術(shù)走出實(shí)驗(yàn)室， 有效應(yīng)對(duì)并緩解臨床細(xì)菌耐藥。