徐 榮，許木果，姜士寬，楊 焱，付鎵榕，巖 利

（云南省熱帶作物科學(xué)研究所，云南景洪 666100）

諾麗（MorindacitrigoliaL.）為茜草科巴戟天屬熱帶常綠多年生小喬木或闊葉灌木，多生長(zhǎng)于赤道附近，以南太平洋各島國(guó)為主［1-3］。近年來(lái)，我國(guó)海南、云南的熱區(qū)陸續(xù)開(kāi)展了諾麗引種栽培、良種選育等相關(guān)研究工作，獨(dú)特的熱帶氣候條件使得諾麗產(chǎn)業(yè)有望成為當(dāng)?shù)貎?yōu)勢(shì)資源型新產(chǎn)業(yè)。諾麗果含有豐富的活性物質(zhì)，如維生素、氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖、多酚類、蒽醌類、糖苷類和黃酮類化合物等［4］，其中又以多酚類、蒽醌類和黃酮類等化合物在諾麗果的生物活性方面起著關(guān)鍵作用，尤其是不同品種之間含量差異顯著［5-6］。近年來(lái)，相關(guān)研究［7-10］對(duì)諾麗果的化學(xué)成分進(jìn)行了分析測(cè)定，分離出大量的有效成分；對(duì)諾麗果及提取物的藥用價(jià)值及保健功能也有很多研究，如抗氧化性、抑菌活性、降糖作用、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛及心肌保護(hù)作用等［11-18］。綜合以上研究結(jié)果，諾麗果實(shí)含有較豐富的功能性成分，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功效，目前對(duì)諾麗的研究主要集中在不同品種間的含量差異及其藥用機(jī)理、化學(xué)成分的分離鑒定上，對(duì)不同成熟度諾麗果中活性成分的含量差異及對(duì)比研究相關(guān)報(bào)道較少。

諾麗果是典型的呼吸躍變型果實(shí)，鮮果在采摘后不易保存，急需處理，且果實(shí)中種子含量多，氣味不易被接受，難以鮮食。因此，深加工是發(fā)展諾麗特色優(yōu)勢(shì)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的一個(gè)重要方向，而如何根據(jù)深加工的需要確定合理的采收時(shí)間，提高諾麗果實(shí)中有效成分的利用率及商品價(jià)值，需進(jìn)行深入研究。為此，本試驗(yàn)對(duì)不同成熟度諾麗果中的8種主要活性成分進(jìn)行測(cè)定和對(duì)比分析，以期為諾麗果的加工利用提供一定理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

諾麗鮮果采摘于云南省熱帶作物科學(xué)研究所科研試驗(yàn)基地。11月初隨機(jī)選擇基地中長(zhǎng)勢(shì)基本一致的諾麗植株，取3種成熟度的鮮果，分別為青果（第一成熟度）、白果（第二成熟度）、熟果（第三成熟度），成熟度以果皮顏色、果肉色澤及果實(shí)軟硬來(lái)區(qū)分。青果為青熟期果皮完好、呈青綠色硬果實(shí)，白果為白熟期果皮呈白色硬果實(shí)，熟果為完熟期果皮呈灰白色軟果實(shí)。采收后的果實(shí)經(jīng)清洗晾干，切片放置干燥箱中45℃烘干至恒重，粉碎后過(guò)100目篩，備用。

試劑：無(wú)水乙醇、苯酚、濃硫酸、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、高氯酸、冰乙酸、氫氧化鈉、濃鹽酸、香草醛、氯仿等均為分析純（購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；D101大孔吸附樹(shù)脂（購(gòu)于成都市科龍化工試劑廠）；1,8-二羥基蒽醌標(biāo)準(zhǔn)品（購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所）。

儀器：BGZ-240型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；ME204E電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；LD5-2B低速離心機(jī)（北京雷勃爾離心機(jī)有限公司）；UV-1100紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)有限公司）；HHS電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；KQ-100DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；Ultimate 3000高效液相色譜儀（美國(guó)塞默飛）。

