梁嘉俊 凌 君 楚 渠 彭云武

(1.安康學(xué)院陜西省蠶桑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西安康 725000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)蠶桑絲綢研究所，陜西楊凌 712100)

桑樹褐斑病是依據(jù)染病葉片病斑形態(tài)進(jìn)行分類的一類桑樹葉部病害，又名“爛葉病”“焦斑病”，其典型癥狀是在桑葉上形成近圓形或不規(guī)則形狀的褐色壞死病斑。桑樹褐斑病分布廣泛，在我國大部分蠶區(qū)桑園均有發(fā)生[1-3]，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致桑園大面積減產(chǎn)[3]，嚴(yán)重影響桑葉品質(zhì)與產(chǎn)量。2019—2021年在安康市調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，每年8—10月份桑園褐斑病發(fā)生頻率高，病害嚴(yán)重時(shí)可使桑園減產(chǎn)50%以上，影響蠶繭生產(chǎn)和桑葉資源加工利用，導(dǎo)致桑園經(jīng)濟(jì)效益下降。本研究對(duì)安康市桑園褐斑病致病菌進(jìn)行了分離鑒定，明確導(dǎo)致褐斑病發(fā)生的主要致病菌，為建立更有效的桑褐斑病防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病樣采集及病原菌分離純化

2020年8月于安康學(xué)院陜西省安康市漢濱區(qū)恒口蠶桑試驗(yàn)基地桑園內(nèi)采集感病桑葉。按照常規(guī)組織分離法[4]分離培養(yǎng)，待菌絲長出后根據(jù)菌落特征分離純化，單一菌株再接入PDA培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，并移入PDA斜面培養(yǎng)基4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病菌形態(tài)及顯微觀察

將菌株接于PDA平板于25℃黑暗培養(yǎng)一周后，觀察并記錄菌落特征；光學(xué)顯微鏡觀察并記錄菌絲結(jié)構(gòu)、分支和隔膜的有無等顯微形態(tài)特征，根據(jù)真菌分類系統(tǒng)初步進(jìn)行種類鑒定[5]。

1.3 菌株基因組DNA提取及ITS序列PCR擴(kuò)增

按照劉麗[6]的方法提取待測菌株DNA。采用真菌rDNA-ITS基因通用引物EF-1H(5'-ATGGGTAAGGAAGACAAGAC-3')和EF-2T(5'-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3')[7]。PCR擴(kuò)增體系：2×Taq PCR MaterMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL(對(duì)照加1 μL 雙蒸水)，最后用雙蒸水補(bǔ)足至25 μL。ITS基因PCR擴(kuò)增程序: 94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測以后，委托西安擎科澤西生物科技有限公司進(jìn)行序列測定。

1.4 病原菌EF-1α序列分析

測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST分析，然后使用MEGA7.0[8]軟件進(jìn)行序列間對(duì)比分析，構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，分析各菌株間同源性。

1.5 菌株致病性試驗(yàn)

接種對(duì)象選用在溫室培養(yǎng)桑特優(yōu)2號(hào)桑苗的葉片，接種前，先用自來水沖葉片表面，然后用0.5%的吐溫-20完全浸泡葉片5～10 s至葉片表面無氣泡。接種方法采用菌餅法接種(菌餅直徑約3 mm)，并分別設(shè)空白對(duì)照。

先在9.5 cm規(guī)格培養(yǎng)皿中放入兩層濾紙，吐溫-20處理后用脫脂棉包裹葉柄保濕，選取桑苗上長勢良好無創(chuàng)傷的葉片為一個(gè)接種處理，每個(gè)培養(yǎng)皿中放入1—2片桑葉。用打孔器分別取若干3 mm菌餅，每個(gè)葉片上放3個(gè)菌餅，重復(fù)數(shù)為5，加入無菌水覆蓋培養(yǎng)皿底部。同時(shí)設(shè)空白無菌餅為對(duì)照，接種兩天后從葉片上取走菌餅，防止葉片細(xì)胞呼吸受阻死亡而使葉片變黃影響觀察，每天觀察葉片發(fā)病情況并拍照統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉褐斑病癥狀

桑葉上出現(xiàn)近圓形或形狀不規(guī)則的褐色壞死病斑，病斑邊緣葉面枯黃褪綠，死亡組織呈褐色，干枯皺縮(圖1)。

圖1 桑樹褐斑病發(fā)病癥狀

2.2 病原菌菌落及顯微照片

該病原菌生長迅速，在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)4 d可長滿整個(gè)培養(yǎng)皿，菌落成灰白色平鋪于培養(yǎng)基上(圖2A)，背面呈淡黃色(圖2B)，氣生菌絲呈絨毛狀，稠密(圖2A)。顯微形態(tài)：大型分生孢子呈鐮刀型，3～5隔，大小為(20.72～25.59μm)×(4.63～5.22μm)；小型分生孢子數(shù)量多，卵圓形，大小為(14.89～18.47μm)×(3.25～4.37μm)(圖2C)。

