姚 寧， 周 霖， 王肖輝， 楊紅梅

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院a.腫瘤內(nèi)科；b.藥學(xué)部；c.超聲科，鄭州450052)

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的特征是肝臟脂肪變性，無(wú)飲酒史。有研究[1]表明，肥胖可顯著增加NAFLD的發(fā)病率。隨著當(dāng)今生活節(jié)奏的加快和飲食習(xí)慣的改變，肥胖等慢性病患者數(shù)量劇增，引起了全球公共衛(wèi)生工作者對(duì)現(xiàn)今社會(huì)健康問(wèn)題的關(guān)注[2]。此外，NAFLD和肥胖是許多代謝性疾病的重要誘因，如2型糖尿病、心血管疾病、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化和癌癥。因此，尋找高效安全的預(yù)防和治療方法已成為當(dāng)前NAFLD的重要研究熱點(diǎn)[3-4]。

核因子相關(guān)因子(Nrf)是一種與機(jī)體防御功能密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄蛋白，其機(jī)制與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[5]，屬于亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族。Nrf在組織細(xì)胞的氧化應(yīng)激防御過(guò)程中起重要的調(diào)節(jié)作用，主要參與組織細(xì)胞的氧化應(yīng)激防御過(guò)程。Nrf上調(diào)可以保護(hù)組織和器官免受有害因素的影響，對(duì)肝臟有多種作用，主要是調(diào)節(jié)肝臟代謝、協(xié)助肝臟解毒及促進(jìn)肝細(xì)胞再生。因此，在急慢性肝損傷、脂肪肝、肝纖維化、肝癌等方面均有保護(hù)作用[6-7]。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是真核細(xì)胞特有的一種具有良好保守性的核蛋白。有研究[8]表明，HMGB1與全身和局部炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，與炎癥的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。

白果內(nèi)酯(bilobalide,BA)是銀杏葉提取物中唯一的倍半萜類化合物。銀杏葉提取物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元具有良好保護(hù)作用。而作為銀杏葉提取物的重要成分之一，BA對(duì)心絞痛、心肌梗死、冠心病、高血壓、心律失常等心腦血管性疾病有良好療效，尤其對(duì)腦部疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。BA如何作用于NAFLD的報(bào)道較少，故本研究探討B(tài)A對(duì)高脂飲食(high-fat diet，HFD)誘導(dǎo)小鼠NAFLD的作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 BA(純度≥96%)(寶雞市辰光生物科技有限公司，批號(hào):WTLS-010)。甘油三酯(TG)(批號(hào)：20180324)、總膽固醇(TC)(批號(hào)：20180412)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)(批號(hào)：20180403)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)(批號(hào)：20180403)、超氧化物歧化酶(SOD)(批號(hào)：20180415)、丙二醛(MDA)(批號(hào)：20180420)、過(guò)氧化物酶(CAT)(批號(hào)：20180420)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)(批號(hào)：EK0526)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)(批號(hào)：SP12225)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)(批號(hào)：EK0412)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；BCA蛋白定量試劑盒(批號(hào)：P0009)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。所有抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology, Inc。

1.1.2 動(dòng)物 ICR小鼠60只，雄性，2月齡，體質(zhì)量20～22 g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(魯)20190003，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：370726210101048423，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照鄭州大學(xué)動(dòng)物倫理學(xué)指南操作進(jìn)行，倫理批準(zhǔn)號(hào)：202102151663。

1.2 方法

1.2.1 造模與分組 60只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，正常組15只，HFD組45只。正常組采用正常飲食，HFD組給予HFD。飼養(yǎng)4周后，將HFD組分作為模型組、BA(20 mg·kg-1)組和BA(40 mg·kg-1)組[9],各15只。接下來(lái)的4周，繼續(xù)給予HFD，BA組小鼠分別給予BA(20、40 mg·kg-1)灌胃，正常組和模型組給予等體積的生理鹽水。

1.2.2 肝功能指標(biāo)的檢測(cè) 血清中ALT和AST的水平根據(jù)試劑盒說(shuō)明書采用全自動(dòng)生化分析儀(日本日立，7600型)測(cè)定。

1.2.3 檢測(cè)血清及肝臟血脂水平 將收集的血液靜置45 min后，3 000g離心15 min獲取血清。采用生理鹽水(1 g：9 mL)制備肝組織勻漿，4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min，收集上清液后備用。根據(jù)試劑盒說(shuō)明測(cè)定血清和肝臟中TC和TG水平。

1.2.4 血清和肝臟中氧化指標(biāo)的檢測(cè) 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，測(cè)定血清和肝臟SOD、CAT和MDA指標(biāo)水平。

1.2.5 血清和肝臟中細(xì)胞因子水平的檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)小鼠血清和肝臟細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)水平。