1.2 方法

1.2.1 多糖含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)［19］的方法進(jìn)行測(cè)定。稱取諾麗果粉5.00 g于250 mL錐形瓶中，加入40 mL蒸餾水，攪拌溶解。沸水浴加熱30 min，冷卻后用蒸餾水定容至100 mL容量瓶中，準(zhǔn)確移取5 mL樣液于50 mL離心管中，加入20 mL無(wú)水乙醇，搖勻，4℃靜置過(guò)夜，取出以4 000 r/min離心5 min，傾去上清液。沉淀加入10 mL無(wú)水乙醇再次離心，重復(fù)3次。沉淀加蒸餾水溶解定容至50 mL。取2 mL，加入6%苯酚溶液1 mL，再加入12 mL濃硫酸。搖勻后放入80℃水浴加熱4 min，取出冷卻至室溫。于波長(zhǎng)485 nm處測(cè)定吸光度。以葡萄糖使用量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為y=0.348x-0.004（R2=0.9949），其中x為0.1 mg/mL葡萄糖溶液體積，y為吸光度值。

1.2.2 總酚含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取諾麗果粉6.000 g于250 mL三角錐瓶中，加入60 mL沸水浸提10 min，每隔3 min搖晃1次，減壓過(guò)濾，用少量沸蒸餾水洗滌濾渣數(shù)次，待冷卻后濾液定容至250 mL容量瓶中，搖勻，再準(zhǔn)確吸取1mL置于25 mL比色管中，加入4 mL蒸餾水和5 mL酒石酸亞鐵溶液，混勻，用磷酸緩沖液（pH7.5）定容至刻度。靜置10～15 min，用10 mm的比色皿，在波長(zhǎng)540 nm處，以試劑空白液為參照，測(cè)定吸光值?？偡拥暮恳愿蓱B(tài)質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示，按下式計(jì)算：

式中：A為試樣的吸光值；A0為空白液吸光值；L1為試液總量（mL）；L2為測(cè)定用液量（mL）；M為試樣的質(zhì)量（g）；m為試樣干物質(zhì)含量（%）；1.957是用10 mm比色杯，當(dāng)吸光值等于0.50時(shí)，相當(dāng)于每毫升樣液中含多酚1.957 mg。

1.2.3 總黃酮含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取諾麗果粉2.000 g置于錐形瓶中，加入40 mL的70%乙醇，在超聲溫度60℃、超聲頻率100 W下提取30 min，過(guò)濾，濾渣再重復(fù)操作2次，合并濾液。取濾液3 mL于25 mL比色管中，加70%乙醇溶液至5 mL，之后加入1 mL 5%（w/v）NaNO2溶液，搖勻，放置6 min后再加1 mL 10%（w/v）Al（NO3）3溶液，搖勻，再放置6 min后加10 mL 1.0 mol/L NaOH溶液，最后加70%乙醇溶液至25 mL，搖勻，放置15 min，平行操作2次。在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為y=12.921x-0.0005（R2=0.9992），其中y為吸光度，x為蘆丁質(zhì)量濃度mg/mL。

1.2.4 皂苷含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取1.000 g諾麗果粉，置于100 mL三角瓶中，加入30 mL85%乙醇，在超聲溫度60℃、超聲頻率100 W下提取30 min，冷卻，定容至50 mL，搖勻，放置。吸取上清液1 mL于60℃揮干后，以1 mL去離子水溶解殘?jiān)?，進(jìn)行柱層析。用10 mL注射器作層析管，內(nèi)裝3 cm預(yù)處理完成的D101大孔吸附樹(shù)脂，用去離子水洗至無(wú)醇味，上加1 cm中性氧化鋁。先用25 mL 70%乙醇溶液洗柱，棄去洗脫液，再用25 mL水洗柱，棄去洗脫液，加入1 mL諾麗樣液，先用25 mL水洗柱，控制流速1.5～2 mL/min，棄去洗脫液，再用25 mL 70%乙醇洗脫，控制流速1.5～2 mL/min，收集洗脫液于蒸發(fā)皿中，置于60℃水浴揮干。在已揮干的蒸發(fā)皿中準(zhǔn)確加入0.2 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和0.8 mL高氯酸，混勻后轉(zhuǎn)入10 mL帶塞比色管中，置60℃水浴上加熱10 min，取出放置于流水中冷卻后，準(zhǔn)確加入冰乙酸5 mL，搖勻，放置20 min后，以1 cm比色皿于560 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。以人參皂苷含量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為y=3.308x-0.006（R2=0.9990），其中y為吸光度，x為人參皂苷含量μg/mL。