A-菌落正面 B-菌落背正面 C-病原菌顯微結(jié)構(gòu)

2.3 分子生物學(xué)鑒定

將所提取出的病原菌DNA作為模板，用真菌ITS通用引物ITS1/ITS4做PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)5 μL點(diǎn)樣電泳后進(jìn)行EB染色，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下拍照如圖，條帶單一較亮，且無非特異性擴(kuò)增條帶，分布在500～750 bp之間。

測序結(jié)果分析表明其序列總長度為678 bp，G+C含量為50.74% ，病原菌序列與 GenBank 及中已有的序列進(jìn)行核酸 BLAST 比對(duì)分析，選取與Genebank中已有序列同源性較高的菌種信息，用于系統(tǒng)發(fā)育分析。

用 Mega7.0 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，采用 K2 模型，用鄰接法(Neighbor-joining Method)構(gòu)建rDNA-ITS 序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。

分析rDNA-EF-1α序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分支上側(cè)數(shù)字為大于50%的Bootstrap檢驗(yàn)值(1 000次重復(fù))，結(jié)果表明：在遺傳距離為0.02，Bootstrap為1 000次檢驗(yàn)時(shí)，病原菌rDNA-EF-1α序列seq與F.fujikuroi(登錄號(hào)：MN958238.1)且置信度為100，說明本試驗(yàn)研究的桑樹褐斑病病原菌為藤倉鐮刀菌F.fujikuroi。

圖3 基于EF-1α基因序列的進(jìn)化樹

2.4 致病性測定

接種7 d后開始出現(xiàn)明顯癥狀(圖4-A)，接種葉片上具有不規(guī)則的褐色病斑，斑點(diǎn)周圍有少許退綠現(xiàn)象。發(fā)病癥狀與田間發(fā)病癥狀相似，而對(duì)照組沒有出現(xiàn)任何發(fā)病現(xiàn)象(圖4-B)。

A-接種7d后癥狀 B-對(duì)照組

接種菌株后發(fā)病桑葉組織經(jīng)分離、純化獲得的菌株與原接種物的菌落特征及分生孢子形態(tài)完全一致，將再分離菌株進(jìn)行分子鑒定，和待測菌株為相同菌株，證明原接種菌株為桑樹褐斑病的致病菌。

3 討 論

2015年，中國工程院院士向仲懷教授提出 “立桑為業(yè)、多元發(fā)展”的桑產(chǎn)業(yè)發(fā)展理念[9]，旨在拓展桑樹資源多功能利用，促進(jìn)蠶桑產(chǎn)業(yè)由以蠶絲為主的單一產(chǎn)業(yè)向蠶桑并重的多元化產(chǎn)業(yè)發(fā)展，拓展桑樹藥食用途、飼料用途和文化生態(tài)用途等新功能。但是，桑園葉部病害對(duì)于收獲高品質(zhì)桑葉產(chǎn)生了極大的損害。在2019—2021年對(duì)安康市各縣區(qū)桑園病害調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，桑園內(nèi)病害復(fù)雜，常見有褐斑病、輪紋病、葉枯病等真菌性病害和青枯病等細(xì)菌性病害以及萎縮病等病毒性病害。其中，在每年8—10月份，各縣區(qū)桑園均以褐斑病和輪紋病為主，這與云南大理州桑褐斑病發(fā)病時(shí)期相似[3]，可能是因?yàn)檫M(jìn)入雨水增多時(shí)期，桑園內(nèi)濕度增加，加劇褐斑病病原菌的傳播侵染。

本研究中，通過對(duì)染病桑葉進(jìn)行病原菌分離純化，結(jié)合常規(guī)菌物鑒定和分子鑒定方法，根據(jù)科赫氏法則重新接種鑒定，認(rèn)為藤倉鐮刀菌F.fujikuroi是安康地區(qū)桑樹褐斑病的主要致病菌，而據(jù)文獻(xiàn)[10-11]報(bào)道，云南蠶區(qū)桑樹褐斑病主要是由桑粘隔孢(Septogloeum mori Briosi et Cavara)和殼豐孢屬(Phloeospora sp.)病原菌引起，這與本研究的結(jié)果有所不同。褐斑病是通過病斑特點(diǎn)加以命名的一類病害，多種致病菌均可導(dǎo)致褐斑病的發(fā)生[12,13]。在安康地區(qū)桑樹褐斑病致病菌調(diào)查過程中，分離到多種鐮刀菌屬真菌，發(fā)現(xiàn)部分鐮刀菌屬菌株或具有致病性。因此，筆者認(rèn)為，安康地區(qū)桑樹褐斑病可能是由多種鐮刀菌共同侵染所致，這與已有研究結(jié)果有所差別，可能和地理環(huán)境及氣候因素等有關(guān)，具體原因仍有待進(jìn)一步研究。