1.2.6 肝臟的組織病理學(xué)分析 制備小鼠肝臟病理切片，隨機(jī)取3只小鼠肝臟的相同部分，立即用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液固定。標(biāo)本包埋在石蠟中，切片用蘇木精-伊紅(HE)染色，最后用甘油固定。將制備的切片在100倍光學(xué)顯微鏡下拍照，并觀察染色及評(píng)估肝臟病理變化。

1.2.7 蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測(cè)肝臟Nrf-2/血紅素加氧酶1(HO-1)/HMGB1/核因子κB(NF-κB)信號(hào)通路蛋白 提取肝組織細(xì)胞的總蛋白，并進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)。變性、裝載、電泳，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉封閉，加入相應(yīng)的抗體及質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%脫脂奶粉。稀釋為一級(jí)和二級(jí)抗體，然后通過(guò)增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)高級(jí)試劑盒進(jìn)行觀察，并通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 BA對(duì)NAFLD小鼠肝功能酶的影響 與正常組比較，模型組血清AST和ALT水平較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，BA(20 mg·kg-1)組和BA(40 mg·kg-1)組AST和ALT水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1，圖1。

表1 各組小鼠ALT、AST檢測(cè)指標(biāo)比較

注：##)與正常組比較， P<0.01；**)與模型組比較，P<0.01。

2.2 BA對(duì)血脂水平的影響 與正常組比較，模型組血清和肝臟TC、TG水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，BA(20 mg·kg-1)組和BA(40 mg·kg-1)組血清和肝臟的TC、TG水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖2，表2。

注：##)與正常組比較，P<0.01；**)與模型組比較，P<0.01。

表2 各組小鼠血清和肝臟TG、TC指標(biāo)比較

2.3 BA對(duì)血清和肝臟氧化應(yīng)激水平的影響 與正常組比較，模型組MDA水平升高，抗氧化酶(SOD與CAT)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，BA(20 mg·kg-1)組和BA(40 mg·kg-1)組MDA水平降低，SOD與CAT水平增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表3-4，圖3。

表3 各組小鼠血清SOD、MDA、CAT指標(biāo)比較

表4 各組小鼠肝臟組織SOD、MDA、CAT指標(biāo)比較

注：與正常組比較，##)P<0.01；與模型組比較，**)P<0.01。

2.4 BA對(duì)血清和肝臟細(xì)胞因子的影響 與正常組比較，模型組IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，BA(20 mg·kg-1)組和BA(40 mg·kg-1)組IL-1β、IL-6和TNF-α水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5-6,圖4。

表5 各組小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α指標(biāo)比較

表6 各組小鼠肝臟組織IL-6、IL-1β、TNF-α指標(biāo)比較

注：##)與正常組比較，P<0.01；**)與模型組比較，P<0.01。

2.5 組織病理學(xué)變化 與正常組肝臟比較，模型組出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)中脂滴的積聚和肝組織中炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，BA(20 mg·kg-1)組和BA(40 mg·kg-1)組逆轉(zhuǎn)上述病理變化過(guò)程。見(jiàn)圖5。

圖5 組織病理學(xué)變化(×100)

2.6 BA對(duì)肝臟Nrf-2/HO-1/HMGB1/NF-κB通路的影響 與正常組比較，模型組肝臟中Nrf-2和HO-1水平降低，HMGB1、p-P65(phosphorylation nuclear factor kappa beta, p-P65)和p-IkBa(phosphorylation inhibitory subunit of nf kappa b alpha, p-IkBa )水平升高。與模型組比較，BA提高了小鼠肝臟中Nrf-2和HO-1的水平，降低了小鼠肝臟中HMGB1、p-P65和p-IkBa的水平。見(jiàn)圖6。

圖6 BA對(duì)肝臟Nrf-2/HO-1/HMGB1/NF-κB通路的影響

3 討論

流行病學(xué)研究[10-11]表明，NAFLD是最常見(jiàn)的慢性肝病。隨著物質(zhì)生活水平的提高，我國(guó)肥胖患者的數(shù)量迅速增加，由肥胖引起的NAFLD的發(fā)病率呈快速上升趨勢(shì)。血脂異常(包括TC和TG)是肥胖患者常見(jiàn)的代謝癥狀之一[12-13]。血脂水平可以反映全身脂質(zhì)代謝，如今，HFD的流行增加了飲食中脂肪的攝入，增加了體內(nèi)游離脂肪酸的含量，并增加了TG的積累。一旦超過(guò)肝臟儲(chǔ)存極限，就會(huì)產(chǎn)生有毒的脂質(zhì)代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致肝損傷或肝功能障礙[14-15]。因此，本研究以血清和肝臟中的TC、TG為指標(biāo)，觀察NAFLD中脂肪蓄積和肝損傷的程度。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠的TC、TG升高；BA組小鼠的TC、TG含量降低。表明NAFLD模型成功建立，且BA可以改善HFD引起的小鼠血脂異常狀態(tài)。