1.2.5 總蒽醌含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取諾麗果粉1.00 g，置于150 mL三角瓶中，準(zhǔn)確加入2.5 mol/L硫酸溶液30.0 mL，在90℃水浴條件下回流水解2 h，放冷，過(guò)濾，酸液用氯仿萃取至無(wú)色。合并氯仿液，蒸干，殘?jiān)眉状既芙庥?0 mL容量瓶中并定容，再?gòu)娜萘科恐袦?zhǔn)確移取樣液1 mL用0.5%醋酸鎂甲醇溶液定容于10 mL比色管中，以0.5%醋酸鎂甲醇溶液為空白，于510 nm測(cè)定吸光度。以1,8-二羥基蒽醌濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為y=0.0412x+0.0052（R2=0.992），其中y為吸光度，x為蒽醌濃度μg/mL。

1.2.6 莨菪亭含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取諾麗果粉2.000 g，用60 mL甲醇于70℃回流提取1.5 h，合并提取液經(jīng)減壓至干后再用氯仿30 mL在超聲溫度60℃、超聲頻率100 W下提取2次，每次20 min，合并提取液經(jīng)減壓至干后用甲醇溶解至10 mL量瓶中，定容，經(jīng)孔徑為0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾后備用。以莨菪亭濃度為橫坐標(biāo)x，峰面積為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為y=87725x+23464（R2=0.995），其中y為吸光度，x為莨菪亭濃度mg/L。色譜條件：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈-1%冰醋酸水溶液（20∶80）；流速為1.00 mL/min；柱溫為25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為341 nm；進(jìn)樣量：20μL。

1.2.7 桃葉珊瑚苷含量測(cè)定準(zhǔn)確稱取諾麗果粉1.000 g于150 mL具塞錐形瓶中，加入60%甲醇50 mL，常溫下超聲60 min，超聲功率70 W，超聲頻率40 kHz，過(guò)濾，于50 mL容量瓶定容。取2mL于10 mL比色管定容，經(jīng)孔徑為0.45μm的微孔薄膜過(guò)濾器過(guò)濾，備用。以桃葉珊瑚苷濃度為橫坐標(biāo)x，峰面積為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為y=1×107x+17805（R2=0.995），其中y為吸光度，x為桃葉珊瑚苷濃度mg/mL。色譜條件：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（10∶90）；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為24℃；進(jìn)樣量：20μL。

1.2.8 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法（GB 5009.5-2010）中凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 20.0和Microsoft Excel 2016進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同成熟度諾麗果中主要活性成分的測(cè)定結(jié)果

諾麗果主要活性成分的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1和圖1。由表1和圖1可知，多糖、總酚、總黃酮、總皂苷、莨菪亭、桃葉珊瑚苷、蛋白質(zhì)含量均是白果最高，而總蒽醌含量以青果最高。多糖、總黃酮、莨菪亭、桃葉珊瑚苷、蛋白質(zhì)含量在青果中最低，總酚、總皂苷含量以熟果最低，總蒽醌含量以白果最低。各成分在不同成熟度諾麗果中含量差異較顯著，其中總酚、總黃酮、總皂苷最低含量?jī)H為最高含量的1/2左右，而莨菪亭、桃葉珊瑚苷最低含量不到最高含量的1/3，表明果實(shí)成熟度的選擇可能會(huì)對(duì)后續(xù)加工所得產(chǎn)品的質(zhì)量和有效性產(chǎn)生影響。

表1 諾麗果主要活性成分含量測(cè)定結(jié)果 g/kg

圖1 不同成熟度諾麗果中活性成分含量

2.2 諾麗果成熟度與主要活性成分含量的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表2，由表2可知，總黃酮和莨菪亭的含量與諾麗果實(shí)成熟度呈顯著及以上正相關(guān)，與其他成分無(wú)顯著相關(guān)性。進(jìn)一步對(duì)諾麗果活性成分含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，多糖與總黃酮、莨菪亭、桃葉珊瑚苷、蛋白質(zhì)含量呈極顯著正相關(guān)；總酚與總皂苷、蛋白質(zhì)含量呈極顯著正相關(guān)；總黃酮與莨菪亭、桃葉珊瑚苷、蛋白質(zhì)呈極顯著正相關(guān)；其他5種活性成分也有部分間存在顯著及以上正相關(guān)。試驗(yàn)結(jié)果表明各活性成分之間具有一定的線性關(guān)系，不同活性成分間具有較強(qiáng)的相互影響及協(xié)同作用，可為諾麗果有效成分的提取利用提供一定的參考。

表2 諾麗果成熟度與主要活性成分的相關(guān)性分析

3 結(jié)論與討論

諾麗雖在國(guó)內(nèi)推廣種植多年，但由于鮮果的氣味和口感相對(duì)較差，目前僅屬小眾水果，在市場(chǎng)上還較少見(jiàn)，其果實(shí)絕大部分用來(lái)加工成果片、果粉、果汁和果酒等，經(jīng)過(guò)加工后口感大幅提升的同時(shí)，還包含多種營(yíng)養(yǎng)成分，兼具藥用價(jià)值和保健功效，逐漸受到消費(fèi)者的歡迎。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，不同成熟度諾麗果活性成分含量有較明顯的差異，可將成熟度作為判定其是否適宜的采收和加工的一項(xiàng)關(guān)鍵指標(biāo)。研究結(jié)果表明，諾麗果的總蒽醌含量為青果＞熟果＞白果，而其他成分含量均為白果的最高。相關(guān)研究表明，蒽醌類物質(zhì)具有廣泛的藥用價(jià)值和生物活性，具有抑制或殺滅真菌，防治糖尿病及骨質(zhì)疏松，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等作用［20］。因此，若需獲取諾麗果中蒽醌類成分，宜選擇青果時(shí)期的諾麗果進(jìn)行后續(xù)加工；若需獲取諾麗果中其他類型活性成分，選擇白果進(jìn)行后續(xù)加工較好。

通過(guò)測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，諾麗果蛋白質(zhì)含量最高，測(cè)定結(jié)果范圍為88.89～95.27 g/kg，這一結(jié)果接近于張偉敏等［21］的分析結(jié)果，而明顯高于李曉花等［22］的測(cè)定值。多糖、總多酚、總黃酮作為廣泛存在于諾麗果中的活性物質(zhì)，其含量相對(duì)較高，對(duì)比相關(guān)文獻(xiàn)［22-24］的提取測(cè)定結(jié)果，3種成熟度的果實(shí)多糖和總酚含量均高于文獻(xiàn)提取測(cè)定值，總黃酮測(cè)定結(jié)果總體低于文獻(xiàn)測(cè)定值。其他4種活性成分含量相對(duì)較低，相關(guān)研究報(bào)道較少，沈宋利等［25］對(duì)來(lái)自美國(guó)關(guān)島的諾麗果粉中莨菪亭的測(cè)定值為2.08 mg/g，與本試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果有明顯差異；相關(guān)研究對(duì)諾麗果渣中總皂苷［23］和諾麗果漿中莨菪亭［26］成分進(jìn)行測(cè)定，但由于屬不同類型樣本而無(wú)法對(duì)比。分析不同文獻(xiàn)測(cè)定結(jié)果差異的原因，除受諾麗果成熟度影響外，可能還與諾麗的品種、種植區(qū)域及提取工藝等因素相關(guān)，今后還需對(duì)相關(guān)影響因子作進(jìn)一步研究。