在HFD誘導(dǎo)肥胖小鼠的過(guò)程中，隨著肝臟不斷積累TG和游離脂肪酸，從而產(chǎn)生了過(guò)量的活性氧。體內(nèi)自由基代謝平衡主要通過(guò)抗氧化系統(tǒng)來(lái)維持，包括SOD和CAT等[16]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化降解的主要產(chǎn)物，不僅能阻止線粒體呼吸鏈的電子傳遞，還能促進(jìn)炎癥反應(yīng)，從而抑制肝臟中抗氧化酶的活性(SOD、CAT)[17]。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，BA明顯降低MDA水平，增加SOD、CAT水平。

“攻擊性”炎癥細(xì)胞因子(如TNF-α和IL-6)的無(wú)序產(chǎn)生往往與代謝綜合征的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。NF-κB能夠調(diào)節(jié)TNF-α和IL-6等因子，其是轉(zhuǎn)錄和合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。因此，通過(guò)NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)可積極改善NAFLD[18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高；與模型組相比，BA干預(yù)組IL-1β、IL-6和TNF-α水平降低。

Nrf-2是一種重要的抗氧化蛋白，能抵抗多種因素引起的炎癥和氧化應(yīng)激，促進(jìn)多種抗氧化基因的表達(dá)，Nrf-2激活需要Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(KEAP-1)的調(diào)節(jié)[19]。在外部氧化應(yīng)激的刺激下，Nrf-2將從KEAP1中釋放并降解，從而與抗氧化相關(guān)元素(ARE)結(jié)合，包括NAD(對(duì)位)氫醌氧化還原酶(NQO1)和HO-1，最終發(fā)揮抗炎和抗氧化機(jī)制[20]。HO-1是一種參與炎癥和氧化應(yīng)激的重要蛋白質(zhì)，Nrf-2/HO-1激活NF-κB并調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)[21]。HMGB1為具有215個(gè)氨基酸的多肽鏈，由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，其首先被鑒定為一種存在于細(xì)胞核中高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，以維持核小體結(jié)構(gòu)并調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，后來(lái)被確認(rèn)為一種細(xì)胞因子，在細(xì)胞損傷時(shí)釋放或由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌。有研究[22-23]表明，HMGB1也參與脂質(zhì)代謝，阿托伐他汀可以通過(guò)降低血漿HMGB1水平來(lái)降低IL-6和TNF-α水平。眾所周知，在經(jīng)典的NF-κB信號(hào)通路中，其亞基P65(活化形式為p-P65)與抑制性因子IkBa結(jié)合并被抑制，促炎因子等在激活kappa B抑制因子激酶(IKK)復(fù)合體后，后者使IkBa磷酸化(形成p-IkBa)，進(jìn)一步誘導(dǎo)NF-κB被釋放出來(lái)，活化的NF-κB進(jìn)一步被磷酸化并轉(zhuǎn)移入核，誘導(dǎo)相關(guān)靶基因的表達(dá)[24]。本研究結(jié)果顯示，BA顯著提高了小鼠肝臟中Nrf-2和HO-1的水平，并降低了小鼠肝臟中HMGB1、p-P65和p-IkBa的水平。總之，BA通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠的脂質(zhì)水平、氧化應(yīng)激水平和炎癥水平來(lái)改善NAFLD的肝臟病理變化，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Nrf-2/HO-1/HMGB1/NF-κB通路有關(guān)。

隨著人們生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)逐漸向高脂肪、高蛋白和高糖方向轉(zhuǎn)變，從而誘發(fā)高水平的能量代謝，導(dǎo)致氧化應(yīng)激水平急劇增加。脂質(zhì)代謝異常伴有氧化應(yīng)激的發(fā)生，而氧化應(yīng)激及其產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化物能夠繼續(xù)促使線粒體功能失調(diào)，肝細(xì)胞功能受損，進(jìn)一步形成惡性循環(huán)[25]。同時(shí)，脂質(zhì)代謝紊亂還可通過(guò)影響單核細(xì)胞、M1/M2漂移、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣(含pyrin結(jié)構(gòu)域)受體蛋白3炎癥小體等誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。而炎癥反應(yīng)還會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的攝取和蓄積，抑制細(xì)胞脂質(zhì)流出，與脂代謝紊亂共同促進(jìn)了脂肪肝的發(fā)展。NF-κB等信號(hào)通路還能夠調(diào)節(jié)炎癥與脂代謝之間的相互作用[26]。綜上，BA主要通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝中的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，從而起到治療NAFLD的作用。

此外，白果樹(shù)葉能夠促進(jìn)人體腸胃蠕動(dòng)，加快消化和吸收，從而起到預(yù)防便秘的作用；同時(shí)也可有效降低人體膽固醇含量，防止脂肪細(xì)胞在體內(nèi)的堆積，不僅可以對(duì)預(yù)防高血壓起到間接效果，而且對(duì)于減肥也具有積極的輔助效果。而BA是白果的主要活性成分，是否也可通過(guò)影響胃腸的消化吸收功能，從而對(duì)脂肪肝的形成和損傷起到一定的保護(hù)作用，這一科學(xué)假設(shè)有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。